Klinisch onderzoek en het ruggenmerg verwijderen in een muismodel voor Amyotrofische Lateraal Sclerose (ALS)

Hallo, mijn naam is Lar Turner. Ik ben postdoc bij de afdeling Neurologie aan de Universiteit van Ingham, Duitsland. Hoi, mijn naam is Lin Gunda.

Ik ben een medicus in opleiding en schrijf mijn scriptie in dit laboratorium. Vandaag laten we u de klinische tests zien bij de SODG 93, een muismodel voor amyotrofische laterale sclerose. Verder demonstreren we de motorische functietest met een zogenaamde rotortest en daarnaast een andere motorische functietest met de hanging wire grip, om vervolgens een immunologische analyse uit te voeren.

Na functionele tests van de a s-muizen bestaat een noodzakelijke procedure uit het verwijderen van het ruggenmerg, de STIC-zenuw en de gastroc-spier. We willen deze chirurgische procedure in detail laten zien en aan het einde enkele voorbeeldmatige immunologische resultaten presenteren. Laten we nu eerst beginnen met de klinische tests.

Dit is een vrij bewegende wild-type MOE die geen klinische symptomen vertoont, zoals spiertremoren of parese, volgens ons klinische classificatiesysteem. Dat zou score vier zijn. Dit is een transgene ALS MOE.

In een vroeg stadium van de ziekte vertoont het dier een ernige tremor van de rechterachterpoot, wat wordt geclassificeerd als SCORE drie E. De ernstige gangafwijkingen classificeren dit dier als score twee. Het slepen van ten minste één achterpoot wordt geclassificeerd als klinische score één. Bij de Hanging wire test wordt de grove spierkracht van de ribben geëvalueerd. Elke muis wordt op een op maat gemaakte draad geplaatst en voorzichtig ondersteboven gedraaid boven de met stro bedekte bodem.

Na drie opeenvolgende trainingen van minimaal 180 seconden werd de latentietijd tot het vallen gemeten. Elke muis krijgt maximaal drie pogingen om zich maximaal 180 seconden aan het omgekeerde deksel vast te houden, waarbij de langste periode wordt genoteerd. In vergelijking met de wild-type muis aan de rechterkant is de plaque-transgene muis aan de linkerkant zeer zwak en valt deze van het deksel voordat het maximum wordt bereikt.

Het Rotor rod-apparaat wordt gebruikt om motorische coördinatie, balans en het vermogen tot motorisch leren te meten. Een goede prestatie vereist een hoge mate van sensomotorische coördinatie. Het bestaat uit een computergestuurde, motorisch aangedreven roterende spindel en vijf banen voor vijf m.

Fouten van de muizen worden automatisch gedetecteerd door druk op de onderste plastic plaat. Na drie opeenvolgende trainingssessies van ten minste 180 seconden bij een constante snelheid van 15 ronden per minuut, wordt de tijd gemeten gedurende welke een dier op de draaiende rotarod kan blijven. Elk dier ondergaat drie pogingen en de langste latentietijd zonder te vallen wordt geregistreerd.

De gezonde wildtype muis aan de linkerzijde rent zonder problemen op de rotarod. In tegenstelling hiermee heeft de transgene a s mo aan de rechterzijde ernstige problemen om überhaupt op de rotarod te blijven en glijdt na een tijdje eraf, zoals vanachter waargenomen kan worden. U ziet de ernstige loopmoeilijkheden van de linker retre muis.

In vergelijking met de gezonde wire tap-muis is deze niet in staat om de snelheid van de rotor rod bij te houden en kan deze zich niet met de HIN-ledematen omhoog duwen. Om een immunochemische analyse van het ruggenmerg uit te voeren, moeten de dieren worden opgeofferd. Het is zeer belangrijk om altijd strikt de lokale richtlijnen voor het correct uitvoeren van dierproeven te volgen.

In dit zeer vereenvoudigde overzicht van de wervelkolom en het omliggende weefsel worden de belangrijkste anatomische structuren afgebeeld. We plaatsen het dier op de ventrale zijde en beginnen met het prepareren van de spieren vanuit de dorsale zak. Nadat het spierweefsel is verwijderd, krijgen we toegang tot de wervelkolom die het ruggenmerg omsluit.

Nadat het dier is geofferd en is geperfuseerd met een paraformaldehyde-oplossing, kan het ruggenmerg worden verwijderd. Het dier wordt op een operatietafel geplaatst en de ledematen worden aan de zijkanten gefixeerd om de rugzijde van de muis bloot te leggen. Het dier wordt natgemaakt om de vacht plat te leggen en de daaropvolgende huidincisie te vergemakkelijken.

Hiervoor wordt een scherp scalpel gebruikt. Let erop dat de huid naar beide zijden wordt uitgerekt. Om het snijden te vergemakkelijken, dient de pootspier te worden geprepareerd.

Hun huid moet ook worden ingesneden. Nadat de huidincisie is voltooid, wordt deze voorzichtig opzij geschoven. Nadat de beenspieren en de nervus ischiadicus met een pincet zijn verwijderd, gaan we verder naar het ruggenmerg en plaatsen we het dier op een nieuwe operatietafel.

Nu kunnen de schedel, de nek, de spieren en de wervelkolom eenvoudig worden geïdentificeerd. Nadat al deze structuren zijn geïdentificeerd, kan er gemakkelijk worden doorgegaan naar de volgende stap. De spieren van de nek en het nu-ligament moeten worden verwijderd.

Zorg ervoor dat u niet te diep incideert en de wervelkolom niet beschadigt. In de volgende stap worden de paravertebrale spieren volledig verwijderd om de wervelkolom bloot te leggen. Om toegang te krijgen tot de wervelkolom moeten er verschillende ectomieën worden uitgevoerd.

We beginnen bij het cervicale deel van de wervelkolom, inclusief het atlanto-occipitale gewricht. Om de laminectomie uit te voeren, moeten we de wervelboog doorsnijden om alle werveluitsteeksels van het wervellichaam te kunnen verwijderen. Zoals eerder uitgelegd, begint de laminectomie met het doorsnijden van de wervelbogen.

Vervolgens kan de lamina worden weggetrokken. Let opnieuw op dat het ruggenmerg niet wordt beschadigd, aangezien er nog veel meer lamina's verwijderd moeten worden. Het is zeer nuttig om een gebogen schaar te gebruiken en meerdere wervelbogen aan beide zijden tegelijk door te knippen.

Trek vervolgens aan de dorsale uitsteeksels om de vertebrale laminae volledig te verwijderen (zie close-up). U ziet dat de schaar voorzichtig aan de meest laterale zijde van het spinale kanaal moet worden ingebracht. De overgebleven laterale delen van de wervelkolom moeten worden verwijderd om de latere volledige verwijdering van het ruggenmerg te vergemakkelijken.

Anatomische referentiepunten van het ruggenmerg zijn de zogenaamde cervicale en lumbale verdikkingen. Nadat de ectomieën van het gehele ruggenmerg zijn voltooid, dient u ervoor te zorgen dat u ook alle ventrale wortels van het ruggenmerg doorsnijdt en het ruggenmerg losmaakt van de dura mater van de meninges. Vervolgens wordt het cervicale ruggenmerg doorgesneden.

Craniaal wordt de verwijdering opnieuw gestart. Raak het ruggenmerg zeer voorzichtig aan om beschadiging van dit weefsel te voorkomen, aangezien dit ernstige beperkingen kan opleveren voor latere immunochemische analyses. De verwijdering van het ruggenmerg wordt verder voortgezet op thoracicaal niveau en doorgezet tot het lumbale gedeelte.

Het wordt nu definitief doorgesneden aan de zijkant van de cauda equina. Nu kunnen we het volledig vrijmaken. Hier ziet u het ruggenmerg geplaatst direct naast de oorspronkelijke locatie in de RAL-kolom.

Uiteindelijk wordt het geplaatst in een Paraform Hyde post-fixatieoplossing. Als klassiek voorbeeld voor immunohistochemische analyse van het ruggenmerg kunt u een antilichaam gebruiken dat choline-acetyltransferase herkent om motorneuronen in het voorhoorngebied van het ruggenmerg te identificeren. Hier ziet u een groot aantal motorneuronen in een gezond wild-type dier.

In tegenstelling hiertoe vertoont een transgeen ALS-dier in het eindstadium een veel kleiner aantal motorneuronen in het voorhoorn. Door dit video-artikel te bekijken, heeft u het basis klinisch onderzoek van het SODG 93-muismodel voor amyotrofische laterale sclerose geleerd.

Twee motorische gedragstesten zijn gedemonstreerd: de rotortest en de ophangdraadtest. Deze bieden een goede mogelijkheid om de basis motorische functie te evalueren. Ze zijn eenvoudig uit te voeren, gevoelig voor het detecteren van motorische tekorten en tijdsefficiënt.

Het hoofddeel van deze video bestaat uit een demonstratie van de preparatietechniek van het ruggenmerg. Deze kan uiteraard worden toegepast op elk ander muisziektemodel en is een essentiële stap voor de latere immunochemische analyse van de ziektepathologie in het ruggenmerg. Bedankt voor het kijken.

We hopen dat dit videoartikel nuttig zal zijn voor uw toekomstige experimenten.