Name: Nano-Fem: Eiwit Localization Met behulp van foto-geactiveerde Localization Microscopie en Electron Microscopy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: Leer de nano-FEM-methode voor eiwitlokalisatie in transgene nematoden met gecorreleerde fluorescentie- en elektronenmicroscopie. Deze techniek maakt nauwkeurige visualisatie van histonen in celkernen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Harald Hess en Eric Betzig voor toegang tot de PALM microscoop voor proof-of-principle experimenten, Richard Fetter voor het delen van fixatie-protocollen, reagentia en bemoediging. Wij danken Michael Davidson, Geraldine Seydoux, Stefan Eimer, Rudolf Leuba, Keith Nehrke, Christian Frøkjr-Jensen, Aude Ada-Nguema en Marc Hammarlund voor DNA-constructen. We danken ook Carl Zeiss Inc voor de toegang tot de Zeiss PAL-M, een beta-versie van de Zeiss ELYRA P.1 PALM microscoop.

<ol><li>Polishchuk, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).</li>
<li>Oberti, D., Kirschmann, M. A., Hahnloser, R. H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+microscopy+of+densely+labeled+projection+neurons+using+neural+tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Correlative microscopy of densely labeled projection neurons using neural tracers.</a> Front. Neuroanat. 4, 24(2010).</li>
<li>Bishop, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+branding+efficiently+correlates+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Near-infrared branding efficiently correlates light and electron microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 568-570 (2011).</li>
<li>Sims, P. A., Hardin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-integrated+transmission+electron+microscopy+images%3A+integrating+fluorescence+microscopy+with+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-integrated transmission electron microscopy images: integrating fluorescence microscopy with transmission electron microscopy.</a> Methods Mol. Biol. 369, 291-308 (2007).</li>
<li>Micheva, K., Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+tomography%3A+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li>
<li>Nixon, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+method+for+cryofixation+and+correlative+light%2C+electron+microscopy+and+tomography+of+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">A single method for cryofixation and correlative light, electron microscopy and tomography of zebrafish embryos.</a> Traffic. 10, 131-136 (2009).</li>
<li>Kukulski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+fluorescence+and+3D+electron+microscopy+with+high+sensitivity+and+spatial+precision%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision.</a> J. Cell Biol. 192, 111-119 (2011).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li>
<li>Weibull, C., Christiansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+proteins+and+membrane+lipids+during+low+temperature+embedding+of+biological+material+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Extraction of proteins and membrane lipids during low temperature embedding of biological material for electron microscopy.</a> J. Microsc. 142, 79-86 (1986).</li>
<li>Watanabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+localization+in+electron+micrographs+using+fluorescence+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy.</a> Nat. Methods. 8, 80-84 (2011).</li>
<li>F lling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+nanoscopy+by+ground-state+depletion+and+single-molecule+return%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return.</a> Nat. Methods. 5, 943-945 (2008).</li>
<li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198, 82-87 (2000).</li>
<li>Wombacher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+super-resolution+imaging+with+trimethoprim+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates.</a> Nature Methods. 7, 717-719 (2010).</li>
<li>Dertinger, T., Colyer, R., Iyer, G., Weiss, S., Enderlein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+background-free%2C+3D+super-resolution+optical+fluctuation+imaging+%28SOFI%29%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Fast, background-free, 3D super-resolution optical fluctuation imaging (SOFI).</a> PNAS. 106, 22287-22292 (2009).</li>
<li>Burnette, D. T., Sengupta, P., Dai, Y., Lippincott-Schwartz, J., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleaching%2Fblinking+assisted+localization+microscopy+for+superresolution+imaging+using+standard+fluorescent+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Bleaching/blinking assisted localization microscopy for superresolution imaging using standard fluorescent molecules.</a> PNAS. , (2011).</li>
<li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li>
</ol>

Productie en gratis toegang tot dit artikel wordt gesponsord door Carl Zeiss, Inc

Hier beschrijven we hoe u fluorescerende eiwitten te bewaren in plastic, lokaliseren de fluorescerende eiwitten in secties, en het imago van de ultrastructuur met behulp van elektronenmicroscopie. Eiwitten werden gelokaliseerd onder de diffractielimiet met behulp van PALM microscopie tot nanometer-resolutie. Om dit protocol aan te passen aan bepaalde exemplaren, moeten de volgende parameters worden overwogen: fluorofoor, kwantificering en uitlijning. De keuze van fluorescerend eiwit of organische fluorofoor afhankelijk van de toepassing en het modelsysteem. We hebben getest een verscheidenheid van fluorescerende eiwitten, met inbegrip van EGFP, YFP, Citrien, mEosFP, mEos2, tdEos, Morange, PA-mCherry en Dendra 12. Het behoud van fluorescentie van elk fluorofoor was vergelijkbaar, suggereert dat alle fluorescerende eiwitten kunnen worden bewaard volgens de beschreven werkwijze. We kozen tdEos omdat het goed uitgedrukt C. elegans, eiwitten bleven functioneel wanneer gefuseerd met tdEos, en omdat defotoactivering eigenschappen waren optimaal voor PALM microscopie. Echter, aggregatie of mislukte uitdrukking van tdEos is af en toe 12 waargenomen. Afhankelijk van de toepassing kan een andere fluorofoor beter geschikt. In veel gevallen is het niet nodig om een ​​foto-geactiveerde fluorescent eiwit te gebruiken. Eenvoudige correlatieve fluorescentie elektronenmicroscopie vereist geen foto-geactiveerde fluorescent eiwit. GFP of organische kleurstoffen kunnen worden gebruikt om beelden van fluorescentie-gemerkte eiwitten in de voorgaande hoofdstukken diffractiegrens. Bijvoorbeeld kan men een beeld axon in een neuropil gebruik van fluorescentiemicroscopie en correleren het fluorescentiesignaal met een bepaalde axon in een elektronenmicroscopische opname van de fluorescentie beeldvorming op een fluorescentiemicroscoop. Superresolutie andere technieken, zoals gestimuleerde emissie depletion microscopy (STED) 12 grondtoestand uitputting microscopie gevolgd door individuele molecule return (GSDIM) 13, engestructureerde verlichting microscopie (SIM) 14, vereisen geen foto-geactiveerde fluorescerende eiwitten. Bovendien superresolutie beeldvormingstechnieken die organische kleurstoffen 9,15,16 of de intrinsieke eigenschap van fluorescerende probes 17 worden toepasbaar zijn. In PALM, kan het aantal moleculen worden gekwantificeerd door fluorescentie van elk molecuul in ruimte en tijd gescheiden. Echter, kwantificering misleidend zijn om vier redenen: oxidatie, undercounting, overcounting, en overexpressie. Ten eerste kan een deel van de fluorescerende eiwitten worden gedenatureerd of geoxideerd tijdens monsterverwerking 5,12. Hoewel ~ 90% van het fluorescentiesignaal werd bewaard door fixatie en inbedding in ons protocol kan oxidatie van het fluorescerende eiwit later het monster is doorgesneden en het oppervlak blootgesteld aan zuurstof. Anderzijds de activering van foto-activeerbare eiwitten stochastisch en dus meerdere moleculen kan zijngeactiveerd in een gegeven diffractie beperkte plek 8. Fluorescentie van de meerdere moleculen verschijnt als een spot, en dus het totaal aantal eiwitten worden undercounted. Ten derde kan een soortgelijk probleem tot overcounting. In PALM, wordt elke fluorescerende eiwit gelokaliseerd en vervolgens op &quot;gewist&quot; door bleken. Echter, fluorescente eiwitten terug uit de donkere toestand, zonder permanent gebleekt 18. Dergelijke moleculen worden vervolgens meerdere keren geteld. Vierde gemerkte eiwitten worden uitgedrukt als transgenen en zijn vaak aanwezig in meerdere kopieën, wat kan leiden tot overexpressie. Daarom kan kwantificering van PALM worden gebruikt om te schatten maar niet nauwkeurig de aantal moleculen op een bepaalde locatie. De uitlijning van een PALM beeld met een elektronenmicrofoto ook een uitdaging omdat de resolutie verschil in licht-en elektronenmicroscopie en vervorming veroorzaakt door de elektronenbundel. Gouddeeltjes dienen als stevig localized de vaste markeringen in electronenmicroscoop. Echter fluoresecence van gouddeeltjes niet foto-geactiveerde, en weergegeven als een buigingsbegrensde vlek. Dus de plaatsing van een fluorescentiebeeld over een elektronenmicrofoto is een schatting. Verstoringen kunnen ook voortvloeien uit interacties van elektronen met het kunststof profiel. Acrylharsen zoals GMA minder stabiel onder de elektronenbundel en de afmetingen van de kunststof kan worden gewijzigd. Onder deze omstandigheden kan het uitlijnen van de fluorescentie met ultrastructuur vereisen niet-lineaire transformatie van de vaste markers.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum of uitrusting </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Hoge druk vriezer </td><td> ABRA </td><td> HPM 010 </td><td> Gehouden EMPACT en HPM 100 van Leica of hpf-01 van Wohlwend kunnen ook worden gebruikt. </td></tr><tr><td> Geautomatiseerde bevriezen substitutie-eenheid </td><td> Leica </td><td> AFS 2 </td><td> AFS 1 kan ook worden gebruikt. </td></tr><tr><td> Zeiss PALM </td><td> Zeiss </td><td> ELYRA P.1 </td><td> Nikon en Vutara verkopen ook commerciële PALM microscopen. </td></tr><tr><td> Scanning elektronenmicroscoop </td><td> FEI </td><td> Nova nano </td><td> Andere hoge-resolutie SEM microscopen worden gebruikt. </td></tr><tr><td> Aceton </td><td> EMS </td><td> RT10016 </td><td></td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 459844-1L </td><td></td></tr><tr><td> Osmium tetroxide </td><td> EMS </td><td> RT19134 </td><td></td></tr><tr><td> Kaliumpermanganaat </td><td> EMS </td><td> RT20200 </td><td></td></tr><tr><td> Albumine uit runderserum </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3059-50G </td><td></td></tr><tr><td> Uranylacetaat </td><td> Polysciences </td><td> 21.447-25 </td><td> pH van uranylacetaat van dit bedrijf is iets hoger. </td></tr><tr><td> Glycolmethacrylaat (GMA) </td><td> SPI </td><td> 02630-AA </td><td> Lage zuurgraad, TEM grade. </td></tr><tr><td> N, N-Dimethyl-p-toluidine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9912 </td><td></td></tr><tr><td> Cryobuisjes </td><td> Nalgene </td><td> 5000-0020 </td><td></td></tr><tr><td> Glazen flacons </td><td> EMS </td><td> 72632 </td><td></td></tr><tr><td> Aclar film </td><td> EMS </td><td> 50.425-10 </td><td></td></tr><tr><td> BEEM capsule </td><td> EBSciences </td><td> TC </td><td> Polypropyleen </td></tr><tr><td> 3/8 &quot;DISC stoten </td><td> Ted Pella </td><td> 54741 </td><td></td></tr><tr><td> Gouden nanodeeltjes </td><td> microsferen-nanospheres.com </td><td> 790122-010 </td><td> Vraag 2x geconcentreerde oplossing </td></tr></tbody></table>

nano-fem: eiwit localization met behulp van foto-geactiveerde localization microscopie en electron microscopy

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Kaart brengen van de verdeling van eiwitten is essentieel voor het begrijpen van de functie van eiwitten in een cel. Fluorescentie microscopie wordt veelvuldig gebruikt voor eiwit lokalisatie, maar subcellulaire is vaak afwezig in fluorescentie beelden. Immuno-elektron microscopie, anderzijds, kunnen lokaliseren eiwitten, maar de techniek is beperkt door een gebrek aan verenigbare antilichamen slecht behoud van de morfologie en omdat de meeste antigenen niet zijn blootgesteld aan het preparaatoppervlak. Correlatieve benaderingen kunnen verwerven van de fluorescentie beeld van een hele cel eerste, hetzij van immuno-fluorescentie of genetisch gemerkte eiwitten. Het monster wordt vervolgens gefixeerd en ingebed voor elektronenmicroscopie, en de beelden worden gecorreleerd 1-3. Echter, de lage resolutie fluorescentie beeld en het gebrek van de vaste markeringen de weg aan de precieze lokalisatie van eiwitten. Als alternatief kan fluorescentie beeldvorming worden gedaan na het behoud van het model in kunststof. Indeze benadering het blok is verdeeld, en fluorescentiebeelden en elektronenmicrofoto&#39;s van dezelfde sectie gecorreleerd 4-7. De diffractielimiet van licht in de overeenkomende afbeelding verbergt de locaties van individuele moleculen en de fluorescentie vaak uitstrekt voorbij de grens van de cel. Nano-resolutie fluorescentie elektronenmicroscopie (nano-FEM) is ontworpen voor het lokaliseren van eiwitten op nano-schaal door beeldvorming die zelfde delen met behulp van foto-geactiveerde lokalisatie microscopie (PALM) en elektronenmicroscopie. PALM overwint de diffractiegrens door beeldvorming individuele fluorescerende eiwitten en vervolgens de kaart brengen zwaartepunt van elk fluorescerende vlek 8-10. We schetsen de nano-FEM techniek in vijf stappen. Eerst wordt het monster gefixeerd en ingebed onder omstandigheden die de fluorescentie van gelabelde eiwitten behouden. Anderzijds het hars blokken ultradunne coupes in segmenten (70-80 nm) die gemonteerdeen dekglas. Ten derde wordt de fluorescentie afgebeeld in deze gebieden af ​​met de Zeiss PALM microscoop. Ten vierde zijn electron dichte structuren afgebeeld in dezelfde profielen met een scanning elektronenmicroscoop. Vijfde, de fluorescentie en electronenmicroscoop uitgelijnd met gouddeeltjes als markers vertrouwenspunt. Samengevat kunnen de subcellulaire lokalisatie van fluorescent gemerkte eiwitten worden bepaald nanometerresolutie in ongeveer een week.

We beschrijven een werkwijze voor het lokaliseren van fluorescent gemerkte eiwitten in electronenmicroscoop. Fluorescentie wordt eerst gelokaliseerd met foto-geactiveerde lokalisatie microscopie op ultradunne secties. Deze beelden worden dan uitgelijnd op elektronenmicrofoto&#39;s van dezelfde sectie.

Nano-Fem: Eiwit Localization Met behulp van foto-geactiveerde Localization Microscopie en Electron Microscopy

Het in kaart brengen van de distributie van eiwitten is essentieel voor het begrijpen van de functie van eiwitten in een cel. Fluorescentiemicroscopie wordt uitgebreid gebruikt voor ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om eiwitten en elektronenmicrografen te lokaliseren met behulp van gecorreleerde fluorescentie- en elektronenmicroscopie. Deze methode, bekend als nano FEM, wordt gebruikt om eiwitten in C. elegans te lokaliseren. Eerst wordt een transgene worm die histon TD-eos tot expressie brengt, ingebed in plastic en in coupes gesneden.Elke sectie wordt gefotografeerd met zowel foto-geactiveerde lokalisatiemicroscopie (PALM) als scanning elektronenmicroscopie. De twee micrografieën van elke sectie worden in Photoshop uitgelijnd met behulp van fiduciale markers. De correlatieve afbeelding toont de lokalisatie van histonmoleculen in de nucleus.Het belangrijkste voordeel van de techniek die we vandaag zullen beschrijven, is dat we in plaats van immuno-EM gebruikmaken van genetisch gecodeerde fluorescentie, zodat elk eiwit is gekoppeld aan een fluorescent eiwit. Bij immuno-EM kunnen veel antilichamen niet reageren met plastics. Het is simpelweg niet compatibel, en als dat wel zo is, kunnen de antilichamen niet diep in de sectie doordringen waar de antigenen zich bevinden.Door gebruik te maken van fluorescerende eiwitten wordt elk eiwit gemarkeerd met een fluorofoor. Vandaag zal Shige Wbi deze techniek demonstreren. De volgende procedure wordt gedemonstreerd met transgene nematoden die histonen tot expressie brengen die zijn gemarkeerd met het fluorescerende eiwit TDE os.Voor deze demonstratie gebruiken we bacteria als cryoprotectant, maar u kunt ook 20% BSA gebruiken voor het invriezen van sea elegance. Vul een uur voor de vries-substitutie het automatische vries-substitutieapparaat of een FS-apparaat met vloeibare stikstof. Bereid daarnaast vooraf de benodigde fixatievloeistoffen voor volgens de instructies in het bijbehorende document, bewaar de fixatievloeistoffen in aliquots van één milliliter in cryovials en plaats deze in vloeibare stikstof tot aan gebruik.Gebruik een schilderspenseel om dieren van een bacteriegazon te scheppen en breng ze over om een monsterhouder van 100 micron te vullen. Vul de cup iets te ruim om er zeker van te zijn dat er geen luchtbellen aanwezig zijn. Zodra dit is gebeurd, plaatst u de monstercup in de armaturen van een hogedrukvriezer om deze te bevriezen. Breng het monster vervolgens onmiddellijk over naar een bad met vloeibare stikstof naast de vrieskamer.Gebruik vervolgens een pincet en een tweede pincet om het monster over te brengen naar een cryovial met fixatiemiddelen. Zorg ervoor dat het monster te allen tijde onder de vloeibare stikstof blijft. Herhaal dit proces voor elk monster en plaats daarna alle cryovials in een FS-unit.Zodra alle cryovials in een FS-unit zijn geplaatst, start u het programma. Het vries- en verwerkingsprotocol wordt in dit diagram weergegeven. Tijdens de initiële incubatie bij min 90 graden Celsius wordt het vitreus ijs vervangen door het fixatief in aceton.Wanneer de temperatuur van het monster vervolgens stijgt, zorgt het fixatiemiddel in het vloeibare aceton voor cross-linking van het monster om de structuur te behouden. Wanneer de temperatuur in de FS-eenheid -60 °C bereikt, plaatst u scintillatieflacons met 20 mL 95% aceton in de FS om ze te koelen. Wanneer de temperatuur vervolgens -50 °C bereikt, gebruikt u een Pasteur-pipet met een P 200-tip om het fixatiemiddel te verwijderen en voegt u ongeveer 1 mL van het vooraf gekoelde 95% aceton toe aan elk monster. Gal.Herhaal dit proces elke 20 minuten gedurende twee uur. Plaats daarnaast, tijdens de incubatie bij -50 °C, een scintillatieflacon met 20 milliliter 0,1% urinaalacetaat in 95% aceton in de FS-kamer om deze voor te koelen tot -50 °C. Voeg na de laatste acetonwas vervolgens ongeveer één milliliter urinaalacetaatoplossing toe aan elke flacon om het monster te kleuren en zo het membraancontrast te verbeteren.Als het programma is gepauzeerd, start het dan opnieuw op. Wanneer de temperatuur minus 40 °C bereikt, plaatst u scintillatiebuisjes met 95% ethanol in de FS-kamer. Wanneer de temperatuur minus 30 °C bereikt, gebruikt u een Pasteur-pipet om het urine-acetaat elke 20 minuten gedurende twee uur te vervangen door 95% ethanol.Het is belangrijk om in deze stap ethanol te gebruiken, aangezien de hars niet zal polymeriseren in de aanwezigheid van aceton. In het volgende deel van het protocol worden de specimens ingebed in plastic terwijl de specimens op -30 °C zijn. Vervang in de FS de 95%ethanol door vooraf gekoelde 30%glycolmethacrylaat-hars of GMA in 95%ethanol; vervang na drie tot vijf uur de 30%GMA door 70%GMA; verwijder na vier tot zes uur de 70%GMA en incubeer de specimens gedurende de nacht in 97%GMA.De stapsgewijze verhoging van de GMA-concentratie maakt de penetratie van het medium in de weefsels mogelijk. Let op dat omdat er 3% water aan de GMA-hars wordt toegevoegd, 97% GMA niet wordt verdund. Verplaats de monsters de volgende dag met ethanol met behulp van een Pasteurpipet naar een inbedmal in de A FS, plaats de monsters in de inbedmal en vervang vervolgens de 97% GMA drie keer in zes uur tijd door vers bereide GMA bij minus 30 graden celsius.Tik na de derde uitwisseling op de bacteriële matrix om het specimen van het cryoprotectant te scheiden. Voeg de initiator nn-dimethyluuridine toe aan de 97%GMA in een ventilatieflacon. De hoeveelheid toegevoegde initiator is 1,5 µL per 1 mL GMA; voeg de GMA-oplossing onmiddellijk toe aan elke inbeddingsmal en positioneer de dieren in de mal zodat deze gelijkmatig verdeeld zijn.Start het programma opnieuw zodat de temperatuur stijgt naar -20 °C. Hoewel de hars binnen één uur snel polymeriseert, dient u het plastic een nacht lang te laten uitharden bij -20 °C, om er zeker van te zijn dat het volledig gepolymeriseerd is.Zodra het plastic is uitgehard, dient het preparaat te worden bewaard in een vacuümzak gevuld met stikstofgas bij -20 °C. Het insnijden van het in GMA ingebedde preparaat dient vervolgens te worden uitgevoerd zoals beschreven in het bijbehorende document voor photo activated localization microscopy of PALM-imaging. Het microscoopplan moet worden ingesteld met de EMCCD-camera op -70 °C of lager.Breng met een pipette ongeveer 50 µL van een oplossing van 100 nm gouddeeltjes met een concentratie van 1 × 10¹⁰ deeltjes/mL aan op het te beelden monster. Plaats een zwarte afdekkap over de monsters en laat de oplossing 30 seconden rusten op het dekglas. Verwijder de goudoplossing door deze naar de rand van het dekglas te blazen en absorbeer de vloeistof met een Kimwipe.Breng vervolgens vacuümvet aan op een ronde dekglashouder en plaats het dekglas. Breng immersieolie aan op de onderzijde van het dekglas. Schuif dit direct onder het monster.Plaats de monsterhouder in de sleuf op de tafel van de microscoop en stel deze zo af dat deze stevig vastzit en de coupes centraal boven het objectief staan. Wees extra voorzichtig om de objectieven niet aan te raken. Lokaliseer vervolgens de coupes met behulp van een 10 x objectieflens en helderveldverlichting.Schakel vervolgens over naar de 100 x objectieflens en stel deze scherp op het preparaat. Indien nodig kan worden overgeschakeld op fluorescentieverlichting met de 488 nanometer laser, waarbij de intensiteit op 10% wordt ingesteld. Laat vijf minuten verstrijken zodat de temperatuur van het monster kan equilibreren. Identificeer vervolgens de regio's met de sterkste fluorescentie en stel deze scherp.Zet de lasers op 561 nanometer en verhoog de intensiteit naar 100%. Om de achtergrondautofluorescentie weg te bleken, wordt het monster gedurende ongeveer twee minuten gebleekt. Als de focus tijdens het bleken verandert, laat dan vijf minuten verstrijken voordat de focus wordt aangepast en er beelden worden vastgelegd. Wanneer het bleken is voltooid, activeert u de 405 nanometer laser en stelt u deze in op de laagste intensiteit.Start met het verzamelen van de beelden met een snelheid van 20 frames per seconde. Verzamel voldoende frames om het doel van het experiment te bereiken. Er worden 5.000 tot 6.000 frames opgenomen om de lokalisatie van 584 histoneproteïnen binnen een celkern te bepalen.Zodra er 5.000 frames zijn verzameld, worden alle moleculen geïdentificeerd en in kaart gebracht door de imaging-software. Het uiteindelijke fluorescentiebeeld, of het zogenaamde some turf-beeld, is een compositie van alle fluorescentie die door de camera is gedetecteerd. In contrast hiermee brengt het palm-beeld de OID van elke fluorescentievlek in kaart en geeft enkel aan waar elk eiwit zich bevindt.Kleur de coupes vóór de SEM-beeldvorming gedurende vier minuten met 2,5% uranylacetaat in water. Spoel het uranylacetaat grondig af met gefiltreerd milli-Q water. Nadat de coupes zijn opgedroogd, wordt de dekglasplaat met een sputter met koolstof gecoat totdat deze vrij donker wordt.Breng aan het uiteinde van het dekglas en op de metalen stub koolstofgeleidende tape aan, zodat de elektronen die zich op het oppervlak van het dekglas ophopen, worden geaard. Plaats het dekglas in de SEM-kamer en lokaliseer het preparaat in de microscoop. Maak een afbeelding van het preparaat bij lage vergroting, zoom vervolgens in op het gebied van interesse en maak afbeeldingen bij hoge vergroting.Herhaal dit proces met een nieuwe sectie totdat alle secties zijn afgebeeld. Vervolgens moeten de palm- en EM-beelden worden uitgelijnd. Open hiervoor eerst de verkregen SEM-beelden in Photoshop.Maak een nieuw venster met afmetingen van 5.000 bij 5.000 pixels en een resolutie van 300 pixels per inch. Kopieer de SEM-afbeelding met de lage vergroting in het nieuwe venster. Gebruik het commando 'vrije transformatie' (free transform) onder het bewerkingsmenu om de afbeelding te schalen zodat deze het volledige venster vult.Kopieer vervolgens de SEM-beelden met een hogere vergroting en schaal en transformeer deze indien nodig. Selecteer beeldrotatie in de vervolgkeuzebalk van het beeld en spiegel het sum turf-beeld horizontaal. Kopieer en plak het sum turf-beeld in een nieuwe laag.Gebruik het commando 'vrije transformatie' (free transform) onder het bewerkingsmenu om de afbeelding zodanig te schalen dat deze ongeveer dezelfde grootte heeft als de elektronenmicrografie bij lage vergroting. Roteer vervolgens de afbeelding indien nodig, zodat de fluorescentie van de goudpartikels overeenkomt met de bijbehorende structuren die in SEM zijn gevisualiseerd. Kopieer daarna de afbeelding van de handpalm naar een nieuwe laag en pas dezelfde transformatie toe om een afbeelding met een hogere vergroting te extraheren.Zoom in op het gebied van interesse en kopieer de afbeelding van de palm uit dit gebied. Plak de afbeelding in een SEM-afbeelding met een hogere resolutie voor presentatie. Er moet een gradiënttransparantie worden toegepast op de palm-afbeelding, zodat alleen de zwarte achtergrond, maar niet de palmsignalen, transparant worden.Kopieer de getransformueerde afbeelding van de handpalm naar een nieuwe laag. Selecteer de signalen van de handpalm, maar niet de achtergrond, door gebruik te maken van 'kleurbereik' (color range) in het selectiemenu. Selecteer vervolgens een achtergrondpixel als referentie en activeer de optie 'omkeren' (invert).Knip de gewenste palmsignalen uit en plak deze op een nieuwe laag. Pas transparantie toe op de achtergrondlaag en stel deze in op 10%. Dit maakt visualisatie van de palmsignalen mogelijk door de achtergrond transparant te maken zonder de intensiteit aan te tasten. Histonproteïne.His 11-getagde TD eos werd stabiel tot expressie gebracht in de nematode c elgan, en de transgene dieren werden verwerkt en gefotografeerd volgens het in deze video beschreven protocol. PALM- en elektronenmicrografieën werden verkregen uit dezelfde sectie. De goudnanodeeltjes, die zowel in de fluorescentie- als in de elektronenmicrografieën zichtbaar zijn, werden vervolgens gebruikt om de twee beelden uit te lijnen.Hier zoomen we in op een gebied nabij de bovenkant van de micrografie. Zoals hier te zien is: subcellulaire details zoals een celkern.Een nucleus, nucleaire poriën en het endoplasmatisch reticulum zijn waarneembaar. Echter zijn de gelabelde histonmoleculen uitsluitend gelokaliseerd in de nucleus, maar niet buiten de nucleus. Zoals verwacht maakt de correlatieve palm- en elektronenmicroscopie dus proteïnelokalisatie met de hoogste resolutie mogelijk. Na het uitvoeren van deze procedure kunnen deze secties met de proteïneverdeling worden genomen en gestapeld met behulp van array-tomografie, zodat een driedimensionale structuur kan worden gegenereerd die laat zien waar de proteïnen in de cel zijn verdeeld.En onthoud dat osmiumtetroxide een zeer gevaarlijke chemische stof is en dat u altijd handschoenen moet dragen.

nano-fem-protein-localization-using-photo-activated-localization

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video describes BiFC-PALM ― a combination of photoactivated localization microscopy and bimolecular fluorescence complementation ― to assess protein-protein interactions. BiFC involves the fusion of two fluorescent protein fragments with two interacting proteins of interest. When the two proteins interact, the fragments are brought into proximity, which allows the two parts to come together and reconstitute a functional fluorescent protein. The fluorescence of a single fluorophore is...

Bimolecular Fluorescence Complementation-Coupled Photoactivated Localization Microscopy

We demonstreren het gebruik van fluorescentie foto activerings lokalisatie microscopie (FPALM) om gelijktijdig meerdere soorten fluorescerend gelabelde moleculen binnen cellen af te beelden. De beschreven technieken leveren de lokalisatie op van duizenden tot honderdduizenden individueel fluorescent gelabelde eiwitten, met een precisie van tientallen nanometer binnen enkele cellen.

Gelijktijdige Multicolor beeldvorming van biologische structuren met fluorescentie Fotoactivatie Lokalisatie Microscopie

Fotogeactiveerde lokalisatie microscopie (PALM) in combinatie met single-molecule-tracking maakt directe observatie en kwantificering van eiwit-DNA-interacties in levende Escherichia coli cellen.

Visualiseren eiwit-DNA-interacties in levende bacteriële cellen met behulp Photoactivated Enkelmolecuul Tracking

Single fluoroforen kunnen worden gelokaliseerd met nanometer precisie met behulp van FIONA. Hier een overzicht van de FIONA techniek is gemeld, en hoe FIONA experimenten uit te voeren wordt beschreven.

Fluorescentie Imaging met One-nanometer nauwkeurigheid (FIONA)

Eiwit-eiwit-interacties worden in cellen met een ruimtelijke resolutie van nanometer gevisualiseerd door bimoleculaire fluorescentie-complementatie (BiFC) te combineren met fotogeactiveerde lokalisatiemicroscopie (PALM). Hier wordt het gebruik van BiFC-PALM beschreven voor het beeldvormen van Ras-Raf-interacties in U2OS-cellen voor het visualiseren van de nanoschalige clustervorming en diffusie van individuele Ras-Raf-complexen.

Fotogeactiveerde Localization Microscopie met Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC-PALM)

Hier we illustreren hoe enkel molecuul foto-geactiveerde lokalisatie microscopie kan worden uitgevoerd op de motorische zenuw-terminal van een levende Drosophila melanogaster derde instar larve.

In Vivo Single-molecuul volgen bij de Terminal van de presynaptische motorische zenuw Drosophila

We beschrijven hoe micro- en photomanipulation technieken zoals FRAP en photoactivation inschakelen de bepaling van de parameters van de beweeglijkheid en de spatio dynamiek van eiwitten in het migreren van cellen. Experimentele uitlezingen omvatten subcellular dynamiek en omzet van beweeglijkheid toezichthouders of van de onderliggende actine cytoskelet.

Micromanipulation technieken waardoor analyse van morfogenetische dynamiek en een omzet van Cytoskeletal regelgevers

Hier presenteren we een protocol voor Multi-Color lokalisatie van één membraaneiwitten in organellen van levende cellen. Als u wilt koppelen fluorophores, worden zelf labeling eiwitten gebruikt. Eiwitten, gelegen in verschillende membranen compartimenten van de dezelfde organel, kunnen worden gelokaliseerd met een nauwkeurigheid van ~ 18 nm.

Multi-Color lokalisatie microscopie van één membraaneiwitten in organellen van de cellen van levende zoogdieren

Dit protocol beschrijft de cryoAPEX-methode, waarbij een APEX2-gelabeld membraaneiwit kan worden gelokaliseerd door transmissieelektronenmicroscopie binnen een optimaal bewaarde celultrastructuur.

De CryoAPEX-methode voor elektronenmicroscopieanalyse van membraaneiwitlokalisatie binnen ultrastructureel bewaarde cellen

Het huidige protocol beschrijft een kloonbare elektronenmicroscopie-etiketteringstechnologie voor het detecteren van metallothioneïne-gelabelde eiwitten in cellen met behulp van een nieuwe op autonucleatieonderdrukkingsmechanisme gebaseerde gouden nanodeeltjessynthesetechniek.

Directe synthese van EM-zichtbare gouden nanodeeltjes in cellen voor eiwitlokalisatieanalyse met goed bewaarde ultrastructuur

Leer de nano-FEM-methode voor eiwitlokalisatie in transgene nematoden met gecorreleerde fluorescentie- en elektronenmicroscopie. Deze techniek maakt nauwkeurige visualisatie van histonen in celkernen mogelijk.

Nano-Fem: Eiwit Localization Met behulp van foto-geactiveerde Localization Microscopie en Electron Microscopy

Meer video's verkennen