Name: Endothelialized Microfluidics voor het bestuderen van microvasculaire Interacties in Hematologische ziekten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Leer endothelialized microfluidics voor het bestuderen van microvasculaire interacties in hematologische ziekten. Deze methode maakt onderzoek naar cel-celinteracties in vitro mogelijk met nauwkeurige biologische controle.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken T. Hunt, M. Rosenbluth, en het Lam Lab voor hun advies en nuttige discussies. Wij erkennen de steun van G. Spinner en het Instituut voor elektronica en nanotechnologie van het Georgia Institute of Technology. Financiële steun voor dit werk werd geleverd door een NIH-subsidie ​​K08-HL093360, UCSF REAC Award, een NIH Nanomedicine Development Center Award PN2EY018244, en de financiering van het Centrum voor Endothelial Cell Biology van de Children&#39;s Healthcare van Atlanta.

1. Fabricage van de endotheliale microdevice <ol><li> Maak een masker door het indienen van een computer assisted design (CAD) tekening van de microfluïdische apparaat aan een externe leverancier masker. De gebruikte masker bestond uit een chroomlaag op glas natronkalk. In dit geval microfluïdische kanaalbreedte was 30 pm. </li><li> Reinigen van een kale siliciumplak met piranha (10:01 verhouding van zwavelzuur en waterstofperoxyde) gedurende 15 minuten dopen in fluorwaterstofzuur 30 seconden. Spoelen met gedeïoniseerd (DI) water gedurende ongeveer 10 seconden. </li><li> Een rotatie coater, spin Microchem SU-8 2025 fotoresist op de wafer een hoogte van 30 pm. Voor SU-8 2025, is een spin toerental van 3000 rpm aanbevolen. Andere viscositeiten van SU-8 zijn die de hoogte te bereiken. Volledige instructies voor het SU-8 gebruik zijn beschikbaar op <a href="http://www.microchem.com" target="_blank">www.microchem.com</a> </li><li> Plaats de wafer SU-8 op een kookplaat bij 95 ° C5 minuten rijden overtollige oplosmiddel. Opmerking: Een oven zal de wafer anders te drogen dan een kookplaat en wordt niet aanbevolen. </li><li> Plaats een masker met de gewenste functie vorm over de wafer, en blootstellen aan UV-licht (160 mJ / cm 2 gemeten bij 365 nm) met een masker richteenheid (Karl Suss MA-6). Dit kruis verbindt de fotolak. </li><li> Plaats de wafer op een kookplaat bij 95 ° C nog 5 minuten te versnellen de polymerisatie van SU-8. </li><li> Dompel de wafer in SU-8 ontwikkelaar, voornamelijk uit PGMEA (propyleen glycol methyl ether acetaat) gedurende 4 minuten aan de niet-verknoopte SU-8 verwijderen. </li><li> Spoel nieuw ontwikkelde wafer met 100% isopropylalcohol (IPA) gedurende 10 s. De wafer kan dan worden gedroogd met behulp van druk stikstof of doordat het oplosmiddel van het plaatje in een schone zuurkast verdampen enkele minuten. </li><li> Tape de randen van de droge wafer patroon SU-8 in een petrischaal voorafontluchten beweging. </li><li> Breng 1 ml Sigmacote de wafer met een pipet met de bovenkant van de petrischaal en swirl wafer volledige bekleding van de wafer zorgen deksel te verwijderen, en laat wafer drogen enkele minuten tot alle oplosmiddel verdampt. </li></ol> 2. PDMS (Polydimethylsiloxaan) Voorbereiding <ol><li> Mix PDMS polymeer en katalysator in een 10:01 verhouding (w / w) en luchtbellen te verwijderen met een vacuumexsiccator. De tijd die nodig is om ontgas de PDMS varieert de sterkte van de beschikbare vacuümsysteem, maar gewoonlijk varieert van enkele minuten tot een uur. Een zes inch petrischaal zonder vooraf gegoten PDMS, een totaal volume van 60 ml polymeer wordt aanbevolen. </li><li> Giet het mengsel op de wafer, ongeveer 5 mm dik. Ook giet op een vlakke bodem schotel om een ​​dunne plaat van PDMS te maken, ongeveer 1 mm dik. Uitharden bij 60 ° C in een oven gedurende de nacht. </li><li> Met behulp van een mes of scalpel, uitgesneden rond de creerd PDMS-apparaat en verwijder deze uit de wafer. Bovendien gesneden een dunne PDMS iets groter dan de toestel. </li><li> Maak in-en uitlaat gaten in de PDMS-apparaat via een 1,0 mm gat punch. Dit kan worden bereikt met behulp van een pen vice, Harris Uni-Core, of iets dergelijks. </li><li> Reinig het oppervlak van het apparaat en de plaat met behulp van plakband. </li><li> Een plasma reiniger bloot de oppervlakken van de PDMS apparaat PDMS beschrijving aan zuurstofplasma 30 s. De zuurstofplasma ontstaat reactieve op het blootgestelde oppervlak van de band die PDMS wanneer het in aanraking. </li><li> Verbinding kleinere buis met een lengte (enkele centimeters) van grote buizen, die op zijn beurt een injectiespuit verbonden met een stompe punt naald, gevuld met 50 ug / ml fibronectine uit humaan plasma in PBS. De buis en de naald zijn zodanig gedimensioneerd dat een wrijvingspassing wordt tussen de buizen. Plaats kleinere slangen in de inlaat van PDMS microdevice en eenPas toe druk aan de injectiespuit volledig vullen van de kanalen met fibronectine oplossing en een kleine 100 pi druppelsgewijs de afvoeropening maken, dat de kanalen nat blijven. Incubeer de inrichting bij 37 ° C gedurende 40-60 minuten. </li><li> Sluit een verse injectiespuit gevuld met PBS om de stompe punt naald. Oefen druk uit op de spuit om het apparaat te spoelen met PBS. </li></ol> 3. Seeding de microfluïdische apparaat met endotheelcellen <ol><li> Bereid miljoen cellen / ml humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC&#39;s) in endothelial growth media met 8% dextran. Een reeks van 500.000 tot 2.000.000 cellen / ml met succes gebruikt. Toevoeging van dextran de cel geladen medium verhoogt de viscositeit van de vloeistof, die de snelheid van endotheelcellen afneemt wanneer zij het met fibronectine gecoate microfluïdische systeem. Dit op zijn beurt, de kans dat de cellen hechten en met succes cultuur in de microdevice. </li><li> Cluit de nieuwe spuit en slangen zoals in stap 2.7. maar met een langere buis (ongeveer 1 meter). </li><li> Om optimaliseren van dit systeem, is het essentieel op dit punt voorkomen lekken of luchtbellen in het gehele perfusiesysteem, lekkage oplossing of de aanwezigheid van luchtbellen in de media de stroom veranderen en voorkomen succesvolle zaaien van endotheelcellen. Daarom, strakke montage van de slang is essentieel om lekkage tussen de aansluitingen te elimineren. Bubbles in de spuit-en / of leidingen moeten worden verwijderd voordat cellen worden geïntroduceerd in de microdevice en het hele perfusie systeem moet worden geprimed met de cel oplossing voor het bevestigen van de slang aan op de microfluïdische de invoering van luchtbellen te voorkomen. </li><li> Met een spuit pomp trekken celsuspensie in PDMS inrichting op volumestroom van 1,23 pl / min gedurende 2 uur bij 37 ° C en 5% CO2. Optimale resultaten werden verkregen wanneer de injectiespuit pomp was op de<html> dezelfde hoogte als de toestel PDMS. Voor de inlaat langere buis, die kan worden opgerold binnen de couveuse, zodat de cellen en media voldoende verwarmd voordat ze in contact met het apparaat. In ons systeem de volumestroom van 1,23 pl / min benadert een halverwege snelheid van ~ 1 mm / s in de kleinste microkanalen, overeenkomend met een afschuifspanning van ~ 1 dyne / cm 2 op de kanalen van bloed. </li><li> Met dezelfde spuitpomp lange slangen doorstroomd vers kweekmedium voor 2-8 dagen verhouding van 1,23 pl / min. Een succesvolle apparaat een monolaag van endotheelcellen groeien op de binnenzijde van de machine binnen 24-48 uur. Eerdere experimenten hebben aangetoond dat confluente monolagen juiste VE-cadherine uiten cel-juncties in de inrichting 14. </li><li> Injecteer bloed of celsuspensie in het systeem te experimenteren. </li></ol> 4. Representatieve resultaten _content &quot;&gt; Met dit protocol standaard lithografische microfabricage technieken worden gebruikt om de matrijs nodig microfluïdische kanalen die fysiologisch bootsen de sizescale van de capillairen (figuur 1A) produceren maken. behulp van een geoptimaliseerde perfusietechniek, endotheelcellen dan zaden en confluently cultuur de gehele binnenkant van de microfluïdische systeem binnen 24-48 uur van cel zaaien (Figuur 1B). Aangezien het microfluïdische systeem transparant is, kan de hele microdevice geplaatst worden op een helderveld / fluorescentiemicroscoop podium voor beeldvorming en het verzamelen van gegevens. De kan dan worden toegepast hematologische aandoeningen die betrekken veranderd biofysische eigenschappen zoals sikkelcelziekte, waarbij de verhoogde stijfheid van sickled rode cellen en afwijkende leukocyten en endotheliale adhesie bijdragen tot microvasculaire obstructie bestuderen. Een klinisch goedgekeurde medicijnen, hydroxyurea, verzacht de symptomen maar de directe effect op microvasculaire stroom is onbekend. Onze test houdt rekening met zowel de cel stevigheid en hechting, en toont aan dat hydroxyurea aanzienlijk doorstroming verbetert bij patiënten met sikkelcelanemie (figuur 2). Sikkelcelziekte is slechts een voorbeeld van een toepassing voor de microvasculatuur-on-a-chip, omdat dit systeem is uitermate geschikt voor een hematologische proces waarin bloedcellen met elkaar omgaan en endotheelcellen in de microvasculatuur te bestuderen. Andere klinisch relevante toepassingen zijn onder meer inflammatoire aandoeningen, sepsis / long schade, trombotische microangiopathies, malaria, en kanker metastase, terwijl meer fundamentele toepassingen zijn onder meer leukocyten de biologie en de hematopoietische stamcellen biologie, onder vele anderen. <img src="/files/ftp_upload/3958/3958fig1.jpg" alt="Figuur 1"/> Figuur 1. A) de eerste PDMS microfluïdische apparaat voordat endothelizatie. Hier wordt de microdevice geïnjecteerd humorh kleurstof aan sizescale en de algehele vormgeving van het systeem te illustreren. B) helderveld microscopie toont de microfluïdische systeem volledig endothelialized binnen 48 uur van cel zaaien met behulp van het protocol hier beschreven. <img src="/files/ftp_upload/3958/3958fig2.jpg" alt="Figuur 2"/> Figuur 2. A) De microvasculatuur-on-a-chip met microkanalen benadert de omvang van de post-capillaire venulen (30 micrometer), de site van de meeste sikkelcel microvasculaire obstructieve evenementen. Volbloed van sikkelcel patiënten die hydroxyurea en van patiënten die geen hydroxyurea wordt doorstroomd twee verschillende microvasculatuur-on-a-chip-apparaten. B) volbloed van sikkelcel patiënten die hydroxyurea stromen relatief gemakkelijk binnen de endothelialized microkanalen. C) Onder dezelfde voorwaarden hemodynamische, volbloed van sikkelcel patiënten die geen hydroxyurea, maar vertoont nog veel meer trage stroom met microchannel obstructie. De onderste kanaal is volledig geblokkeerd met geen stroming en de stroomsnelheden in de andere endothelialized microkanalen zijn aanzienlijk lager dan in de hydroxyurea conditie. De schaalstaaf in de drie beelden is 30 pm.

<ol><li>Mezzano, D., Quiroga, T., Pereira, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Level+of+Laboratory+Testing+Required+for+Diagnosis+or+Exclusion+of+a+Platelet+Function+Disorder+Using+Platelet+Aggregation+and+Secretion+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Thromb.+Hemost%22%5BJournal%5D)">The Level of Laboratory Testing Required for Diagnosis or Exclusion of a Platelet Function Disorder Using Platelet Aggregation and Secretion Assays.</a> Semin. Thromb. Hemost. 35, 242-254 (2009).</li>
<li>Young, E. W. K., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+microfluidic+cell+culture+in+controlled+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments.</a> Chemical Society Reviews. 39, 1036-1048 (2010).</li>
<li>Young, E. W. K., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macro-+microscale+fluid+flow+systems+for+endothelial+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Macro- microscale fluid flow systems for endothelial cell biology.</a> Lab on a Chip. 10, 143-160 (2010).</li>
<li>Higgins, J. M., Eddington, D. T., Bhatia, S. N., Mahadevan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sickle+cell+vasoocclusion+and+rescue+in+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Sickle cell vasoocclusion and rescue in a microfluidic device.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 20496-20500 (2007).</li>
<li>Rosano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physiologically+realistic+in+vitro+model+of+microvascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks.</a> Biomedical Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).</li>
<li>Meer, A. D. vander, Poot, A. A., Duits, M. H. G., Feijen, J., Vermes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Technology+in+Vascular+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Technology in Vascular Research.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2009, (2009).</li>
<li>Karunarathne, W., Ku, C. -J., Spence, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dual+nature+of+extracellular+ATP+as+a+concentration-dependent+platelet+P2X1+agonist+and+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">The dual nature of extracellular ATP as a concentration-dependent platelet P2X1 agonist and antagonist.</a> Integrative Biology. 1, 655-663 (2009).</li>
<li>Kotz, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+microfluidics+for+neutrophil+genomics+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Clinical microfluidics for neutrophil genomics and proteomics.</a> Nat. Med. 16, 1042-1047 (2010).</li>
<li>Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+cell+mechanics+in+hematologic+diseases+with+microfluidic+biophysical+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry.</a> Lab on a Chip. 8, 1062-1070 (2008).</li>
<li>Shelby, J. P., White, J., Ganesan, K., Rathod, P. K., Chiu, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+model+for+single-cell+capillary+obstruction+by+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A microfluidic model for single-cell capillary obstruction by Plasmodium falciparum-infected erythrocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14618-14622 (1073).</li>
<li>Borenstein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+endothelialized+microvascular+networks+with+circular+cross-sections+in+a+tissue+culture+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Functional endothelialized microvascular networks with circular cross-sections in a tissue culture substrate.</a> Biomedical Microdevices. 12, 71-79 (2010).</li>
<li>Nesbitt, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shear+gradient-dependent+platelet+aggregation+mechanism+drives+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation.</a> Nat. Med. 15, 665-673 (2009).</li>
<li>Prabhakarpandian, B., Shen, M. -C., Pant, K., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+for+modeling+cell-cell+and+particle-cell+interactions+in+the+microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature.</a> Microvascular Research. 82, 210-220 (2011).</li>
<li>Tsai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+modeling+of+the+microvascular+occlusion+and+thrombosis+that+occur+in+hematologic+diseases+using+microfluidic+technology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology.</a> The Journal of Clinical Investigation. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Green, D. A., Murphy, W. G., Uttley, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haemolytic+uraemic+syndrome%3A+prognostic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Laboratory+Haematology%22%5BJournal%5D)">Haemolytic uraemic syndrome: prognostic factors.</a> Clinical & Laboratory Haematology. 22, 11-14 (2000).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De endothelialized microdevice wordt best in combinatie met in vivo experimenten en zijn reductionistische benadering kan helpen verhelderen de biofysische mechanismen hematologische processen die bij de mens en diermodellen. Bovendien is ons systeem is niet zonder beperkingen. Zo onze microfluïdische kanalen vierkante dwarsdoorsnede. Hoewel technisch ronde microkanalen kunnen worden vervaardigd 10,11, hebben we ervoor gekozen om een eenvoudiger en standaard fabricage procedure te gebruiken, zodat an...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> stompe punt naald </td><td> OK International </td><td> 920050-TE </td><td> Precision TE naald van 20 gauge x 1/2 &quot;, roze </td></tr><tr><td> dextran </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 31392 </td><td></td></tr><tr><td> Fibronectine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0895 </td><td></td></tr><tr><td> Hole puncher (pin bankschroef) </td><td> Technische innovaties </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Human navelstreng endotheelcellen (HUVEC&#39;s) </td><td> Lonza </td><td> CC-2519 </td><td></td></tr><tr><td> Plasma reiniger </td><td> Plasma </td><td> PDC-326 </td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxaan (PDMS) </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9285739 </td><td> Sylgard 184 siliconelastomeerfase KIT </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> SL2 </td><td></td></tr><tr><td> SU-8 2025 </td><td> Microchem </td><td> Y111069 </td><td></td></tr><tr><td> SU-8 Developer </td><td> Microchem </td><td> Y020100 </td><td></td></tr><tr><td> Injectiepomp </td><td> Harvard Apparatuur </td><td> 70-3008 </td><td> PHD-ULTRA </td></tr><tr><td> buis (grotere) </td><td> Cole-Parmer Instrument Company </td><td> 06418-02 </td><td> Tygonreg microbore slangen, 0,020 &quot;ID x 0.060&quot; OD </td></tr><tr><td> buis (kleinere) </td><td> Cole-Parmer Instrument Company </td><td> 06417-11 </td><td> PTFE microbore buizen, 0.012 &quot;ID x 0,030&quot; OD </td></tr></tbody></table>

endothelialized microfluidics voor het bestuderen van microvasculaire interacties in hematologische ziekten

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

De vooruitgang in microfabricage technieken hebben het mogelijk de productie van goedkope en reproduceerbare microfluïdische systemen voor het uitvoeren van biologische en biochemische experimenten op micro-en nanoschaal 1,2. Daarnaast zijn microfluidics ook specifiek gebruikt om kwantitatief te analyseren hematologische en microvasculaire processen, vanwege hun vermogen om eenvoudig controle de dynamische vloeibare milieu en biologische omstandigheden 3-6. Als zodanig hebben de onderzoekers meer recent gebruikt microfluïdische systemen bloedcellen vervormbaarheid, bloedcel aggregatie, microvasculaire doorbloeding, en bloed cel-endotheliale cel interacties 6-13 te bestuderen. Echter, deze microfluïdische systemen ofwel geen rekening gehouden met gekweekte endotheelcellen of waren groter dan sizescale relevante microvasculaire pathologische processen. Een microfluïdische platform met gekweekte endotheelcellen die nauwkeurig recapituleert de cellulaire, fysieke en hemodynAmic omgeving van de microcirculatie is nodig om ons begrip van de onderliggende biofysische pathofysiologie van hematologische ziekten die de microvasculatuur te betrekken bevorderen. Hier melden wij een methode om een &quot;endothelialized&quot; te creëren in vitro model van de microvasculatuur, met behulp van een eenvoudige, enkel masker microfabricage proces in combinatie met standaard endotheelcellen cultuur technieken, om pathologische biofysische microvasculaire interacties die plaatsvinden in de hematologische ziekte te bestuderen. Deze &quot;microvasculatuur-on-a-chip&quot; biedt de onderzoeker met een robuuste test die goed bestuurt zowel biologische als biofysische voorwaarden en wordt bediend met een standaard spuit pomp en helderveld / fluorescentie microscopie. Parameters zoals microcirculatie hemodynamische omstandigheden, endotheelcellen type bloedcel type (n) en de concentratie (s), drugs / remmende concentratie etc. kunnen allemaal eenvoudig te bedienen. Als zodanig is onze microsysteem biedteen methode om kwantitatief te onderzoeken ziekte processen waarin microvasculaire doorstroming wordt belemmerd als gevolg van veranderingen in celadhesie, aggregatie, en vervormbaarheid, een vermogen beschikbaar met bestaande tests.

Een methode om cultuur een endotheelcel monolaag het gehele inwendige oppervlak van een 3D microfluïdische apparaat met microvasculaire grootte kanalen (&lt;30 pm) beschreven. Deze<em&gt; In vitro</em&gt; Capillairen model kan de studie van biofysische interacties tussen bloedcellen, endotheelcellen en oplosbaar factoren hematologische aandoeningen.

Endothelialized Microfluidics voor het bestuderen van microvasculaire Interacties in Hematologische ziekten

Vooruitgang in microfabricagetechnieken heeft de productie van goedkope en reproduceerbare microfluïdische systemen mogelijk gemaakt voor het uitvoeren van biologische en ...

Het algemene doel van deze procedure is het creëren van een microfluïdisch apparaat dat is bekleed met endotheelcellen. Dit wordt bereikt door eerst de microfluïdische mal te fabriceren. De tweede stap is het creëren van het PDMS-kanaal.Vervolgens worden de endotheelcellen in het apparaat gezaaid. De laatste stap is het kweken van de cellen binnen het apparaat. Uiteindelijk worden microfluïdische apparaten gecoat met endotheelcellen gebruikt om cel-celinteracties in vitro aan te tonen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat het de onderzoeker een nauwkeurige controle biedt over de biologische en biofysische omstandigheden en compatibel is met fluorescentiemicroscopie. Hoewel deze methode inzicht kan verschaffen in de biofysische cel-celinteracties bij hematologische aandoeningen, kan deze ook worden toegepast op fenomenen zoals leukocytenbiologie, kankermetastase en hematopoëtische stamcelbiologie. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat de omstandigheden strikt gecontroleerd moeten worden voor een succesvolle celbevestiging.Ter voorbereiding op de fabricage wordt een fotomasker gemaakt door een computer-aided design-afbeelding van het microfluïdische apparaat naar een externe maskerspecialist te sturen. Zodra het masker is ontvangen, bestaat dit uit een chroomlaag op soda-limeglas. Hier is de breedte van het microfluïdische kanaal 30 microns.Om te beginnen met de fabricage van het microfluïdische apparaat, reinigt u een onbewerkte siliciumwafer gedurende 15 minuten met piranha-oplossing en spoelt u deze vervolgens 10 seconden af met gedeïoniseerd water. Dompel de siliciumwafer daarna 30 seconden onder in fluorwaterstofzuur en spoel deze ongeveer 10 seconden af met gedeïoniseerd water. Breng vervolgens met een spin-coater MicroChem SU-8 2025 fotolak aan op de wafer tot een hoogte van 30 microns bij een spinsnelheid van 3000 omwentelingen per minuut.Plaats de met SU 8 20 25 gecoate wafer vijf minuten op een hotplate die is ingesteld op 95 °C om overtollig oplosmiddel te verdampen. Een oven wordt voor deze stap niet aanbevolen. Plaats nu het fotomasker over de wafer en exposeer deze aan UV-licht in een mask liner om de SU 8 20 25 fotoresist te crosslinken.Plaats de wafer na het cross-linken nog eens vijf minuten op de warmteplaat bij 95 °C om de polymerisatie van SU 8 20 25 fotolak verder te versnellen. Dompel de wafer vervolgens gedurende vier minuten onder in SU 8-ontwikkelaar, die hoofdzakelijk bestaat uit P-G-M-E-A.Hiermee wordt de niet gecrosslinkte SU 8 20 25 fotorezist verwijderd. Spoel de vers ontwikkelde wafer gedurende 10 seconden met 100% isopropylalcohol en droog deze vervolgens met gestikte stikstof, of door het oplosmiddel gedurende enkele minuten te laten verdampen van de wafer in een schone zuurkast. Plak nu de gedroogde wafer in het midden van de Petrischaal, waarbij u er zorg voor draagt dat de tape op de randen van de wafer wordt geplaatst.Pipetteer tenslotte 500 µL sigma coat op de wafer. Sluit de petrischaal met het deksel en wals de schaal vervolgens om een volledige coating van de wafer te garanderen. Verwijder het deksel en laat de wafer enkele minuten drogen totdat al het oplosmiddel is verdampt.Nadat het PDMS-polymeer en het uithardingsmiddel in een gewichtsverhouding van 10 op 1 zijn gemengd, worden luchtbellen gedurende enkele minuten tot een uur verwijderd met een vacuümdesiccator, afhankelijk van de sterkte van het beschikbare vacuümsysteem. Wanneer alle luchtbellen zijn verwijderd, wordt het mengsel in de schaal gegoten zodat de wafer en het oppervlak van de schaal bedekt zijn. Dit resulteert in een PDMS-laag met een dikte van ongeveer vijf millimeter.Maak daarnaast een dun, kenmerkloos stuk PDMS van één millimeter dik. Laat het mengsel vervolgens een nacht uitharden in een oven op 60 °C. Gebruik de volgende dag een mes of scalpel om rond de wafer te snijden en meerdere PDMS-microfluïdische apparaten te verwijderen.Snijd vervolgens het vel door om de individuele apparaten te isoleren. Snijd het PDMS-vel iets groter uit dan het microfluïdische apparaat. Gebruik nu een pincetklem zoals een Harris unicorn of een soortgelijk instrument om inlaat- en uitlaatgaten in het microfluïdische apparaat te maken.Reinig vervolgens de oppervlakken van het microfluïdische apparaat en de vel met plakband. Gebruik daarna een plasmareiniger om de oppervlakken van het microfluïdische apparaat en de PDMS-vel 30 seconden lang bloot te stellen aan zuurstofplasma. Het zuurstofplasma creëert reactieve species op het blootgestelde oppervlak van de PDMS, die een binding vormen wanneer ze in fysiek contact worden gebracht.Vul vervolgens een spuit van één milliliter, voorzien van een stomp-puntige naald van 20 gauge, met 50 microgram per milliliter fibronectine uit menselijk plasma in PBS en schuif vervolgens een stukje slang over de naald. Steek een stuk dunnere slang in het eerste stuk slang om een klemvasting tussen de twee slangstukken te creëren.Bevestig vervolgens het andere uiteinde van het dunnere slangetje aan de inlaat van het microfluïdische apparaat. Oefen druk uit op de spuit om de kanalen volledig te vullen met de fibronectine-oplossing en om een kleine druppel van 100 microliter bij de uitlaatpoort te creëren, zodat de kanalen vochtig blijven. Incubeer het microfluïdische apparaat vervolgens in een bevochtigde incubator bij 37 °C gedurende 40 tot 60 minuten.Koppel na de incubatie een nieuwe spuit gevuld met PBS aan de stompe naald. Oefen druk uit om het microfluïdische apparaat door te spoelen met PBS. Bereid 500.000 tot 2 miljoen menselijke navelstrengader-endotheelcellen (hve) per milliliter voor in endotheelgroeimedium met 8% dextran.De toevoeging van dextran verhoogt de kans dat de cellen succesvol hechten en groeien binnen het microfluïdische apparaat. Vul een schone spuit, voorzien van een stomp naald en bredere slang, met de celsuspensie en sluit hier een langer stuk slang van ongeveer één meter aan. Het is cruciaal om ervoor te zorgen dat de slang stevig aansluit om lekkage tussen de verbindingen te voorkomen.Spoel de slang door met de celoplossing en zorg ervoor dat er geen bellen aanwezig zijn in de spuit of in de slangen om de prestaties van het systeem te optimaliseren. Het is op dit punt cruciaal om te voorkomen dat er lekken ontstaan of dat er bellen in het systeem terechtkomen. Elke lekkage van de oplossing of de aanwezigheid van bellen in het medium zal de succesvolle hechting van endotheliale cellen beletten.Zodra alle luchtbellen zijn verwijderd en de volledige lengte van de slang is gevuld met de cel-suspensie, wordt de spuit op de pomp geplaatst en het andere uiteinde aan de microfluïdische inlaat bevestigd. De spuitpomp wordt op dezelfde hoogte als het microfluïdische apparaat ingesteld. De lange slang wordt zorgvuldig opgerold in de incubator om ervoor te zorgen dat de cellen en het medium voldoende zijn opgewarmd voordat ze in contact komen met het apparaat.Vervolgens wordt de celsuspensie in ons systeem gedurende twee uur bij 37 °C en 5% carbon dioxide in het microfluïdische apparaat geïnfuseerd met een volumetrische stroomsnelheid van 1,23 µL per minuut. De volumetrische stroomsnelheid van 1,23 µL per minuut komt overeen met een stroomsnelheid in het midden van één mm per seconde in de kleinste kanalen. Dit benadert een wandspanning van één dyne per cm² in die kanalen bij gebruik van volbloed.Zodra de infusie van de celsuspensie is voltooid, dient dezelfde spuitpomp en lange slang met een grotere spuit te worden gebruikt om gedurende twee tot acht dagen vers groeimedium te infuseren met een snelheid van 1,23 µL per minuut. Wanneer de cellaag het gewenste confluentieniveau heeft bereikt, wordt er bloed of celsuspensie in het systeem geïnjecteerd voor experimentele doeleinden. Hier wordt het microfluidische apparaat getoond vóór de endotheelialisatie.Het microfluïdische apparaat is gevuld met voedingskleurstof om de omvang, schaal en het algemene ontwerp van het apparaat te illustreren dat de fysiologie van de vasculatuur nabootst. Brightfield-microscopie toont de endothelialisatie van een microfluïdisch apparaat. Deze afbeelding is minder dan 48 uur na het zaaien verkregen volgens het beschreven protocol; de geoptimaliseerde perfusietechniek maakt het mogelijk dat endotheelcellen het gehele binnenoppervlak van het microfluïdische systeem confluent cultiveren.Binnen 24 tot 48 uur na het uitzaaien van de cellen. Zoals te zien is op deze confocale afbeelding, benadert de microvasculaire tumor-on-a-chip met microkanalen de grootte van 30 micron van postcapillaire venulen, de plek waar de meeste microvasculaire obstructieve incidenten bij sikkelcelziekte optreden. In dit experiment wordt volbloed van gezonde patiënten onder gedeoxygeneerde omstandigheden in een microvasculatuur-on-a-chip-apparaat geïnfuseerd.Deze film laat zien dat de stroom van volbloed in ons endotheel microfluïdische systeem regelmatig, soepel en continu is, zonder gebieden met obstructies in de microkanalen. Hier wordt volbloed van patiënten met sikkelcelziekte geïnfuseerd in een microvasculatuur-op-een-chip-apparaat. Onder gedeoxygeneerde omstandigheden zijn aanzienlijke veranderingen in de bloedstroom zichtbaar, waarbij volledige occlusies optreden in verschillende kanalen.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om erop te letten dat er geen luchtbellen ontstaan bij het wisselen van de slangen. Het voltooide apparaat is compatibel met fluorescentiemicroscopie en kan worden aangepast voor traditionele fluorescentie-assays. Deze techniek maakt het voor experimentele hematologen mogelijk om experimenten uit te voeren met enkelvoudige cellen in een gecontroleerde biofysische en hemodynamische omgeving.Geen luchtbellen.

endothelialized-microfluidics-for-studying-microvascular-interactions

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Hier beschrijven we een methode om menselijk navelstrengbloed afgeleide endotheel kolonie-vormende cellen (ECFCs) en beenmerg-afgeleide mesenchymale stamcellen (MSC's), ingebed in een collageen / fibronectine gel, subcutaan in immunodeficiënte muizen. Te leveren Deze cel / gel combinatie genereert een humane vasculaire netwerk dat verbindt met de muis vaatstelsel.

Bioengineering Human Microvasculaire Netwerken in immunodeficiënte muizen

Microfluïdische stromingskamers geëtst door fotolithografie en vervaardigd uit PDMS worden toegepast op functionele resultaten in verband met EG-dysfunctie en ontsteking te onderzoeken. In een representatief experiment het vermogen van differentiële schuifspanning moduleren monocyte celhechting aan cytokine geactiveerd EC monolagen wordt aangetoond.

On-Chip Endotheliale Inflammatoire Fenotypering

Een microchannels-on-a-chip platform werd ontwikkeld door de combinatie van fotolithografische reflowable fotolak techniek, zachte lithografie, en microfluidics. Het endotheel microkanalen platform bootst de driedimensionale (3D) geometrie van in vivo micro-vaatjes, loopt onder gecontroleerde continue perfusie stroom, zorgt voor hoge kwaliteit en real-time beeldvorming en kan worden toegepast voor microvasculaire onderzoek.

Procedure voor de ontwikkeling van multi-diepte Circulaire Cross-sectionele endotheel Microkanalen-on-a-chip

Trombocyttransfusie en hemostase werden gemodelleerd met behulp van bloedreconstitutie en microfluïdische stroomkamers om de functie van bloedbanktrombocyt te onderzoeken. De gegevens tonen de gevolgen van trombocyt-opslageffect op hemostase, in vitro aan.

Microfluïdische Flow Chambers behulp Gereconstitueerde Blood voor Model hemostase en bloedplaatjestransfusie<em&gt; In Vitro</em

Primaire humane umbilicale veneuze endotheelcellen (HUVEC's) werden gekweekt tot confluentie binnen een microfluïdisch netwerkapparaat. De endotheliale celverbinding en F-actine-verdelingen werden geïllustreerd en de veranderingen in intracellulaire calciumconcentratie en stikstofmonoxideproductie als reactie op adenosinetrifosfaat (ATP) werden gequantificeerd in real-time op individueel cellniveau.

Ontwikkeling en karakterisering van<em&gt; In Vitro</em&gt; Microvaatje Netwerk- en kwantitatieve metingen van endotheliale [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; En productie van stikstofoxide

Dit manuscript bevat een spuitgiet methode om microvaten dat fysiologische eigenschappen van endotheel recapituleren ingenieur. De microfluïdische-based proces creëert patent 3D vasculaire netwerken met tailorable omstandigheden, zoals stroom, cellulaire samenstelling, geometrie, en biochemische hellingen. Het fabricageproces en voorbeelden van mogelijke toepassingen worden beschreven.

Micropatterning en montage van 3D microvaten

We presenteren een in vitro vasculaire ziekte model om hele bloed interacties met patiënt-afgeleide endotheel te onderzoeken. Dit systeem maakt het mogelijk om tromboogene eigenschappen van primaire endotheelcellen onder verschillende omstandigheden te bestuderen. De methode is vooral geschikt om in situ tromboïgeniteit en antistollingstherapie te evalueren tijdens verschillende fasen van stolling.

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

Hier bieden we een microfluïdische chip en een automatisch gecontroleerd, zeer efficiënt circulatiemicrofluïdisch systeem dat de initiële micromilieu van neovascularisatie samenvat, waardoor endotheelcellen (EC's) tegelijkertijd kunnen worden gestimuleerd door hoge luminale schuifspanning, fysiologisch niveau van transendotheliale stroom en verschillende vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) distributie tegelijkertijd.

Microfluïdisch model om de eerste gebeurtenis van neovascularisatie na te bootsen

In dit protocol wordt een biomimetische microfluïde assay, die een fysiologisch relevante microvasculaire omgeving kan reproduceren en de gehele leukocytenadhesie / migratiecascade kan reproduceren, gebruikt om leukocyten-endotheelcelinteracties bij ontstekingsziekten te bestuderen.

Een microfysiologisch systeem om leukocyten-endotheelcelinteractie tijdens ontsteking te bestuderen

De bloedplaatjesfunctie onder stroom kan worden beoordeeld en gesimuleerde hemostatische reanimatie kan worden gemodelleerd met behulp van een microfluïdisch apparaat, dat toepassingen heeft in de trauma- en transfusiegeneeskunde.

Microfluïdica bij het beoordelen van de bloedplaatjesfunctie

Hier presenteren we een protocol om een microfluïdisch systeem te fabriceren en te bedienen dat endotheelcellen blootstelt aan gesynchroniseerde oscillerende hyperglykemie en pulserende schuifspanning. Deze benadering biedt een fysiologisch relevant in vitro model voor het bestuderen van diabetische endotheeldysfunctie. Dit protocol maakt kwantitatieve metingen van oxidatieve stress en endotheelcelresponsen mogelijk.

Een microfluïdisch systeem voor het modelleren van endotheeldisfunctie onder gecombineerde fysiologische pulserende schuifspanning en oscillerende hyperglykemie

Leer endothelialized microfluidics voor het bestuderen van microvasculaire interacties in hematologische ziekten. Deze methode maakt onderzoek naar cel-celinteracties in vitro mogelijk met nauwkeurige biologische controle.

Endothelialized Microfluidics voor het bestuderen van microvasculaire Interacties in Hematologische ziekten

Meer video's verkennen