Name: Oogst en Cryo-koeling kristallen van membraaneiwitten Grown in lipide mesofasen voor structuurbepaling door Macromoleculaire Kristallografie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 45 s
Description: Leer het oogsten en cryo-koelen van membraaneiwitkristallen gekweekt in lipide mesofasen. Deze methode behoudt kristalintegriteit voor röntgendiffractie en structurele analyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Er zijn velen die hebben bijgedragen aan dit werk en de meeste zijn uit de Caffrey Membraan Structurele en Functionele Biologie Groep, zowel in het verleden en huidige leden. Voor iedereen, en vooral voor Jingquan Tan en Joseph Lyons, breiden we onze hartelijke dank en waardering. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van Science Foundation Ierland (07/IN.1/B1836), de National Institutes of Health (GM75915, P50GM073210 en U54GM094599), en KP7 COST en Marie Curie-acties (CM0902 en PIEF-GA-2009 -235.612).

1. Laboratorium Set-up Pre-oogst <ol><li> Ter voorbereiding voor het oogsten, vul het droge schuim Dewar met vloeibare stikstof en plaats deze naast de microscoop waar de oogst plaatsvindt. </li><li> Dompel de opslag puck, open belanden, in de vloeibare stikstof in het schuim Dewar en laat het volledig afkoelen. </li><li> Bevestig een micro-mount van een formaat dat het kristal te worden geoogst op een magnetische staaf (figuur 5) past. Het is belangrijk om de hand van een aantal extra magnetische staven geleverd met micro-mounts te voorzien voor gevallen waarin het noodzakelijk is meerdere kristallen oogsten van een bolus. Spare wands beschikbaar moeten te allen tijde. </li><li> Plaats een micropipet tips en het neerslagmiddel oplossing die werd gebruikt voor kristalgroei naast het oogsten microscoop. Het kan nodig zijn om de mesofase dekken en uitdroging wanneer de put wordt geopend. </li><li> Heb een notitieboekje en een pen op de bank in de buurt en / ofde computer te openen. Deze worden gebruikt om waarnemingen betreffende de kwaliteit, uiterlijk, locatie, opslag puck nummer enz. van kristallen als ze geoogst, cryo-gekoeld en opgeslagen opnemen. </li><li> Als een assistent beschikbaar om te helpen met het oogsten van die persoon duidelijk moet het protocol dat gevolgd zal worden, de volgorde waarin de verschillende stappen zal plaatsvinden, en hun rol in het totale proces te begrijpen. </li></ol> Met alle van de materialen en apparatuur in de plaats onze volgende taak is om: 2. Identificeer Platen en Wells die kristallen bevatten <ol><li> De eenvoudigste en meest directe methode om oogstbare kristallen te controleren wells hand met een microscoop met normale en met gekruiste gepolariseerd licht. Aanpassing van de lichtdoorlatende lichtintensiteit op de microscoop kan helpen met het vinden van kristallen. </li><li> U kunt ook een imager waar platen automatisch worden gescreend met een normale en gekruiste polariserend licht kan worden gebruikt om te zoeken naar kristallen. </li><li> Evalueer op het oog digitale beelden die op een computer monitor. </li><li> Duidelijk markeren die putten met kristallen voor het oogsten en opnemen opmerkingen over de omvang, kwaliteit en locatie van de kristallen in de mesofase in de notebook of op een computer. </li><li> Verwijder de plaat met kristallen voor de oogst van de imager. </li></ol> 3. Het openen van een goed met kubieke mesofase. Methode 1 De platen waarin kristallen groeien met de in meso methode glas sandwichplaten (figuur 2). Om toegang tot de mesofase en de kristallen daarin moet het goed opent. Dit gebeurt met behulp van een glazen snijwerktuig het bovenste dekglaasje dat afdichtingen de put die dan kan worden verwijderd gesneden. Er zijn verschillende benaderingen voor het snijden en verwijderen van het dekglaasje van meer dan een kristallisatie goed. Degene die gebruikt wordt bepaald door het type of mesofase waarin het kristal groeit gevonden. Dit kan zeer viskeus en kleverig kubische fase (Figuur 3A) of de vlotter variant, de spons fase (figuur 3b). In deze video artikel tonen we hoe u putten te openen en kristallen oogsten van beide hosting materialen. <ol><li> Plaats de glazen sandwich kristallisatie plaat op het podium van een lichtmicroscoop. </li><li> Met behulp van een glas snijgereedschap de score van de coverglass licht met twee concentrische cirkels boven de spacer en net buiten de omtrek van de put. Met een nieuwe snijgereedschap, scoren vereist minimale toegepaste druk. Vervang het gereedschap door een nieuwe wanneer de druk die nodig is om te scoren verhoogt zelfs fractioneel, dit meestal gebeurt na het openen van 10 putten. </li><li> Breek het glas in de ruimte tussen de twee scoorden cirkels met het oog op het vrijgeven van de binnenste dekglaasje. Dit genereert veel glasscherven en stof. Wis ze weg met een vochtigepapieren handdoek. </li><li> Verwijder de bevrijde coverglass door vast te pakken met een fijne getipt pincet en kantelen uit de buurt van en uit de put. In dit geval is de kubische fase blijft steken en op zijn plaats op de bodemplaat van de put. </li><li> Zoom in tot een duidelijker beeld van de kubieke mesofase die nu klaar is voor gebruik in kristal oogst te krijgen. </li></ol> 4. Het openen van een Goed met Cubic Mesofase. Methode 2 <ol><li> Met het glas snijgereedschap score rechte evenwijdige lijnen in het dekglaasje aan een zijde van de put en die zich uitstrekken over de bron zelf. Dit maakt gemakkelijker toegang tot pincet en verwijdering van het dekglaasje. </li></ol> In dit bijzondere demonstratie, het dekglaasje scheuren in het bevrijden van de dekglaasje uit de kleverige spacer oppervlak. In het proces, de coverglass verschuift in positie en het neerslagmiddel scheidt van de kubische fase. Wanneer de dekglaasje wordt opgeheven enkele van de neerslagmiddel ermee gepaard gaat. We blijven zitten met een blootgestelde bolus van mesofase zonder omliggende neerslagmiddel. Onmiddellijk voeg 1 ul vers precipitant bovenop de bolus met een micropipet de mesofase uitdroogt en ondergaan een faseverandering die beschadigen de kristallen. De bolus is nu klaar voor gebruik in kristal oogsten. 5. Het openen van een Goed met Spons fase. Zonder succes De spons fase is minder vergevingsgezind werken met vanwege zijn vermogen te stromen. Als die stroom resulteert in de spons fase contact met de omtrek van de put capillariteit zal trekken uit de mesofase en de kristallen verloren. Een voorbeeld van dit gebeurt is weergegeven in deze video clip. <ol><li> Zoom in op de spons fase en heen en weer schakelen tussen normale en gekruiste gepolariseerd licht om kristallen te vinden in de spons fase. </li><li> Ter voorbereiding op het openen van de put score en snijd de coverglass zoals beschreven in hoofdstuk 3. In het proces, de coverglass scheuren. In pogingING openen en het precipiteermiddel verschuivingen in de richting van de spleet en uiteindelijk in contact komt met de spacer. Met de precipitant enkele spons fase en de lading van kristallen die verloren gaat. </li></ol> In deze specifieke sequentie zijn de polarisatoren op de microscoop niet volledig gekruist en de kristallen kan worden beschouwd als heldere objecten op het moment dat de bron en de inhoud zichtbaar blijven. 6. Het openen van een Goed met Spons fase. Met goed gevolg <ol><li> Zoom in op de spons fase en identificeren van een kristal, zowel in normale als gekruiste gepolariseerd licht. </li><li> Score, knippen en verwijderen van een deel van dekglaasje met betrekking tot de bron, zoals in paragraaf 4.1. Onvolledig gekruist gepolariseerd licht wordt gebruikt om bij te houden van het kristal. </li><li> Introduceer een stukje droge tissue papier door de opening in de dekglaasje en in de put tot het net raakt de neerslagmiddel oplossing. Lont weg van de oplossing voorzichtigly tot het bijna allemaal weg en verwijder het weefsel. Dit zorgt ervoor dat de resterende neerslagmiddel en spons fase, met het kristal nog op zijn plaats, terug te trekken onder het dekglaasje. </li><li> Score, knippen en verwijderen met een pincet de rest van het dekglaasje, zoals in paragraaf 4.1. In dit geval, de spons fase splitst, sommige blijft in de put en een paar stokken het dekglaasje. Het glas in de bolus het dekglaasje. Omdat er weinig precipiteermiddel aanwezig, de spons fase begint te ondergaan faseovergang waarschijnlijk door uitdroging. Dit kan worden gezien als een ring van dubbele breking dat migreert naar het midden van de bolus. Onmiddellijk neerslagmiddel toe te voegen aan de bolus om de overgang te stoppen. De bolus is nu klaar voor gebruik in crystal oogsten. </li></ol> 7. Oogsten en Cryo-koeling kristallen uit de Cubic fase <ol><li> Ga heen en weer tussen de normale en gekruiste gepolariseerd licht om kristallen te vinden in de kubieke fase bolus in de open put. In tzijn videosequentie maximaal vier dubbelbrekende kristallen te zien in de kubische fase bolus met gekruiste gepolariseerd licht. </li><li> Gebruik een gemonteerde cryo-lus (figuur 5) om de vers blootgestelde mesofase voor kristallen sonde, om vissen uit kristallen en ze vervolgens te dompelen, in de cryo-loop, in vloeibare stikstof in het Dewar onmiddellijk na oogsten. Idealiter zou het oogsten en snap-koeling gebeuren in een voortdurende en snelle beweging. Zo weinig hechtende mesofase mogelijk moet worden geoogst met het kristal. In onze ervaring, is cryo-beschermer niet nodig met in meso-gegroeid kristallen. </li><li> Aangezien het niet mogelijk om het kristal zien in de cryo-loop onmiddellijk na de oogst inspecteren mesofase bolus voor oogsten te controleren of de kristal er niet meer suggereren dat succesvol is geoogst. </li></ol> 8. Oogst en Cryo-koeling kristallen uit de spons fase <ol><li> Ga heen en weer tussen de normale en gekruiste gepolariseerd licht om kristallen te vinden in de spons fase bolus in de open put. In deze videoreeks veel dubbelbrekende kristallen te zien in de bolus onder gekruiste gepolariseerd licht. </li><li> Gebruik een gemonteerde cryo-lus (figuur 5) om vissen uit kristallen uit de spons fase en te dompelen, in of op de cryoloop, in vloeibare stikstof in het Dewar onmiddellijk na oogsten. Net als bij het oogsten van de kubieke fase, ideaal gesproken moet een cryo-koelproces meteen gebeuren het kristal wordt geoogst met zo weinig mogelijk tijd verloopt tussen de werkelijke oogst gebeurtenis en storten in vloeibare stikstof. Zo weinig hechtende spons fase mogelijk moet worden geoogst met het kristal. Zoals opgemerkt, is cryo-beschermer niet nodig met in meso-gegroeid kristallen. </li></ol> 9. Het opslaan van Kristallen in Dewars <ol><li> Na stortte de gemonteerde lus in vloeibare niTrogen plaats het in een van de holding sleuven van de opslag puck in het schuim Dewar. Alle manipulaties worden uitgevoerd met de lus, de bovenkant van de magnetische staaf en de puck ondergedompeld in vloeibare stikstof. </li><li> Registreert de locatie en details van de geoogste en cryo-gekoelde kristal in de notebook en / of op de computer. </li><li> Wanneer de puck in het schuim Dewar is vol of oogsten voor de dag is voltooid overdracht de puck in een ijskast puck houder in een opslag of een transport Dewar gevuld met vloeibare stikstof. Kristallen kunnen worden verzonden in het vervoer Dewars aan de synchrotron faciliteit voor diffractie het verzamelen van gegevens. </li></ol> 10. Representatieve resultaten De doelstellingen van de oogst en cryo-koeling oefeningen aangetoond hier een kristaltransport van de hosting mesofase in cryo-loops, de lus kristal verglazen en te plaatsen in opslag in vloeibare stikstof in een Dewar. De ideale situatie is de plaats waar het oogsten en cryo-koeling op zodanige wijze dat de diffractie kwaliteit van het kristal wordt bewaard in het proces. Zo weinig mesofase mogelijk moet worden geoogst met het kristal. Dit is om het lokaliseren van de kristal en centreren in de röntgenbundel veel minder uitdagend, om cryo-koelsnelheid teneinde verglazing, zo laag mogelijke storende verstrooien van de mesofase tijdens diffractie gegevensverzameling. Enkele voorbeelden van cryo-gekoelde monsters waarin het kristal en niet zichtbaar zijn weergegeven in figuur 6. Wanneer het kristal niet zichtbaar oog is het gewoonlijk noodzakelijk om gebruik te diffractie rastering om de kristallen te vinden en te centreren in de balk voor gegevensverzameling 27. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Schematische weergave van een biologische membraan die de lipide dubbellaag in en op die are ligt een verscheidenheid van eiwitten. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. Een volledig geladen en verzegeld 96-well glas sandwich kristallisatie plaat. Elke well bevat 50 nl kubieke fase en 1 pl neerslagmiddel oplossing. Voor de duidelijkheid is de kubische fase zijn gekleurd met Sudan Red en het precipiteermiddel oplossing bevat methyleenblauw. Van Reference 5. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig3.jpg" alt="Figuur 3" /> Figuur 3. Kristallen van membraaneiwitten groeien in de lipidische mesofase. A. De kubische fase met een kristal van bacteriorhodopsin van H. halobium. B. De spons fase die een kristal van het vitamine B12 receptor / transporter, BtuB van E. coli. Van Reference 25. De kubieke en spons fasen contrasterende appeaRances even vanzelfsprekend door vergelijking panelen A en B. De kubische fase in een zeer viskeuze en behoudt zijn oorspronkelijke vorm. Het niet stroomt. Dit is bijzonder duidelijk bij de randen van de mesofase bolus die een geruwde uitzien. Contract door de spons fase aanzienlijk minder viskeus en doet stromen. Dus de spons fase niet behouden hun oorspronkelijke vorm en de randen zijn karakteristiek glad. Flocculant dat Jeffamine omvatten PEG 400, 2-methyl-2 ,4-pentandiol, pentaerythritol propoxylaat, butaandiol en hexaandiol, kan resulteren in een overgang van de kubische fase de spons 4,26. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig4.jpg" alt="Figuur 4" /> Figuur 4. Het stroomdiagram samenvatting van de stappen betrokken bij de productie, oogst-en cryo-koelen van in meso-gekweekt membraaneiwit kristallen (A). Alleen deze stappen omgeven door de onderbroken rodelijn en in detail beschreven in (B), worden in dit artikel jove. Paneel A is van referentie 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4001/4001fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig5.jpg" alt="Figuur 5" /> Figuur 5. Een lege cryo-loop gemonteerd op een pin die wordt vastgehouden op een magnetische staaf. Gedetailleerde weergave van de pen (A) en micro-mount (B) van dit belangrijke instrument voor het oogsten en cryo-koeling worden weergegeven. De lege lus aan het uiteinde van de micro-mount in B is 30 urn in diameter. Hoewel die niet getest andere lus soorten uitgebreid, vinden we dat de MiTeGen getoonde werk goed lussen met zowel de kubieke en spons fasen. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig6.jpg" alt="Figuur 6" /> Figuur 6. Geoogst en cryo-gekoelde kristallen van membraaneiwitten in cryo-lussen als bekeken met een in-line microscoop op een synchrotron bundellijn. A, B. Voorbeelden van geoogste kristallen (caa3 cytochrome oxidase 34 (A), diacylglycerol kinase, DgkA (B)) waar de kristallen (blauwe pijl) zijn zichtbaar door de cryo-gekoelde mesofase een cryo-loop. C. Voorbeeld waar de geoogste kristal niet zichtbaar in de cryo-gekoelde mesofase een cryo-loop. De punt van de lus wordt geïdentificeerd met een rode pijl. De hechtende cryo-gekoelde mesofase wordt geïdentificeerd met een blauwe pijl.

<ol><li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination%3A+use+of+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins for structure determination: use of lipidic mesophases.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).</li>
<li>Caffrey, M., Li, D., Dukkipati, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+structure+determination+using+crystallography+and+lipidic+mesophases+-+recent+advances+and+successes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane protein structure determination using crystallography and lipidic mesophases - recent advances and successes.</a> Biochemistry. , Forthcoming (2012).</li>
<li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat. Protocols. 4, 706-731 (2009).</li>
<li>Cherezov, V., Clogston, J., Papiz, M. Z., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room+to+move%3A+crystallizing+membrane+proteins+in+swollen+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Room to move: crystallizing membrane proteins in swollen lipidic mesophases.</a> J. Mol. Biol. 357, 1605-1618 (2006).</li>
<li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D. 60, 1795-1807 (2004).</li>
<li>Cherezov, V., Rosenbaum, D. M., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Kuhn, P., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Setvens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318, 1258-1265 (2007).</li>
<li>Chien, E. Y., Liu, W., Zhao, Q., Katritch, V., Han, G. W., Hanson, M. A., Shi, L., Newman, A. H., Javitch, J. A., Cherezov, V., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+dopamine+D3+receptor+in+complex+with+a+D2%2FD3+selective+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of the human dopamine D3 receptor in complex with a D2/D3 selective antagonist.</a> Science. 330, 1091-1095 (2010).</li>
<li>Granier, S., Manglik, A., Kruse, A. C., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Weis, W. I., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+delta-opioid+receptor+bound+to+naltrindole%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the delta-opioid receptor bound to naltrindole.</a> Nature. 485, 400-404 (2012).</li>
<li>Haga, K., Kruse, A. C., Asada, H., Yurugi-Kobayashi, T., Shiroishi, M., Zhang, C., Weis, W. I., Okada, T., Kobilka, B. K., Haga, T., Kobayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+M2+muscarinic+acetylcholine+receptor+bound+to+an+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the human M2 muscarinic acetylcholine receptor bound to an antagonist.</a> Nature. 482, 547-551 (2012).</li>
<li>Hanson, M. A., Roth, B., Jo, E., Griffith, M. T., Scott, F. L., Reinhart, G., Desale, H., Clemons, B., Cahalan, S. M., Schuerer, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+lipid+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a lipid G protein-coupled receptor.</a> Science. 335, 851-855 (2012).</li>
<li>Jaakola, V. P., Griffith, M. T., Hanson, M. A., Cherezov, V., Chien, E. Y., Lane, J. R., Ijzerman, A. P., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2.6+angstrom+crystal+structure+of+a+human+A2A+adenosine+receptor+bound+to+an+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The 2.6 angstrom crystal structure of a human A2A adenosine receptor bound to an antagonist.</a> Science. 322, 1211-1217 (2008).</li>
<li>Kruse, A. C., Hu, J., Pan, A. C., Arlow, D. H., Rosenbaum, D. M., Rosemond, E., Green, H. F., Liu, T., Chae, P. S., Dror, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+dynamics+of+the+M3+muscarinic+acetylcholine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure and dynamics of the M3 muscarinic acetylcholine receptor.</a> Nature. 482, 552-556 (2012).</li>
<li>Manglik, A., Kruse, A. C., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Mathiesen, J. M., Sunahara, R. K., Pardo, L., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Granier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+micro-opioid+receptor+bound+to+a+morphinan+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the micro-opioid receptor bound to a morphinan antagonist.</a> Nature. 485, 321-326 (2012).</li>
<li>Rasmussen, S. G., Choi, H. J., Fung, J. J., Pardon, E., Casarosa, P., Chae, P. S., Devree, B. T., Rosenbaum, D. M., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Schnapp, A., Konetzki, I., Sunahara, R. K., Gellman, S. H., Pautsch, A., Steyaert, J., Weis, W. I., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+nanobody-stabilized+active+state+of+the+beta%282%29+adrenoceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor.</a> Nature. 469, 175-180 (2011).</li>
<li>Rasmussen, S. G. F., Devree, B. T., Zou, Y., Kruse, A. C., Chung, K. Y., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Chae, P. S., Pardon, E., Calinski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal++structure+of+the+%CE%B22+adrenergic+receptor-Gs+protein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex.</a> Nature. 477, 549-555 (2011).</li>
<li>Rosenbaum, D. M., Cherezov, V., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Yao, X. J., Weis, W. I., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPCR+engineering+yields+high-resolution+structural+insights+into+beta2-adrenergic+receptor+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">GPCR engineering yields high-resolution structural insights into beta2-adrenergic receptor function.</a> Science. 318, 1266-1273 (2007).</li>
<li>Rosenbaum, D. M., Zhang, C., Lyons, J. A., Holl, R., Aragao, D., Arlow, D. H., Rasmussen, S. G., Choi, H. J., Devree, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+an+irreversible+agonist-beta%282%29+adrenoceptor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure and function of an irreversible agonist-beta(2) adrenoceptor complex.</a> Nature. 469, 236-240 (2011).</li>
<li>Shimamura, T., Shiroishi, M., Weyand, S., Tsujimoto, H., Winter, G., Katritch, V., Abagyan, R., Cherezov, V., Liu, W., Han, G. W., Kobayashi, T., Setvens, R. C., Iwata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+histamine+H1+receptor+complex+with+doxepin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the human histamine H1 receptor complex with doxepin.</a> Nature. 475, 65-70 (2011).</li>
<li>Thompson, A. A., Liu, W., Chun, E., Katritch, V., We, H., Vardy, E., Huang, X. P., Trapella, C., Guerrini, R., Calo, G., Roth, B. L., Cherezov, V., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+nociceptin%2Forphanin+FQ+receptor+in+complex+with+a+peptide+mimetic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the nociceptin/orphanin FQ receptor in complex with a peptide mimetic.</a> Nature. 485, 395-399 (2012).</li>
<li>Wu, B., Chien, E. Y., Mol, C. D., Fenalti, G., Liu, W., Katritch, V., Abagyan, R., Brooun, A., Wells, P., Bi, F. C., Hamel, D. J., Kuhn, P., Handel, T. M., Cherezov, V., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+CXCR4+Chemokine+GPCR+with+Small-Molecule+and+Cyclic+Peptide+Antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structures of the CXCR4 Chemokine GPCR with Small-Molecule and Cyclic Peptide Antagonists.</a> Science. 330, 1066-1071 (2010).</li>
<li>Wu, H., Wacker, D., Mileni, M., Katritch, V., Han, G. W., Vardy, E., Liu, W., Thompson, A. A., Huang, X. P., Carroll, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+kappa-opioid+receptor+in+complex+with+JDTic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the human kappa-opioid receptor in complex with JDTic.</a> Nature. 485, 327-332 (2012).</li>
<li>Cherezov, V., Abola, E., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+the+structure+determination+of+GPCRs%2C+a+membrane+protein+family+with+high+potential+as+pharmaceutical+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recent progress in the structure determination of GPCRs, a membrane protein family with high potential as pharmaceutical targets.</a> Methods Mol. Biol. 654, 141-168 (2010).</li>
<li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast%2C+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Cryst%22%5BJournal%5D)">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picolitre-scale+crystallization+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Cryst%22%5BJournal%5D)">Picolitre-scale crystallization of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 39, 604-606 (2006).</li>
<li>Wöhri, A. B., Johansson, L. C., Wadsten-Hindrichsen, P., Wahlgren, W. Y., Fischer, G., Horsefield, R., Katona, G., Nyblom, M., Oberg, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Lipidic-Sponge+Phase+Screen+for+Membrane+Protein+Crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">A Lipidic-Sponge Phase Screen for Membrane Protein Crystallization.</a> Structure. 16, 1003-1009 (2008).</li>
<li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rastering+strategy+for+screening+and+centring+of+microcrystal+samples+of+human+membrane+proteins+with+a+sub-10+microm+size+X-ray+synchrotron%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Rastering strategy for screening and centring of microcrystal samples of human membrane proteins with a sub-10 microm size X-ray synchrotron.</a> 6, 587-597 (2009).</li>
<li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lipid%27s+eye+view+of+membrane+protein+crystallization+in+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">A lipid's eye view of membrane protein crystallization in mesophases.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 486-497 (2000).</li>
<li>Briggs, J., Chung, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+temperature-composition+phase+diagram+and+mesophase+structure+characterization+of+the+monoolein%2Fwater+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Ii%22%5BJournal%5D)">The temperature-composition phase diagram and mesophase structure characterization of the monoolein/water system.</a> J. Phys. Ii. 6, 723-751 (1996).</li>
<li>Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phase+diagram+of+the+monoolein%2Fwater+system%3A+metastability+and+equilibrium+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects.</a> Biomaterials. 21, 223-234 (2000).</li>
<li>Misquitta, Y., Cherezov, V., Havas, F., Patterson, S., Mohan, J. M., Wells, A. J., Hart, D. J., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+lipid+for+membrane+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rational design of lipid for membrane protein crystallization.</a> J. Struct. Biol. 148, 169-175 (2004).</li>
<li>Caffrey, M., Porter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+Membrane+Proteins+for+Structure+Determination+using+Lipidic+Mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases.</a> J. Vis. Exp. , e1712(2010).</li>
<li>Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+robot+for+high-throughput+crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophase.</a> J. Vis. Exp. , e4000(2012).</li>
<li>Lyons, J. A., Aragao, D., Slattery, O., Pisliakov, A. V., Soulimane, T., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+insights+into+electron+transfer+in+caa%283%29-type+cytochrome+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure insights into electron transfer in caa(3)-type cytochrome oxidase.</a> Nature. 10, (2012).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

In deze video artikel zullen we laten zien hoe kristallen gekweekt in een lipide mesofase worden geoogst en cryo-gekoeld in voorbereiding voor gebruik in diffractie het verzamelen van gegevens en uiteindelijk voor structuurbepaling. De hosting mesofase kan de viskeuze en kleverige kubieke fase of de meer vloeiende spons fase 4. Hoe de glazen sandwich platen worden geopend en hoe de kristallen worden vaak zeer geoogst is afhankelijk van mesofase type. Het is daarom belangrijk om te weten welke van de twee een te maken heeft met van tevoren. De identiteit van de ontvangende lipide en de gebruikte precipitatiemiddel zijn hierbij van belang, en het uiterlijk van de mesofase bolus in de kristallisatie goed gebruikt kunnen worden om ze uit elkaar (figuur 3). Oogsten van beide mesofase soorten werd geïllustreerd in dit artikel. Oogsten kleine kristallen uit een lipide mesofase in glas sandwich platen is een secuur proces dat tijd, vaardigheid, expertise vereistveerkracht, geduld en een vaste hand. Het is belangrijk om vernietiging van een passende hoeveelheid tijd voor het oogsten en het opzetten van het laboratorium, zodat alle benodigdheden en de apparatuur bij de hand op voorhand. Een tweede persoon bij de oogst niet essentieel maar aanbevolen. Die persoon kan helpen met het leveren van pre-gemarkeerde platen op de individuele het doen van de oogst en het plaatsen van cryo-gekoelde gemonteerd lussen met geoogst kristallen in de opslag puck. De assistent kan een belangrijke ondersteunende rol spelen bij het documenteren van opmerkingen over de kristallen gemaakt tijdens het oogsten die kunnen van doorslaggevend belang zijn tijdens de diffractie het verzamelen van gegevens. In afwezigheid van een assistent kan een spraakgestuurd audio-opnameapparaat met voordeel worden toegepast voor documentatie. Naar aanleiding van het protocol beschreven in dit artikel zal helpen om de Viewer up and running met kristal oogsten. Het is echter belangrijk te beseffen dat het proces niet eenvoudig is en dat practice is nodig voor de lancering in het oogsten van waardevolle membraaneiwit kristallen. Het wordt daarom aanbevolen dat testplaten met kristallen van eiwitten die niet zijn bijzonder waardevol worden geëxperimenteerd met de eerste. Dit zal de neofiet waardevolle ervaring in het snijden van glas, verwijderen glasscherven, tillen de coverglass van de mesofase, met de functie op de polariserende microscoop kristallen zien en te volgen tijdens het oogsten en tenslotte de behandeling van de verschillende mesofasen en het oogsten van hen. De textuur van de mesofase en bij uitbreiding het gemak waarmee kristallen kunnen worden geoogst, verandert met de tijd tijdens kristallisatie. Het is daarom belangrijk om te oefenen oogsten met minder waardevolle kristallen maar die zijn gegroeid onder dezelfde voorwaarden als die waardevoller. Het is mogelijk om kristallen van lysozyme en thaumatine groeien in de meso of lipide kubische fase methode 28 die dient te worden considEred door middel van het verkrijgen van bekendheid met de materialen en de methode. Men moet ook rekening houden met het werken met eiwit-vrij mesofase eerste op de van haar grillen. De procedures toonde hier zijn allemaal gedaan op een comfortabele 20 ° C of daaromtrent. Het is mogelijk om de kristallen groeien met de in meso werkwijze bij lagere temperaturen. Aldus kan monooleïne de gastheer lipide in een metastabiele fase toestand worden gebruikt bij 4 ° C 1,2,29,30. Als alternatief kunnen de rationeel ontworpen 7,9 MAG gebruiken bij lage temperatuur kristallisatie 31. We doen lage temperatuur crysallogenesis routinematig met bepaalde membraaneiwit doelstellingen. In dit geval wordt kristalgroei en oogsten gedaan in een walk-in 4 ° C koelkast. Werken onder dergelijke omstandigheden heeft zijn eigen uitdagingen niet de minste daarvan is de behoefte aan warme en comfortabele kleding. De volgende stap in het totale proces van de structuur van de bepaling met behulp van macromoleculaire crystallography is om diffractie gegevens te verzamelen over kristallen geoogst en snap-gekoeld zoals aangetoond in dit artikel. In meso-grown kristallen meestal klein zijn. Echter nuttig diffractie gegevensverzameling mogelijk met kristallen met een maximale afmeting van 20 pm 9. Hiertoe wordt micro-beam synchrotron X-straling gebruikt en is het onderwerp van een afzonderlijke Jupiter artikel in deze serie 32,33.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Componenten </td></tr><tr><td> Gebogen pincet </td><td> Sigma </td><td> F4142 </td><td> Gereedschap </td></tr><tr><td> Wegwerp pipettips </td><td> Gilson </td><td> Divers </td><td> Beschikbaar </td></tr><tr><td> Foam Dewar </td><td> Spearlab </td><td> FD-500 </td><td> Gereedschap </td></tr><tr><td> Glas en metalen afvalcontainers </td><td> Daniels Gezondheidszorg </td><td> DD479OL </td><td> Gereedschap </td></tr><tr><td> Oogsten lussen </td><td> MiTeGen </td><td> Divers </td><td> Gereedschap </td></tr><tr><td> Oogsten microscoop </td><td> Nikon </td><td> SMZ1500 </td><td> Gereedschap </td></tr><tr><td> Lab notebook </td><td> Divers </td><td> NA </td><td> Gereedschap </td></tr><tr><td> Magnetische drukknop sample laden wand </td><td> Hampton Onderzoek / Moleculaire Afmetingen </td><td> HR4-729/MD7-411 </td><td> Gereedschap </td></tr><tr><td> Originele Puck (voor gebruik met ALS-stijl robots alleen) </td><td> Crystal Positioning Systems </td><td> CP-111-035 </td><td> Gereedschap </td></tr><tr><td> Pipetteerapparaten </td><td> Gilson </td><td> Divers </td><td> Gereedschap </td></tr><tr><td> Neerslagmiddel oplossingen </td><td> Divers </td><td> Divers </td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Puck Bent Cryo-Tong </td><td> Crystal Positioning Systems </td><td> CP-111-030 </td><td> Gereedschap </td></tr><tr><td> Puck Shelved Shipping Cane (originele ALS-stijl) met gebogen handvat en espagnoletsluiting </td><td> Crystal Positioning Systems </td><td> CP-111-029 </td><td> Gereedschap </td></tr><tr><td> Gezuiverd water </td><td> Millipore </td><td></td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Veiligheidsbril </td><td&gt; Diverse </td><td> NA </td><td> Gereedschap </td></tr><tr><td> Voorbeeld Pin Bases - Magnetische (niet-koper) </td><td> Crystal Positioning Systems </td><td> CP-111-015 </td><td> Gereedschap </td></tr><tr><td> Verzenden Dewar </td><td> Taylor-Wharton </td><td> CX100 </td><td> Gereedschap </td></tr><tr><td> Weefsels </td><td> NA </td><td> NA </td><td> Beschikbaar </td></tr><tr><td> Tungsten-carbide glassnijder (TCT Kraspen) </td><td> Silverline Tools (Yeovil, UK) </td><td> 633657 </td><td> Gereedschap </td></tr></tbody></table>

oogst en cryo-koeling kristallen van membraaneiwitten grown in lipide mesofasen voor structuurbepaling door macromoleculaire kristallografie

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Een belangrijke route voor het begrijpen hoe eiwitten functioneren op een mechanistisch niveau de structuur van het doeleiwit beschikken, idealiter op atomaire. Momenteel is er slechts een manier om dergelijke informatie te vangen als die welke integrale membraaneiwitten (figuur 1), en de complexen vormen, en deze methode is macromoleculaire X-ray kristallografie (MX). Doen MX diffractie kwaliteit kristallen die nodig bij membraaneiwitten, niet gemakkelijk te vormen. Werkwijze voor het kristalliseren membraaneiwitten dat het gebruik van lipidische mesofasen, met name de kubische en spons fase 1-5, gaat er veel aandacht gekregen van late Door de goede resultaten heeft gehad in de G-eiwit-gekoppelde receptor field 6-21 ( <a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www . mpdb.tcd.ie</a> ). De methode voortaan aangeduid als in meso of lipide kubische fase methode heeft zijn eigen technischeuitdagingen. Deze ontstaan, gedeeltelijk vanwege de algemeen viskeus en kleverig aard van de lipidische mesofase waarin de kristallen, die vaak micro-kristallen, groeien. Het manipuleren van kristallen wordt het moeilijk als gevolg en met name het geval tijdens het oogsten 22,23. Problemen ontstaan ​​ook bij de stap die voorafgaat oogsten hetwelk de glazen platen sandwich waarin de kristallen groeien (Figuur 2) 24,25 zijn vanuit de mesofase bolus bloot, en de kristallen daarin, voor de oogst, cryo-koeling en eventueel X -ray diffractie gegevensverzameling. De kubische en spons mesofase varianten (figuur 3) waaruit kristallen worden geoogst verschilt grondig rheologiën 4,26. De kubische fase is viskeus en kleverig verwant aan een dikke tandpasta. Daarentegen de spons fase meer vloeistof met een duidelijke tendens te stromen. Dienovereenkomstig verschillende benaderingen voor het openen van kristallisatie putten containing groeiende kristallen in de kubische fase en de spons zijn noodzakelijk zoals ook verschillende methoden nodig zijn voor het oogsten van de twee kristallen mesofase types. Protocollen voor het doen precies dat zijn verfijnd en geïmplementeerd in de membraan structuur-en Functionele Biologie (MS &amp; FB)-groep, en worden in detail beschreven in dit Jove artikel (figuur 4). Voorbeelden gegeven van situaties waarin kristallen succes worden geoogst en cryo-gekoelde. We bieden ook voorbeelden van gevallen waarin problemen die leiden opstaan ​​om het onherstelbare verlies van kristallen en beschrijven hoe deze problemen kunnen worden vermeden. In dit artikel wordt de Viewer is voorzien van stap-voor-stap instructies voor het openen van glas sandwich kristallisatie putten, voor het oogsten en voor cryo-koeling kristallen van membraaneiwitten groeien in kubieke en spons fasen.

Hierin beschreven procedures uitgevoerd in de Caffrey Membrane Biology Structurele en functionele groep te oogsten en cryo-cool membraaneiwit kristallen gegroeid lipidische kubieke spons fasen voor gebruik in structuurbepaling met macromoleculaire X-ray kristallografie.

Oogst en Cryo-koeling kristallen van membraaneiwitten Grown in lipide mesofasen voor structuurbepaling door Macromoleculaire Kristallografie

Een belangrijke route naar het begrijpen van hoe eiwitten op mechanistisch niveau functioneren, is het beschikbaar hebben van de structuur van het doeleiwit, idealiter op...

Hallo en welkom bij de Membrane Structural and Functional Biology Group. Mijn naam is Martin Caffery. Dit is een weitere editie in een serie JoVE-artikelen over het kristalliseren van membraaneiwitten voor structurele bepaling met behulp van de in meso- of lipide kubische fasemethode.In het eerste artikel, Jo of 1 7 1 2, hebben we gedemonstreerd hoe de eiwitgeladen kubische fase wordt geprepareerd en hoe de viskeuze en kleverige misa-fase handmatig in glazen sandwich-kristallisatieplaten wordt gedoseerd voor kristallisatieproeven. Dit video-artikel beschrijft de methode voor het oogsten en cryokoelen van kristallen die via de in meso-methode zijn gekweekt. De materialen en apparatuur die nodig zijn om kristallen die in meso zijn gekweekt te oogsten en cryokoelen, worden hier getoond.Deze omvatten een laboratoriumnotitieboek om informatie over kristallen en oogstdetails voor toekomstige referentie te noteren, veiligheidsbrillen, glas- en metaalafvalcontainers, de glazen sandwich-kristallisatieplaat waarvan de kristallen geoogst zullen worden. Putjes die kristallen bevatten zijn duidelijk gemarkeerd, een glassnijinstrument voor het openen van kristallisatieputjes, tissues en een waterfles, gebogen pincetten, precipitant-screening-oplossing, een micropipet en tips, cryoloops voor het oogsten van kristallen, een magnetische staaf, een houder voor het bewaren van cryogekoelde loops met kristallen. Een schuimrubberen houder gevuld met vloeibare stikstof voor cryokoeling, kristal-pincetten, een transport- of bewaarhouder en een oogstmicroscoop.Ter voorbereiding op het oogsten moet de foam-houder vooraf worden gevuld met vloeibare stikstof en naast de microscoop worden geplaatst waar het oogsten zal plaatsvinden. De opslaghouder moet met de open zijde naar boven worden ondergedompeld in de vloeibare stikstof in de houder en worden afgekoeld; een cryo-loop met een grootte die overeenkomt met het te oogsten kristal moet worden bevestigd op een micro-mount op de magnetische staaf, waarbij alle materialen en apparatuur gereedstaan. Onze volgende taak is het identificeren van platen en wells die kristallen bevatten.Dit kan op twee manieren worden gedaan. De eenvoudigste en meest directe methode is het handmatig inspecteren van de wells met een microscoop onder zowel normaal als gepolariseerd licht. De tweede methode maakt gebruik van een imager waarbij de platen automatisch worden gescreend met normaal en gepolariseerd licht.Digitale beelden worden vastgelegd door de imager en worden geëvalueerd op een computermonitor. Putjes met kristallen die geoogst moeten worden, dienen duidelijk te worden gelabeld. Opmerkingen over de grootte, kwaliteit en locatie van de kristallen in het mengsel moeten worden genoteerd in het laboratoriumnotitieboek of op een computer.Dit zal helpen bij de oogstfase. Hier wordt een plaat met kristallen voor oogst uit de imager verwijderd door de put te openen; de platen waarin kristallen groeien via de end meso-methode zijn glazen sandwichplaten van het type dat hier wordt getoond. Om bij de meso en de kristallen waarin ze zich bevinden te kunnen komen, is het noodzakelijk om de put te openen.Dit gebeurt door een glassnijinstrument te gebruiken om het bovenste dekglas dat de put afsluit door te snijden, waarna dit verwijderd kan worden. Er zijn verschillende benaderingen om dit te doen. De te gebruiken methode wordt bepaald door het type medium waarin het kristal groeit.Dit kan de zeer viskeuze en kleverige kubische fase zijn, of de meer vloeibare variant die bekendstaat als de sponsfase. In dit videoartikel laten we zien hoe putjes geopend kunnen worden en hoe kristallen uit beide gastmaterialen kunnen worden geoogst. In deze videosequentie demonstreren we twee manieren om het dekglas van een putje dat de viskeuze kubische fase bevat, in te kerven.Het inkersen en snijden wordt in detail getoond door dit met een lichtmicroscoop te bekijken. We beginnen met het onderzoeken van een enkele crystallisatieput en het identificeren van de verschillende onderdelen. De eerste rode pijl wijst naar de bolus van mease die kristallen bevat.Overigens zijn kristallen in deze specifieke sequentie niet zichtbaar. De tweede pijl wijst naar de precipitantoplossing die het mease omringt. De derde pijl wijst naar de rand van het well.De vierde pijl wijst naar de dubbele stokafstandhouder waarop het dekglas wordt geplaatst met behulp van de glasnijper. Het dekglas wordt lichtjes ingekrast met twee concentrische cirkels die zich net buiten de omtrek van de well bevinden. De glasnijper wordt vervolgens gebruikt om het glas in de ruimte tussen de twee ingekraste cirkels te breken.Om het binnenste dekglas los te maken, ontstaan er veel glasscherven en stof, die met een vochtige papieren handdoek kunnen worden verwijderd. Het vrijgekomen dekglas rust langs de cirkelvormige rand op de spacer. Het dekglas wordt verwijderd door het met een fijne pincet vast te pakken en het weg te kantelen van en uit de well.In dit geval blijft de kubische fase vastzitten en op zijn plaats aan de bodem van de put. Een deel van het precipitant wordt samen met het dekglas verwijderd, maar een aanzienlijk deel van het precipitant blijft op zijn plaats rond de mease-bolus. Bij het inzoomen krijgen we een helderder beeld van de kubische mease, die nu klaar is voor gebruik bij het oogsten van kristallen.In de volgende reeks tonen we een tweede manier om een kristallisatieweltje te openen dat de viskeuze kubische fase bevat. In dit geval worden extra rechte inkepingen en cup-lijnen in het dekglas gemaakt aan één zijde van het weltje, die doorlopen over het weltje zelf. Dit maakt het gemakkelijker om met een pincet bij het dekglas te komen en dit te verwijderen.In deze specifieke demonstratie barst het dekglas en bij het lossen van het dekglas van de kleverige ruimte of het oppervlak, beweegt het dekglas zelf, waardoor het precipitaat zich scheidt van de kubische fase. Wanneer het dekglas wordt opgetild, gaat een deel van het precipitaat mee. De inzet toont een uitgezoomd beeld van het proces.Nu blijft er een blootgestelde bolus mease over zonder omringend precipitant om te voorkomen dat de mease uitdroogt en een faseovergang ondergaat, wat de kristallen kan beschadigen. Met behulp van een micropipet wordt er verse precipitant bovenop de bolus toegevoegd. De bolus is nu klaar om te worden gebruikt bij het oogsten van kristallen.De sponsfase is iets minder vergevingsgezind om mee te werken vanwege het vermogen om te vloeien. Als deze vloeibaarheid ertoe leidt dat de sponsfase de rand van de put raakt, zal deze eruit worden getrokken en gaan de kristallen verloren. Een voorbeeld hiervan is te zien in het volgende videoclipje.Het begint met een inzooming op de sponsfase, waarna er wordt gewisseld tussen normaal licht en gekruist gepolariseerd licht. De kristallen, die in normaal licht met enige moeite te spotten zijn, zijn tussen gekruiste polarisatoren duidelijk zichtbaar als heldere reflecties op een zwarte achtergrond. Ter voorbereiding op het openen van de well wordt het dekglas ingekrast en gesneden zoals hierboven beschreven.Tijdens dit proces barst het dekglas echter op een ongewenste plek. Er worden enkele handelingen verricht om het proces van het openen van de well voort te zetten, maar het precipitant verschuift in de richting van de barst en komt uiteindelijk in contact met de spacer. Toevalligerwijs gaat er samen met het precipitant ook een deel van de sponsfase verloren, en daarmee uiteraard de inhoud ervan. In deze specifieke reeks kristallen zijn de polarisatoren op de microscoop niet volledig gekruist, waardoor de kristallen als heldere objecten zichtbaar zijn terwijl de well en de inhoud ervan tegelijkertijd zichtbaar blijven.In het volgende fragment laten we zien hoe het probleem wordt opgelost door eerst het overtollige precipitant te verwijderen. We beginnen door in te zoomen op de sponsfase en een kristal te identificeren, zowel onder normaal licht als tussen gekruiste polarisatoren, waarna een segment van het dekglas wordt ingesneden, doorgesneden en vervolgens voorzichtig verwijderd. Er wordt opnieuw gebruikgemaakt van gepolariseerd licht om het kristal, dat duidelijk oplicht, in de gaten te houden.Een stukje droog tissuepapier wordt door de opening in het dekglas in de well ingebracht tot het de precipitantoplossing net raakt. De oplossing wordt voorzichtig weggezogen totdat deze bijna volledig is verdwenen en de sponsfase in de richting van de lont begint te bewegen. Door het tissuepapier te verwijderen, trekken de resterende precipitant en de sponsfase met de kristallen op hun plaats terug onder het dekglas.Een vertraagde herhaling van deze laatste sequentie wordt hier getoond ter verduidelijking. De rest van het dekglas wordt ingesneden en doorgesneden. Zoals eerder beschreven, wordt het dekglas nu met de pincet opgetild.De inzet toont een overzicht van het proces. In dit specifieke geval splitst de sponsfase zich, waarbij een deel van de resten in het putje blijft en een deel aan het dekglas kleeft. Het blijkt dat het kristal zich in de bolus op het dekglas bevindt bij de gekruiste polarisatoren.Het kristal is duidelijk zichtbaar in de sponsfase, maar omdat er zeer weinig precipitant aanwezig is, begint het waarschijnlijk door uitdroging een faseovergang te ondergaan. Dit is te zien als een ring van bio-franjes die naar het centrum van de bolus migreert. Door precipitant aan de bolus toe te voegen, kan dit proces worden gestopt en omgekeerd ter voorbereiding op de volgende stap, namelijk het oogsten van de kristallen.Nadat de well is geopend en de gastheer-Misa-fase is blootgesteld, is de volgende stap in het proces het oogsten van de kristallen. In de volgende clips tonen we voorbeelden van het oogsten uit de kubische fase en uit de sponsfase. De mea-fase in de vers geopende well wordt onder de microscoop onderzocht om geschikte kristallen te lokaliseren.Het wisselen tussen normaal en gepolariseerd licht kan bij dit proces sterk helpen. Precipitante-oplossingen moeten bij de hand zijn en beschikbaar om aan de bolus toe te voegen om eventueel uitdrogen te vertragen of te stoppen. Een gemonteerde cryoloop wordt vervolgens gebruikt om de vers blootgestelde visfase te onderzoeken op kristallen om deze eruit te vissen, om ze vervolgens direct na het oogsten met de cryoloop in vloeibare stikstof te dompelen.In het volgende tonen we het oogsten vanuit de viskeuze en kleverige kubische fase in deze oogstreeks tot aan vier Biore-randen; kristallen zijn zichtbaar in de kubische fase-bolus met behulp van gepolariseerd licht. De cryoloop komt van rechts, schept het kristal op met zo min mogelijk aanhechtend materiaal, wordt onmiddellijk cryogeen gekoeld en de loop wordt in de bewaarset onder vloeibare stikstof geplaatst. Het oogstproces wordt in dit fragment drie keer herhaald.Gebruik de polarisator telkens om de locatie van het kristal te controleren. Aangezien het na het oogsten niet mogelijk is om naar het kristal in de cryo-loop te zoeken, is het raadzaam om de mesa-fase waaruit het kristal is geoogst te controleren; als het kristal daar niet meer aanwezig is, suggereert dit dat het oogsten succesvol was. In de volgende sequentie wordt het oogsten uit de meer vloeibare sponsfase getoond; net als bij de kubische fase moet er zo min mogelijk van de sponsfase worden geoogst en bij het kristal achterblijven.Hoe meer vloeistof er in de cryoloop rond het kristal aanwezig is, des te moeilijker het zal zijn om het kristal visueel te lokaliseren. Voor de verzameling van diffractiegegevens zal dit leiden tot meer achtergrondverstrooiing tijdens de diffractiemeting. In de volgende reeks tonen we het cryokoelingsproces, dat onmiddellijk moet worden uitgevoerd.Het kristal wordt geoogst waarbij er zo kort mogelijk wordt gewaait tussen het eigenlijke oogstmoment en het dompelen in vloeibare stikstof. Nadat de gemonteerde loop in vloeibare stikstof is gedompeld, wordt deze geplaatst in een van de houdergleuven van de bewaarschijf in de deur, in dit geval positie nummer één, en losgelaten van de magnetische staaf. Op dit moment moeten de locatie en de details van de geoogste en cryogekoelde kristallen worden genoteerd in het notitieblok en/of de computer.Wanneer de puck in de schuimlade vol is, of wanneer u klaar bent met het oogsten voor die dag, brengt u de puck over naar een gelaagde puckhouder in een opslag- of transportcontainer gevuld met vloeibare stikstof. De volgende twee afbeeldingen tonen cryogeen gekoelde kristallen in cryoloops die zijn geoogst. Wanneer het bovenstaande protocol wordt gevolgd, zijn de kristallen duidelijk zichtbaar binnen de meza-fase in de loop.In dit geval is het kristal echter niet zichtbaar en zou het gelokaliseerd moeten worden via diffractiestraling. De volgende stap in het totale proces van structuurbepaling middels macromoleculaire kristallografie is het verzamelen van diffractiegegevens van kristallen die zijn geoogst zoals gedemonstreerd in dit artikel. Dit gebeurt gewoonlijk met synchrotron-X-straling en vormt de focus van een apart JoVE-artikel in deze serie.

harvesting-cryo-cooling-crystals-membrane-proteins-grown-lipidic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hierin wordt beschreven de procedure geïmplementeerd in de Caffrey Membrane Structurele en Functionele Biologie Groep handmatig in te stellen tot kristallisatie onderzoeken van membraaneiwitten in lipide mesofasen.

Kristalliseren membraaneiwitten voor structuurbepaling met behulp van lipide mesofasen

Evaluatie van twee-dimensionale (2D) kristallisatie onderzoeken voor de vorming van de bestelde membraaneiwit arrays is een zeer kritische en moeilijke taak in elektron kristallografie. Hier beschrijven we onze aanpak in het screenen en identificeren van 2D-kristallen van overwegend kleine membraaneiwitten in de range van 15 - 90kDa.

Het beoordelen van twee-dimensionale Kristallisatie Trials van kleine membraaneiwitten voor Structurele Biologie Studies van Electron Kristallografie

De protocollen beschrijven de essentiële stappen voor het verkrijgen van diffractie kwaliteit kristallen van een membraaneiwit vanaf reconstructie van het eiwit in een lipidische kubieke fase (LCP), het vinden van de eerste voorwaarden met LCP-FRAP pre-kristallisatie assays, het opzetten van LCP kristallisatie onderzoeken en oogsten kristallen .

Kristallisatie van membraaneiwitten in lipide mesofasen

Bicelles zijn lipide / amfifiele mengsels die membraaneiwitten (MP's) te behouden binnen een lipide bilaag, maar hebben een unieke fase gedrag dat high-throughput screening vergemakkelijkt door kristallisatie robots. Deze techniek heeft met succes geproduceerd een aantal hoge resolutie structuren van zowel prokaryotische en eukaryotische bronnen. Deze video beschrijft protocollen voor het genereren van de lipidische bicelle mengsel, waarin parlementsleden in de bicelle mengsel, het opzetten van...

High-throughput Kristallisatie van membraaneiwitten Met behulp van de lipidische Bicelle Method

Hierin beschreven een robot benadering high-throughput kristallisatie van membraaneiwitten in lipidische mesofasen voor gebruik in structuurbepaling met macromoleculaire X-ray kristallografie. Drie robots staat de behandeling van de viskeuze en kleverige eiwit beladen mesofase een integraal onderdeel van de methode worden geïntroduceerd.

Gebruik van een robot voor High-throughput Kristallisatie van membraaneiwitten in lipide mesofasen

β-vat buitenmembraaneiwitten (OMP's) hebben veel functies binnen de buitenmembraan van gramnegatieve bacteriën, mitochondriën en chloroplasten. Hier hopen we een bekende knelpunt in structurele studies te verlichten door protocollen te presenteren voor de productie van β-vat OMP's in voldoende hoeveelheden voor structuurbepaling door röntgenkristallografie of NMR-spectroscopie.

Van Constructen naar Crystals - Naar Structuur Bepaling van β-barrel Outer Membrane Proteins

Structurele studies van biomacromolecules door kristallografie vereisen hoogwaardige kristallen. Hier demonstreren we een protocol dat kan worden gebruikt door OptiCrys (een volledig geautomatiseerd instrument ontwikkeld in ons lab) en / of microdialyseknoppen voor het kweken van grote hoogwaardige kristallen op basis van kennis van het kristallisatiefasediagram.

Optimalisatie van kristalgroei voor neutronenmacromoleculaire kristallografie

Het doel van dit artikel is om de kijker een goed begrip te geven van hoe ze hun kleine volume, dampdiffusieprotocol, voor het kweken van grote, enkele eiwitkristallen, kunnen transformeren in een grote batch microkristallisatiemethode voor seriële kristallografie.

Optimaliseren van de groei van endothiapepsine kristallen voor seriële kristallografie experimenten

Lipide monolagen worden al tientallen jaren gebruikt als basis voor het vormen van tweedimensionale (2D) eiwitkristallen voor structurele studies. Ze zijn stabiel op het lucht-water interface en kunnen dienen als een dun ondersteunend materiaal voor elektronenbeeldvorming. Hier presenteren we de bewezen stappen voor het voorbereiden van lipide monolagen voor biologische studies.

Monstervoorbereiding met behulp van een lipide monolaagmethode voor elektronenkristallografische studies

Het gepresenteerde protocol beschrijft een eenvoudige aanpak voor het screenen van eiwitkristallisatieomstandigheden en kristalgroei met behulp van een 96-well high-throughput dialyseplaat. Het gebruik van dialysatorbuizen voor de grootschalige groei van microkristallen wordt ook gedemonstreerd voor seriële kristallografie en MicroED-toepassingen.

High-Throughput Eiwitkristallisatie via microdialyse

We presenteren een protocol voor de kristallisatie van eiwitten met behulp van de kristallisatiefaciliteit in het Research Complex in Harwell en de daaropvolgende in situ röntgenkristallografische gegevensverzameling van kristallen in de platen bij Diamond's Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) beamline. We beschrijven monstervereisten, kristallisatieprotocollen en richtlijnen voor gegevensverzameling.

Kristallisatie en in situ verzameling van gegevens over kamertemperatuur met behulp van de kristallisatiefaciliteit in Harwell en Beamline VMXi, Diamond Light Source

Leer het oogsten en cryo-koelen van membraaneiwitkristallen gekweekt in lipide mesofasen. Deze methode behoudt kristalintegriteit voor röntgendiffractie en structurele analyse.

Oogst en Cryo-koeling kristallen van membraaneiwitten Grown in lipide mesofasen voor structuurbepaling door Macromoleculaire Kristallografie (Video) | JoVE Journal

Oogst en Cryo-koeling kristallen van membraaneiwitten Grown in lipide mesofasen voor structuurbepaling door Macromoleculaire Kristallografie

Meer video's verkennen