Real-time Digital Imaging van leukocyt-endotheliale Interactie in ischemie-reperfusie schade (IRI) van de Rat cremasterspier

Intravitale microscopie van de microcirculatie in de m. cremaster is een handige methode om inzicht te krijgen in ischemie en reperfusieschade van gestreept spierweefsel. In een stapsgewijs protocol beschrijven we hoe u kunt beginnen met anesthetisering onder beademing met adequate monitoring via arteriële canulatie, om het dier gedurende langere perioden stevig onder anesthesie te houden. We illustreren hoe de vena jugularis gecanuleerd wordt en beschrijven vervolgens de preparatie van de m. cremaster als een dun plat vel voor een uitstekende optische resolutie.

Wij bieden een protocol voor leukocyt-imaging bij ischemische reperfusieschade dat in onze laboratoria goed is vastgesteld. Dit model kan worden gebruikt om de oxidatieve activiteit voor onderzoek naar ischemie-reperfusieschade te analyseren.

Ischemie-reperfusieschade speelt een rol bij een groot aantal pathologische aandoeningen, zoals myocardinfarcten, intestinale ischemie, alsmede na transplantaties en cardiovasculaire chirurgie. Hyperperfusie van eerder ischemisch weefsel is essentieel voor het voorkomen van irreversibele weefselschade, maar roept een overmatige ontsteking op in het getroffen weefsel, naast de productie van reactieve zuurstofspecies, de activering van het complementsysteem en een toegenomen microvasculaire permeabiliteit. De activering van leukocyten is een van de belangrijkste actoren in de pathologische cascade van inflammatoire weefselschade tijdens reperfusie.

Wij promoten hier intravitale microscopie van de postcapillaire venen als een handige methode om leukocytenactivatie bij ischemie-reperfusieschade te analyseren. Verder illustreren we veelvoorkomende valkuilen en geven we nuttige tips die de lezer in staat moeten stellen de methode echt te waarderen en veilig uit te voeren. Na goedkeuring van de ethische commissie en anesthesie van mannelijke ratten met een lichaamsgewicht van 120 tot 180 gram, werd de rat in de plexiglasdoos geplaatst en werd twee tot drie volumeprocent isofluraan toegediend via een isofluraanverdamper.

Zodra het juiste anesthesieniveau is bereikt, wordt de rat gewogen en wordt de ventrale cervicale regio geschoren. Plaats de rat in rugligging op een warmtemat om de lichaamstemperatuur op 37 °C te houden en dien isofluraan toe in een concentratie van 2 volume procent met behulp van een siliconen masker. De volgende handelingen worden bij voorkeur uitgevoerd met een operatiemicroscoop.

Maak een horizontale huidincisie van twee centimeter in het gebied van de sternale inkeping van de SRA. Mobiliseer de speekselklieren lateraal. Nu zijn de ventrale nekspieren zichtbaar.

Scheid ze voorzichtig in de middellijn en zoek de trachea. Leg één tot twee centimeter van de trachea vrij en plaats een micropincet vanonderaf om deze op te tillen. Voer nu, ongeveer halverwege de ventrale zijde van de trachea, een tube van 14 gauge in als trachealtube in het onderste deel van de trachea, welke reeds is aangesloten op een dierventilator.

De ademhaling kan vervolgens volumegestuurd worden met een frequentie van 35 tot 45 ademhalingen per minuut. Een teugvolume van 4,5 tot 5 ml en een isofluraanconcentratie van 1,5 tot 2 volumeprocent voor de carotiscannulatie. De rechter sternohyoideusspier wordt door middel van botte dissectie gescheiden.

Om een halsslagader te lokaliseren, scheidt u de nervus vagus voorzichtig van de arteria carotis en monteert u de slagader op Anki-microforceps om de bloedstroom vanuit het hart te stoppen. Plaats twee hechtingen onder de arteria carotis ten opzichte van het hart; de meer distale hechting wordt strak aangetrokken, terwijl de proximale hechting losjes rond de arteria carotis wordt geknoopt. Het aanbrengen van een tweede proximale hechting voorkomt bloedingen na het verwijderen van de microforceps. Maak met microscharen een kleine incisie in de arteria carotis tussen de twee ligaturen. Voer een polyethyleencatheter in, gevuld met een normale zoutoplossing en verbonden met een druktransducer.

Verwijder de micropincet en voer de katheter verder de slagader in. Voer intermitterende arteriële bloedgasanalyses uit met behulp van een bloedgasanalyser en houd de pH van het bloed binnen fysiologische grenzen voor de intraveneuze toediening van fluorescerende kleurstoffen of andere relevante geneesmiddelen. Focus met de chirurgische microscoop op het gebied van de linker gularvene; scheur met een pincet in elke hand de dunne fascia open om de jugularisvene bloot te leggen.

Bevestig de ader aan een gehoekte micropincet om de bloedstroom te stoppen. Gebruik een pincet om twee stukken hechtdraad van gelijke lengte op identieke wijze als bij de canulatie van de halsslagader onder de vena jugularis door te voeren, maak een kleine incisie in de vena jugularis en voer een polyethyleencatheter in die is gespoeld met cellijn-oplossing. Schuif de catheter richting het hart en trek de ligatuur die zich het dichtst bij het hart bevindt aan.

Rond de ader en de katheter gebruiken we een aluminium plateau voor cremasterische beeldvorming dat snel de gewenste temperatuur van het warmtekussen aanneemt. De initiële incisie wordt gemaakt in de huid en de fascia spermatica externa boven het scrotum aan het uiterste uiteinde, gevolgd door voorzichtige dilatatie van de subdermale ruimte met een fijne schaar. Zodra het weefsel is blootgesteld, wordt het bevochtigd met een voorverwarmde zoutoplossing.

Bindweefsel tussen de externe spermatische fascia en de m. cremaster wordt voorzichtig verwijderd om de m. cremaster te bevrijden van het omringende weefsel. Continue superfluïring tijdens de dissectie hydrateert het weefsel, wat de zichtbaarheid en verwijdering vergemakkelijkt, zoals bij het distale uiteinde van de m. cremaster om het uiteinde van de spier aan de ventrale zijde in het distale uiteinde van de zak vast te zetten en licht te strekken, en de incisie proximaal te verlengen. Met microscharen worden bloedvaten langs de incisielijnen voorzichtig gecauteriseerd.

Met behulp van een thermische cauterisator wordt de geopende musculus cremaster plat op de aluminium voetplaat gelegd, waarbij de testikel nog verbonden is met de onderliggende epididymis via dunne ligamenten, waaronder een kleine arterie en vene. Gebruik de cauterisator om de vaten te dichten en de bindweefselbanden tussen het discale en het cremasterische weefsel door te snijden. Duw de geïsoleerde testikel voorzichtig terug in het lieskanaal.

Naast de eerste fixatie, die bestaat uit vier hechtingen van het weefsel en het voorzichtig met tape spreiden van de draden, wordt het cremasterische weefsel radiaal op de aluminiumplaat uitgespreid. Plaats twee uiteinden van een polyethyleenkatheter dicht bij het cremasterweefsel voor de superfusie-opstelling. Trek met een spuit een lijn vaseline rond de cremasterspier om een vloeistofkamer te creëren.

Plaats een vierkant dekglas over het weefsel en bevestig de randen stevig aan de vaselinelijn. Het cremasterweefsel is nu klaar voor microscopische beeldvorming. De basisopstelling voor intravitale beeldvorming kan variëren.

We maken gebruik van een intravitale epifluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een 470 nanometer LED-lichtbron voor EP-laminatie. Met een waterimmersie-objectief bereiken we een vergroting van ongeveer 800 x voor de registratie van observaties middels een digitale camera met hoge resolutie. Voor epifluorescentie-imaging dient het experiment in een donkere kamer te worden uitgevoerd.

Injecteer voor de leukocytenmarkering rumine six J intraveneus via de jugulaire katheter in een concentratie van 0,4 milligram per kilogram lichaamsgewicht. Kies een postcapillair vat voor observatie. De diameter van het vat moet tussen 20 en 60 micrometer liggen en de bloedstroom moet voldoende zijn.

Laat het weefsel 30 minuten stabiliseren voordat de ischemie optreedt. Voer daarna een opname van 30 seconden uit om de basiswaarden voor leukocyte rolling en adherentie vast te stellen. Plaats voorzichtig een bemer-vatclip rond het meest proximale uiteinde van het blootgestelde cremasterweefsel met behulp van applicatietang.

Verwijder de vatklem na 30 minuten ischemie. Vervolgmetingen kunnen worden gedaan gedurende de gehele reperfusieperiode. Definieer voor de kwantificering van leukocyten-rolling een virtuele lijn die het vat verticaal doorsnijdt, waarbij deze lijn in alle opnames consistent blijft.

Tel handmatig het aantal rollende leukocyten dat binnen 30 seconden de lijn passeert. Definieer voor de kwantificering van adherente leukocyten een consistent bloedvatsegment van 200 micrometer in alle registraties.

Tel het aantal duidelijk zichtbare leukocyten dat gedurende 30 seconden statisch blijft. Representatieve resultaten worden in het beschreven protocol verstrekt. Hoewel ischemie-reperfusieschade is geïmpliceerd in diverse orgaansystemen, beschrijven we hier een methode om de interactie tussen leukocyten en het endotheel te analyseren bij reperfusieschade van skeletspierweefsel.

Dit is daarom bijzonder relevant voor flip-chirurgie, aangezien wordt aangenomen dat post-ischemische weefselschade aan andere organen dezelfde ontstekingsmechanismen omvat. De beschreven methode kan worden gebruikt om fundamentele inzichten te verkrijgen in pathologische mechanismen bij ischemische reperfusieschade. Het toepassen van ischemie op de m. cremaster kan eenvoudig worden uitgevoerd en weerspiegelt perfect klinisch relevante omstandigheden, zoals vrije flapchirurgie.

Bovendien kunnen modificaties zoals koude ischemie, warme ischemie of chromostere superfusie met stoffen die ontstekingen beïnvloeden, eenvoudig worden toegepast. Intra-orale injectie kan de methode van voorkeur zijn wanneer behandeling nodig is, uren of dagen voorafgaand aan de registratie.