Nano-Fem: Eiwit Localization Met behulp van foto-geactiveerde Localization Microscopie en Electron Microscopy

Het algemene doel van het volgende experiment is om eiwitten en elektronenmicrografen te lokaliseren met behulp van gecorreleerde fluorescentie- en elektronenmicroscopie. Deze methode, bekend als nano FEM, wordt gebruikt om eiwitten in C. elegans te lokaliseren. Eerst wordt een transgene worm die histon TD-eos tot expressie brengt, ingebed in plastic en in coupes gesneden.

Elke sectie wordt gefotografeerd met zowel foto-geactiveerde lokalisatiemicroscopie (PALM) als scanning elektronenmicroscopie. De twee micrografieën van elke sectie worden in Photoshop uitgelijnd met behulp van fiduciale markers. De correlatieve afbeelding toont de lokalisatie van histonmoleculen in de nucleus.

Het belangrijkste voordeel van de techniek die we vandaag zullen beschrijven, is dat we in plaats van immuno-EM gebruikmaken van genetisch gecodeerde fluorescentie, zodat elk eiwit is gekoppeld aan een fluorescent eiwit. Bij immuno-EM kunnen veel antilichamen niet reageren met plastics. Het is simpelweg niet compatibel, en als dat wel zo is, kunnen de antilichamen niet diep in de sectie doordringen waar de antigenen zich bevinden.

Door gebruik te maken van fluorescerende eiwitten wordt elk eiwit gemarkeerd met een fluorofoor. Vandaag zal Shige Wbi deze techniek demonstreren. De volgende procedure wordt gedemonstreerd met transgene nematoden die histonen tot expressie brengen die zijn gemarkeerd met het fluorescerende eiwit TDE os.

Voor deze demonstratie gebruiken we bacteria als cryoprotectant, maar u kunt ook 20% BSA gebruiken voor het invriezen van sea elegance. Vul een uur voor de vries-substitutie het automatische vries-substitutieapparaat of een FS-apparaat met vloeibare stikstof. Bereid daarnaast vooraf de benodigde fixatievloeistoffen voor volgens de instructies in het bijbehorende document, bewaar de fixatievloeistoffen in aliquots van één milliliter in cryovials en plaats deze in vloeibare stikstof tot aan gebruik.

Gebruik een schilderspenseel om dieren van een bacteriegazon te scheppen en breng ze over om een monsterhouder van 100 micron te vullen. Vul de cup iets te ruim om er zeker van te zijn dat er geen luchtbellen aanwezig zijn. Zodra dit is gebeurd, plaatst u de monstercup in de armaturen van een hogedrukvriezer om deze te bevriezen. Breng het monster vervolgens onmiddellijk over naar een bad met vloeibare stikstof naast de vrieskamer.

Gebruik vervolgens een pincet en een tweede pincet om het monster over te brengen naar een cryovial met fixatiemiddelen. Zorg ervoor dat het monster te allen tijde onder de vloeibare stikstof blijft. Herhaal dit proces voor elk monster en plaats daarna alle cryovials in een FS-unit.

Zodra alle cryovials in een FS-unit zijn geplaatst, start u het programma. Het vries- en verwerkingsprotocol wordt in dit diagram weergegeven. Tijdens de initiële incubatie bij min 90 graden Celsius wordt het vitreus ijs vervangen door het fixatief in aceton.

Wanneer de temperatuur van het monster vervolgens stijgt, zorgt het fixatiemiddel in het vloeibare aceton voor cross-linking van het monster om de structuur te behouden. Wanneer de temperatuur in de FS-eenheid -60 °C bereikt, plaatst u scintillatieflacons met 20 mL 95% aceton in de FS om ze te koelen. Wanneer de temperatuur vervolgens -50 °C bereikt, gebruikt u een Pasteur-pipet met een P 200-tip om het fixatiemiddel te verwijderen en voegt u ongeveer 1 mL van het vooraf gekoelde 95% aceton toe aan elk monster. Gal.

Herhaal dit proces elke 20 minuten gedurende twee uur. Plaats daarnaast, tijdens de incubatie bij -50 °C, een scintillatieflacon met 20 milliliter 0,1% urinaalacetaat in 95% aceton in de FS-kamer om deze voor te koelen tot -50 °C. Voeg na de laatste acetonwas vervolgens ongeveer één milliliter urinaalacetaatoplossing toe aan elke flacon om het monster te kleuren en zo het membraancontrast te verbeteren.

Als het programma is gepauzeerd, start het dan opnieuw op. Wanneer de temperatuur minus 40 °C bereikt, plaatst u scintillatiebuisjes met 95% ethanol in de FS-kamer. Wanneer de temperatuur minus 30 °C bereikt, gebruikt u een Pasteur-pipet om het urine-acetaat elke 20 minuten gedurende twee uur te vervangen door 95% ethanol.

Het is belangrijk om in deze stap ethanol te gebruiken, aangezien de hars niet zal polymeriseren in de aanwezigheid van aceton. In het volgende deel van het protocol worden de specimens ingebed in plastic terwijl de specimens op -30 °C zijn. Vervang in de FS de 95%ethanol door vooraf gekoelde 30%glycolmethacrylaat-hars of GMA in 95%ethanol; vervang na drie tot vijf uur de 30%GMA door 70%GMA; verwijder na vier tot zes uur de 70%GMA en incubeer de specimens gedurende de nacht in 97%GMA.

De stapsgewijze verhoging van de GMA-concentratie maakt de penetratie van het medium in de weefsels mogelijk. Let op dat omdat er 3% water aan de GMA-hars wordt toegevoegd, 97% GMA niet wordt verdund. Verplaats de monsters de volgende dag met ethanol met behulp van een Pasteurpipet naar een inbedmal in de A FS, plaats de monsters in de inbedmal en vervang vervolgens de 97% GMA drie keer in zes uur tijd door vers bereide GMA bij minus 30 graden celsius.

Tik na de derde uitwisseling op de bacteriële matrix om het specimen van het cryoprotectant te scheiden. Voeg de initiator nn-dimethyluuridine toe aan de 97%GMA in een ventilatieflacon. De hoeveelheid toegevoegde initiator is 1,5 µL per 1 mL GMA; voeg de GMA-oplossing onmiddellijk toe aan elke inbeddingsmal en positioneer de dieren in de mal zodat deze gelijkmatig verdeeld zijn.

Start het programma opnieuw zodat de temperatuur stijgt naar -20 °C. Hoewel de hars binnen één uur snel polymeriseert, dient u het plastic een nacht lang te laten uitharden bij -20 °C, om er zeker van te zijn dat het volledig gepolymeriseerd is.

Zodra het plastic is uitgehard, dient het preparaat te worden bewaard in een vacuümzak gevuld met stikstofgas bij -20 °C. Het insnijden van het in GMA ingebedde preparaat dient vervolgens te worden uitgevoerd zoals beschreven in het bijbehorende document voor photo activated localization microscopy of PALM-imaging. Het microscoopplan moet worden ingesteld met de EMCCD-camera op -70 °C of lager.

Breng met een pipette ongeveer 50 µL van een oplossing van 100 nm gouddeeltjes met een concentratie van 1 × 10¹⁰ deeltjes/mL aan op het te beelden monster. Plaats een zwarte afdekkap over de monsters en laat de oplossing 30 seconden rusten op het dekglas. Verwijder de goudoplossing door deze naar de rand van het dekglas te blazen en absorbeer de vloeistof met een Kimwipe.

Breng vervolgens vacuümvet aan op een ronde dekglashouder en plaats het dekglas. Breng immersieolie aan op de onderzijde van het dekglas. Schuif dit direct onder het monster.

Plaats de monsterhouder in de sleuf op de tafel van de microscoop en stel deze zo af dat deze stevig vastzit en de coupes centraal boven het objectief staan. Wees extra voorzichtig om de objectieven niet aan te raken. Lokaliseer vervolgens de coupes met behulp van een 10 x objectieflens en helderveldverlichting.

Schakel vervolgens over naar de 100 x objectieflens en stel deze scherp op het preparaat. Indien nodig kan worden overgeschakeld op fluorescentieverlichting met de 488 nanometer laser, waarbij de intensiteit op 10% wordt ingesteld. Laat vijf minuten verstrijken zodat de temperatuur van het monster kan equilibreren. Identificeer vervolgens de regio's met de sterkste fluorescentie en stel deze scherp.

Zet de lasers op 561 nanometer en verhoog de intensiteit naar 100%. Om de achtergrondautofluorescentie weg te bleken, wordt het monster gedurende ongeveer twee minuten gebleekt. Als de focus tijdens het bleken verandert, laat dan vijf minuten verstrijken voordat de focus wordt aangepast en er beelden worden vastgelegd. Wanneer het bleken is voltooid, activeert u de 405 nanometer laser en stelt u deze in op de laagste intensiteit.

Start met het verzamelen van de beelden met een snelheid van 20 frames per seconde. Verzamel voldoende frames om het doel van het experiment te bereiken. Er worden 5.000 tot 6.000 frames opgenomen om de lokalisatie van 584 histoneproteïnen binnen een celkern te bepalen.

Zodra er 5.000 frames zijn verzameld, worden alle moleculen geïdentificeerd en in kaart gebracht door de imaging-software. Het uiteindelijke fluorescentiebeeld, of het zogenaamde some turf-beeld, is een compositie van alle fluorescentie die door de camera is gedetecteerd. In contrast hiermee brengt het palm-beeld de OID van elke fluorescentievlek in kaart en geeft enkel aan waar elk eiwit zich bevindt.

Kleur de coupes vóór de SEM-beeldvorming gedurende vier minuten met 2,5% uranylacetaat in water. Spoel het uranylacetaat grondig af met gefiltreerd milli-Q water. Nadat de coupes zijn opgedroogd, wordt de dekglasplaat met een sputter met koolstof gecoat totdat deze vrij donker wordt.

Breng aan het uiteinde van het dekglas en op de metalen stub koolstofgeleidende tape aan, zodat de elektronen die zich op het oppervlak van het dekglas ophopen, worden geaard. Plaats het dekglas in de SEM-kamer en lokaliseer het preparaat in de microscoop. Maak een afbeelding van het preparaat bij lage vergroting, zoom vervolgens in op het gebied van interesse en maak afbeeldingen bij hoge vergroting.

Herhaal dit proces met een nieuwe sectie totdat alle secties zijn afgebeeld. Vervolgens moeten de palm- en EM-beelden worden uitgelijnd. Open hiervoor eerst de verkregen SEM-beelden in Photoshop.

Maak een nieuw venster met afmetingen van 5.000 bij 5.000 pixels en een resolutie van 300 pixels per inch. Kopieer de SEM-afbeelding met de lage vergroting in het nieuwe venster. Gebruik het commando 'vrije transformatie' (free transform) onder het bewerkingsmenu om de afbeelding te schalen zodat deze het volledige venster vult.

Kopieer vervolgens de SEM-beelden met een hogere vergroting en schaal en transformeer deze indien nodig. Selecteer beeldrotatie in de vervolgkeuzebalk van het beeld en spiegel het sum turf-beeld horizontaal. Kopieer en plak het sum turf-beeld in een nieuwe laag.

Gebruik het commando 'vrije transformatie' (free transform) onder het bewerkingsmenu om de afbeelding zodanig te schalen dat deze ongeveer dezelfde grootte heeft als de elektronenmicrografie bij lage vergroting. Roteer vervolgens de afbeelding indien nodig, zodat de fluorescentie van de goudpartikels overeenkomt met de bijbehorende structuren die in SEM zijn gevisualiseerd. Kopieer daarna de afbeelding van de handpalm naar een nieuwe laag en pas dezelfde transformatie toe om een afbeelding met een hogere vergroting te extraheren.

Zoom in op het gebied van interesse en kopieer de afbeelding van de palm uit dit gebied. Plak de afbeelding in een SEM-afbeelding met een hogere resolutie voor presentatie. Er moet een gradiënttransparantie worden toegepast op de palm-afbeelding, zodat alleen de zwarte achtergrond, maar niet de palmsignalen, transparant worden.

Kopieer de getransformueerde afbeelding van de handpalm naar een nieuwe laag. Selecteer de signalen van de handpalm, maar niet de achtergrond, door gebruik te maken van 'kleurbereik' (color range) in het selectiemenu. Selecteer vervolgens een achtergrondpixel als referentie en activeer de optie 'omkeren' (invert).

Knip de gewenste palmsignalen uit en plak deze op een nieuwe laag. Pas transparantie toe op de achtergrondlaag en stel deze in op 10%. Dit maakt visualisatie van de palmsignalen mogelijk door de achtergrond transparant te maken zonder de intensiteit aan te tasten. Histonproteïne.

His 11-getagde TD eos werd stabiel tot expressie gebracht in de nematode c elgan, en de transgene dieren werden verwerkt en gefotografeerd volgens het in deze video beschreven protocol. PALM- en elektronenmicrografieën werden verkregen uit dezelfde sectie. De goudnanodeeltjes, die zowel in de fluorescentie- als in de elektronenmicrografieën zichtbaar zijn, werden vervolgens gebruikt om de twee beelden uit te lijnen.

Hier zoomen we in op een gebied nabij de bovenkant van de micrografie. Zoals hier te zien is: subcellulaire details zoals een celkern.

Een nucleus, nucleaire poriën en het endoplasmatisch reticulum zijn waarneembaar. Echter zijn de gelabelde histonmoleculen uitsluitend gelokaliseerd in de nucleus, maar niet buiten de nucleus. Zoals verwacht maakt de correlatieve palm- en elektronenmicroscopie dus proteïnelokalisatie met de hoogste resolutie mogelijk. Na het uitvoeren van deze procedure kunnen deze secties met de proteïneverdeling worden genomen en gestapeld met behulp van array-tomografie, zodat een driedimensionale structuur kan worden gegenereerd die laat zien waar de proteïnen in de cel zijn verdeeld.

En onthoud dat osmiumtetroxide een zeer gevaarlijke chemische stof is en dat u altijd handschoenen moet dragen.