Name: Het in kaart brengen Bacteriële Functionele Netwerken en Wegen in Escherichia Coli Gebruik van synthetische Genetische Arrays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 6 s
Description: Leer functionele relaties tussen bacteriële genen en paden onderzoeken met eSGA-technologie in Escherichia coli. Deze methode identificeert genetische interacties via high-throughput screening van dubbele mutanten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de middelen van Genome Canada, de Ontario Genomics Institute, en de Canadese Institutes of Health Research subsidies aan JG en AE AG is een ontvanger van Vanier Canada Graduate Scholarship.

<ol><li>Bandyopadhyay, S., Kelley, R., Krogan, N. J., Ideker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maps+of+protein+complexes+from+quantitative+genetic+interaction+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional maps of protein complexes from quantitative genetic interaction data.</a> PLoS Comput. Biol. 4, e1000065(2008).</li>
<li>Costanzo, M., Baryshnikova, A., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charting+the+genetic+interaction+map+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Charting the genetic interaction map of a cell.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22, 66-74 (2011).</li>
<li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+landscape+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-4231 (2010).</li>
<li>Fiedler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+the+S.+cerevisiae+phosphorylation+network%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional organization of the S. cerevisiae phosphorylation network.</a> Cell. 136, 952-963 (2009).</li>
<li>Roguev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+and+rewiring+of+functional+modules+revealed+by+an+epistasis+map+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conservation and rewiring of functional modules revealed by an epistasis map in fission yeast.</a> Science. 322, 405-4010 (2008).</li>
<li>Schuldiner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+the+function+and+organization+of+the+yeast+early+secretory+pathway+through+an+epistatic+miniarray+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li>
<li>Wilmes, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+interaction+map+of+RNA-processing+factors+reveals+links+between+Sem1%2FDss1-containing+complexes+and+mRNA+export+and+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">A genetic interaction map of RNA-processing factors reveals links between Sem1/Dss1-containing complexes and mRNA export and splicing.</a> Mol. Cell. 32, 735-746 (2008).</li>
<li>Babu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems-level+approaches+for+identifying+and+analyzing+genetic+interaction+networks+in+Escherichia+coli+and+extensions+to+other+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Systems-level approaches for identifying and analyzing genetic interaction networks in Escherichia coli and extensions to other prokaryotes.</a> Mol. Biosyst. 12, 1439-1455 (2009).</li>
<li>Butland, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((coli+synthetic+genetic+array+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">coli synthetic genetic array analysis.</a> Nat. Methods. 5, 789-7895 (2008).</li>
<li>Typas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+peptidoglycan+synthesis+by+outer-membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of peptidoglycan synthesis by outer-membrane proteins.</a> Cell. 143, 1097-10109 (2010).</li>
<li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Mol. Syst. Biol. 2, 2006-200008 (2006).</li>
<li>Babu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+interaction+maps+in+Escherichia+coli+reveal+functional+crosstalk+among+cell+envelope+biogenesis+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic interaction maps in Escherichia coli reveal functional crosstalk among cell envelope biogenesis pathways.</a> PLoS Genet. 7, e1002377(2011).</li>
<li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+landscape+of+a+bacterial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phenotypic landscape of a bacterial cell.</a> Cell. 144, 143-156 (2011).</li>
<li>Babu, M., Gagarinova, A., Greenblatt, J., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array-based+synthetic+genetic+screens+to+map+bacterial+pathways+and+functional+networks+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Array-based synthetic genetic screens to map bacterial pathways and functional networks in Escherichia coli.</a> Methods Mol Biol. 765, 125-153 (2011).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-665 (2000).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+recombination+system+for+chromosome+engineering+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5978-5983 (2000).</li>
<li>Typas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((quantitative+analyses+of+genetic+interactions+in%5BTitle%5D)+AND+%22E.+coli.+Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">quantitative analyses of genetic interactions in.</a> E. coli. Nat. Methods. 5, 781-787 (2008).</li>
<li>Zeghouf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+Peptide+Affinity+%28SPA%29+system+for+the+identification+of+mammalian+and+bacterial+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Sequential Peptide Affinity (SPA) system for the identification of mammalian and bacterial protein complexes.</a> J. Proteome Res. 3, 463-468 (2004).</li>
<li>Davierwala, A. P., et al. , 1147-1152 (2005).</li>
<li>Breslow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+strategy+enabling+high-resolution+functional+analysis+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome.</a> Nat. Methods. 5, 711-718 (2008).</li>
<li>Babu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+peptide+affinity+purification+system+for+the+systematic+isolation+and+identification+of+protein+complexes+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequential peptide affinity purification system for the systematic isolation and identification of protein complexes from Escherichia coli.</a> Methods Mol. Biol. 564, 373-400 (2009).</li>
<li>Butland, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+network+containing+conserved+and+essential+protein+complexes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli.</a> Nature. 433, 531-537 (2005).</li>
<li>Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+functional+atlas+of+Escherichia+coli+encompassing+previously+uncharacterized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins.</a> PLoS Biol. 7, (2009).</li>
<li>Anderson, R. P., Roth, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+genetic+duplications+in+phage+and+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Tandem genetic duplications in phage and bacteria.</a> Annu. Rev. Microbiol. 31, 473-505 (1977).</li>
<li>Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+genetic+interactions+and+networks+with+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Exploring genetic interactions and networks with yeast.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 437-449 (2007).</li>
<li>Collins, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+dissection+of+protein+complexes+involved+in+yeast+chromosome+biology+using+a+genetic+interaction+map%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional dissection of protein complexes involved in yeast chromosome biology using a genetic interaction map.</a> Nature. 446, 806-8010 (2007).</li>
<li>Le Meur, N., Gentleman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+synthetic+lethality%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Modeling synthetic lethality.</a> Genome Biol. 9, R135(2008).</li>
<li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li>
<li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+mapping+of+the+yeast+genetic+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global mapping of the yeast genetic interaction network.</a> Science. 303, 808-813 (2004).</li>
<li>Wong, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+biological+networks+to+predict+genetic+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Combining biological networks to predict genetic interactions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 15682-15687 (2004).</li>
<li>van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn-seq%3A+high-throughput+parallel+sequencing+for+fitness+and+genetic+interaction+studies+in+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms.</a> Nat. Methods. 6, 767-772 (2009).</li>
<li>Gagarinova, A., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+genetic+manipulation+methods+for+exploring+bacterial+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Genome-scale genetic manipulation methods for exploring bacterial molecular biology.</a> Mol. Biosyst. 8, 1626-1638 (2012).</li>
<li>Dewey, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+orthology%3A+putting+genomic+evolutionary+relationships+into+context%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Positional orthology: putting genomic evolutionary relationships into context.</a> Brief Bioinform. 12, 401-412 (2011).</li>
<li>St Onge, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+pathway+analysis+using+high-resolution+fitness+profiling+of+combinatorial+gene+deletions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Systematic pathway analysis using high-resolution fitness profiling of combinatorial gene deletions.</a> Nat. Genet. 39, 199-206 (2007).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

We hebben geschetst een stapsgewijze protocol voor het gebruik van robotica eSGA screening voor bacteriële gen functies te onderzoeken op een pad niveau door ondervragen GI. Deze benadering kan worden gebruikt om individuele genen alsmede gehele biologische systemen te bestuderen in E. coli. Voorzichtig uitvoeren van de experimentele hierboven beschreven stappen, inclusief alle passende controles en grondig analyseren en onafhankelijk valideren van de gegevens GI belangrijke aspecten voor het succes van eSGA he...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;I. Antibiotica&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Chloramfenicol</td><td>Bioshop</td><td>#CLR201</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycine</td><td></td><td>#KAN201</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td></td><td># AMP201</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2. Luria-Bertani-medium&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>LB-poeder</td><td>Bioshop</td><td>#LBL405</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Bioshop</td><td>#AGR003</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;3. Bacteriële stammen en plasmiden&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Hfr Cavalli-stam &amp;#955;&lt;sub&gt;rood&lt;/sub&gt; systeem (JL238)</td><td>Babu &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pKD3</td><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; Genetic Stock Centre, Yale</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keio &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; F- recipient-collectie</td><td>National BioResource Project (NBRP) van Japan&lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hypomorf &lt;em&gt;E. coli &lt;/em&gt;F- SPA-tag-stammen</td><td>Open biosystemen; Babu &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;4. Primers&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>op pKD3 gebaseerde ontzilte constante primers</td><td></td><td></td><td>F1: 5'-GGCTGACATGGGAATTAGC-3'&#039;&lt;br/&gt; R1: 5'-AGATTGCAGCATTACACGTCTT-3'</td></tr><tr><td>Ontgezoutte custom primers</td><td></td><td></td><td>Cm-R: 5'-TTATACGCAAGGCGACAAGG-3'&#039;&lt;br/&gt; Cm-F: 5'- GATCTTCCGTCACAGGTAGG-3'</td></tr><tr><td>Ontzoute custom primers</td><td></td><td></td><td>F2 en R2: 20 nt constante regio's gebaseerd op de pKD3-sequentie en 45 nt aangepaste homologieregio's&lt;br/&gt; F2-constante regio:&lt;br/&gt; 5'-CATATGAATATCCTCCTTA-3'&#039;&lt;br/&gt; R2 constante regio:&lt;br/&gt; 5'-TGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'
S1 en S2: 27 nt constante regio's voor het primen van de amplificatie van de SPA-Cm-cassette en 45 nt aangepaste homologieregio's&lt;br/&gt; S1-constante regio:&lt;br/&gt; 5'AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3&#039;&lt;br/&gt; S2-constante regio:&lt;br/&gt; 5'- GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3'&#039;&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; KOCO-F en KOCO-C: 20 nt primers op 200 bp afstand van de deletieplaats van het niet-essentiële gen of het essentiële&lt;Fenotypes worden bepaald door een complexe reeks fysieke (bijv. eiwit-eiwit) en functionele (bijv. gen-gen of genetische) interacties (GI)1. Hoewel fysieke interacties kunnen aangeven welke bacteriële eiwitten als complexen geassocieerd zijn, onthullen ze niet noodzakelijkerwijs functionele relaties op pathway-niveau1. GI-screenings, waarbij de groei van dubbele mutanten met twee verwijderde of geïnactiveerde genen wordt gemeten en vergeleken met de overeenkomstige enkelvoudige mutanten, kunnen epstatische afhankelijkheden tussen loci verduidelijken en bieden zo een middel om nieuwe functionele relaties te onderzoeken en te ontdekken2. Grootschalige GI-kaarten zijn gerapporteerd voor eukaryote organismen zoals gist3-7, maar GI-informatie blijft schaars voor prokaryoten8, wat de functionele annotatie van bacteriële genomen belemmert. Hiervoor hebben wij en anderen high-throughput kwantitatieve bacteriële GI-screeningsmethoden ontwikkeld9, 10. Hier presenteren wij de belangrijkste stappen die nodig zijn om een kwantitatieve E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screeningprocedure op genoomniveau uit te voeren9, waarbij natuurlijke bacteriële conjugatie en homologe recombinatie worden gebruikt om systematisch grote aantallen dubbele mutanten te genereren en hun fitness te meten in een colony array-formaat. Kort gezegd wordt een robot gebruikt om via conjugatie chloramphenicol (Cm)-gemarkeerde mutante allelen van gemanipuleerde Hfr (High frequency of recombination) 'donorstammen' over te dragen naar een geordende array van kanamycin (Kan)-gemarkeerde F- recipiënte stammen. Doorgaans gebruiken we loss-of-function enkelvoudige mutanten met deleties van niet-essentiële genen (bijv. de 'Keio'-collectie11) en hypomorfe mutaties van essentiële genen (d.w.z. allelen die leiden tot een verminderde eiwitexpressie, stabiliteit of activiteit9, 12, 13) om respectievelijk de functionele associaties van niet-essentiële en essentiële genen te onderzoeken. Na conjugatie en de daaropvolgende genetische uitwisseling via homologe recombinatie worden de resulterende dubbele mutanten geselecteerd op vast medium dat beide antibiotica bevat. Na uitgroei worden de platen digitaal gefotografeerd en worden de koloniegroottes kwantitatief gescoord met een intern geautomatiseerd systeem voor beeldbewerking14. GI's worden onthuld wanneer de groeisnelheid van een dubbele mutant significant beter of slechter is dan verwacht9. Verergerende (of negatieve) GI's treden vaak op tussen loss-of-function mutaties in paren genen van compensatoire pathways die inwerken op hetzelfde essentiële proces2. Hierbij wordt het verlies van een enkel gen gebufferd, waardoor elke enkelvoudige mutant levensvatbaar is. Echter, het verlies van beide pathways is schadelijk en resulteert in synthetische lethaliteit of ziekte (d.w.z. trage groei). Omgekeerd kunnen verlichtende (of positieve) interacties optreden tussen genen in dezelfde pathway of hetzelfde eiwitcomplex2, aangezien de deletie van elk van de genen afzonderlijk vaak voldoende is om de normale functie van de pathway of het complex te perturberen, zodat aanvullende perturbaties de activiteit en daarmee de groei niet verder verminderen. Over het algemeen kan het systematisch identificeren en analyseren van GI-netwerken onbevooroordeelde, globale kaarten opleveren van de functionele relaties tussen grote aantallen genen, waaruit informatie op pathway-niveau kan worden afgeleid die door andere benaderingen wordt gemist9.&gt; insertieplaats van de gen-SPA-tag</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;5. Reagentia voor PCR en elektroforese&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Taq DNA-polymerase</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>10X PCR-buffer</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP's</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>25 mM MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td># AGA002</td><td></td></tr><tr><td>Laadkleurstof</td><td>NEB</td><td>#B7021S</td><td></td></tr><tr><td>Ethidiumbromide</td><td>Bioshop</td><td># ETB444</td><td></td></tr><tr><td>10X TBE-buffer</td><td>Bioshop</td><td># ETB444.10</td><td></td></tr><tr><td>Tris-basis</td><td>Bioshop</td><td># TRS001</td><td></td></tr><tr><td>Boorzuur</td><td>Sigma</td><td># T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA (pH 8,0)</td><td>Sigma</td><td># B6768-500G</td><td></td></tr><tr><td>DNA-ladder</td><td>NEB</td><td>#N3232L</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;6. Kits voor DNA-isolatie en zuivering&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Kit voor isolatie en purificatie van genomisch DNA</td><td>Promega</td><td>#A1120</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Midi-kit</td><td>Qiagen</td><td># 12143</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR-zuiveringskit</td><td>Qiagen</td><td>#28104</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;7. Apparatuur voor PCR, transformatie en replica-pinning&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>BioRad, iCycler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarosegelelektroforese</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>Bio-Rad GenePulser II</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 cm elektroporatiecuvette</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>42 &amp;deg;C waterbadschudden</td><td>Innova 3100</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter TJ-25 centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>32 &amp;deg;C-schudmachine</td><td>New Brunswick Scientific, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>32 &amp;deg;C-plaatincubator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RoToR-HDA laboratoriumrobot</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pads met een pinnen-dichtheid van 96, 384 en 1.536</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 of 384 lange pinnen</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;8. Beeldvormingsapparatuur&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Camerastatief</td><td>Kaiser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digitale camera, 10 megapixel</td><td>Alle leveranciers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lichtbakken, Testrite 16&quot; x 24&quot; eenheden</td><td>Testrite</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;9. Recyclen van pads of platen &lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>10% bleekmiddel</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td>Alle leveranciers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steriel gedestilleerd water</td><td>Willekeurige leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminaire flowkast</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultravioletlamp</td><td>Alle leveranciers</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;10. Labware&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>50 ml polypropyleenbuizen</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml microcentrifugebuisjes</td><td>Alle leveranciers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml Erlenmeyerkolven</td><td>VWR</td><td># 29140-045</td><td></td></tr><tr><td>15 ml steriele kweekbuisjes</td><td>Thermo Scientific</td><td># 366052</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>VWR</td><td># 479-3221</td><td></td></tr><tr><td>Rechthoekige platen</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-wells en 384-wells microtiterplaten</td><td>Singer Instruments</td><td>Nunc</td><td></td></tr><tr><td>Platenroller voor het afsluiten van multi-well platen</td><td>Sigma</td><td>#R1275</td><td></td></tr><tr><td>platen</td><td>ABgene</td><td># AB-0580</td><td></td></tr><tr><td>Zelfklevende plaatafdichtingen</td><td>Fisher Scientific</td><td># 13-990-14</td><td></td></tr><tr><td>-80 &amp;deg;C-vriezer</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

het in kaart brengen bacteriële functionele netwerken en wegen in<em&gt; escherichia coli</em&gt; gebruik van synthetische genetische arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Fenotypen bepaald door een complexe reeks fysieke (bv. eiwit-eiwit) en functionele (bijv. gen-gen of genetische) interacties (GI) 1. Terwijl fysieke interacties kunnen aangeven welke bacteriële eiwitten worden geassocieerd als complexen, doen ze niet per se onthullen pad-level functionele relationships1. GI schermen, waarbij de groei van dubbele mutanten voorzien van twee genen verwijderd of geïnactiveerd wordt gemeten en vergeleken met de overeenkomstige enkelvoudige mutanten kunnen verlichten epistatisch afhankelijkheden tussen loci en dus een middel op te vragen en te ontdekken nieuwe functionele relaties 2. Grootschalige GI maps gemeld voor eukaryote organismen zoals gisten 3-7, maar GI informatie blijft dun voor prokaryoten 8, dat de functionele annotatie van bacteriële genomen belemmert. Hiertoe hebben wij en anderen ontwikkeld high-throughput kwantitatieve bacteriële GI screeningsmethoden 9, 10 </sup&gt;. Hier presenteren we de belangrijkste stappen die nodig zijn om kwantitatieve E. uit te voeren coli Genetic Synthetic Array (eSGA) screening procedure op genoom-schaal 9, met natuurlijke bacteriële conjugatie en homologe recombinatie systemisch genereren en de geschiktheid van grote aantallen dubbele mutanten in een array formaat kolonie te meten. kort wordt een robot gebruikt voor het doorschakelen , door middel van conjugatie, chlooramfenicol (Cm) - gemarkeerde mutante allelen van engineering HFR (hoge frequentie van recombinatie) &quot;donor stammen &#39;in een geordende reeks van kanamycine (Kan) - gemarkeerde F-ontvanger stammen. Typische toepassingsgebieden loss-of-function enkele mutanten richting niet-essentieel gen deleties (bijvoorbeeld de &#39;Keio&#39; collectie 11) en essentiële gen hypomorphic mutaties (bijvoorbeeld allelen verleent verminderde eiwitexpressie stabiliteit of activiteit 9, 12, 13) te bevragen de functionele verenigingen van niet-essentiële en essentiële genen, respectively. Na conjugatie en daaropvolgende genetische uitwisseling gemedieerd door homologe recombinatie worden de resulterende dubbele mutanten geselecteerd op vast medium dat beide antibiotica. Na uitgroei worden de platen digitaal belicht en kolonie maten kwantitatief gescoord op een eigen geautomatiseerde beeldverwerkingsysteem 14. GI&#39;s worden onthuld wanneer de groeisnelheid van een dubbele mutant is ofwel significant beter of slechter dan verwachte 9. Verzwarende (of negatieve) GA vaak resulteren tussen loss-of-function mutaties in genen paren van compenserende pathways die van invloed zijn op dezelfde essentiële proces 2. Hier wordt het verlies van een gen gebufferd, zodat zowel enkelvoudige mutant levensvatbaar is. Het verlies van beide routes schadelijk is en resulteert in synthetische letaliteit of ziekte (langzame groei). Omgekeerd kunnen verlichten (of positief) interacties optreden tussen genen in dezelfde route of eiwit complex 2 alsdeletie van beide genen alleen is vaak voldoende om de normale functie van de signalisatieweg of complex zodanig dat aanvullende verstoringen niet activiteit te verminderen, waardoor groei verder verstoren. Overall kan systematisch identificeren en analyseren GI netwerken onpartijdige, wereldkaarten van de functionele samenhang tussen grote aantallen genen, waarvan pathway belangrijke informatie gemist andere benaderingen kunnen worden afgeleid 9.

GI's onthullen functionele relaties tussen genen. Aangezien genen in dezelfde route vergelijkbare GI-patronen vertonen en de gelijkenis van het GI-profiel de congruentie van fenotypes vertegenwoordigt, kunnen we functioneel gerelateerde genen in routes groeperen door hun GI-profielen te clusteren. Het integreren van GI- en GI-correlatienetwerken met informatie over fysieke interacties of andere associatiedata, zoals genomische context (GC)-relaties, kan ook de organisatie van functionele modules van een hogere orde onthu...

Systematische, grootschalige synthetische genetische (gen-gen of epistase) interactie schermen kunnen worden gebruikt om genetische redundantie en route overspraak verkennen. Hier hebben we een high-throughput kwantitatieve synthetische genetische scala screening technologie te beschrijven, genoemd eSGA door ons ontwikkelde voor het ophelderen van epistatisch relaties en het verkennen van genetische interactie netwerken in<em&gt; Escherichia coli</em&gt;.

Het in kaart brengen Bacteriële Functionele Netwerken en Wegen in<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Gebruik van synthetische Genetische Arrays

Fenotypen worden bepaald door een complexe reeks fysieke (bijv. eiwit-eiwit) en functionele (bijv. gen-gen of genetische) interacties (GI)1. Terwijl ...

Het doel van deze procedure is om de functionele relaties tussen bacteriële genen en pathways te onderzoeken. Dit wordt bereikt door eerst arrays van Escherichia coli voor te bereiden, bestaande uit enkelvoudige mutantstammen die geconjugeerd of gepaard zullen worden. De tweede stap is het conjugeren van de enkelvoudige mutanten in een array-formaat op platen.Vervolgens worden de dubbele mutanten geselecteerd. De laatste stap is het afbeelden van de platen met dubbele mutanten en het kwantificeren van de dubbele mutantkoloniën om de fitness van de stam te bepalen. Uiteindelijk worden de gegevens over de koloniegrootte geanalyseerd om genetische interactiescores te berekenen en functioneel interagerende genen, signaalpaden en processen te identificeren.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals willekeurige mutagenese, is dat er veel individuele dubbele mutantstammen kunnen worden gecreëerd. Bovendien kunnen de interacties tussen veel genen gelijktijdig worden beoordeeld, ongeacht de gengrootte, essentialiteit of de fitness van de enkelvoudige genmutant. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de systee

mapping-bacterial-functional-networks-pathways-escherichia-coli-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Bacteriële Gene Expression analyse met behulp van Microarrays

Affiniteitszuivering van gemerkte eiwitten in combinatie met massaspectrometrie (APM) is een krachtige methode voor systematische mapping van eiwit interactie netwerken en het onderzoeken van de mechanistische basis van biologische processen. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde sequentiële peptide affiniteit (SPA) APM procedure ontwikkeld voor de...

Identificatie van eiwit complexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Met Sequential Peptide Affinity Purification in combinatie met tandem massaspectrometrie

Het ontwerp van een synthetische operon codeert voor zowel de secretoire inrichting en de structurele monomeren Curli vezels beschreven. Overproductie van deze amyloïden en hechtende polymeren kan een meetbare versterking van de hechting van...

Techniek Adherent Bacteriën door het creëren van een synthetische Curli Operon

Deze vijfdaagse protocol beschrijft alle stappen, apparatuur en aanvullende software voor het maken en uitvoeren van een efficiënte endogene Escherichia coli op basis TX-TL-cel-vrije expressie systeem vanaf nul. Met reagentia, het protocol duurt 8 uur of minder voor het inrichten van een reactie, verzamelen en verwerken van gegevens.

Protocollen voor implementatie van een Escherichia coli Op basis TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Fotogeactiveerde lokalisatie microscopie (PALM) in combinatie met single-molecule-tracking maakt directe observatie en kwantificering van eiwit-DNA-interacties in levende Escherichia coli cellen.

Visualiseren eiwit-DNA-interacties in levende bacteriële cellen met behulp Photoactivated Enkelmolecuul Tracking

Hier presenteren we fenomisch aanpakken voor de functionele karakterisering van putatieve faaggenen. Technieken omvatten een ontwikkelde test die in staat is om het anabole metabolisme van de gastheer te monitoren, de Multi-fenotype Assay Plates (MAPs), naast de gevestigde methode van metabolomics, die in staat is om effecten op katabool metabolisme te meten.

Faag phenomics: Fysiologische Approaches te karakteriseren Novel virale eiwitten

Bacteriële effector eiwitten zijn belangrijk voor het vaststellen succesvolle infecties. Dit protocol beschrijft de experimentele identificatie van proteïne bindingspartners van een bacteriële effector eiwit in zijn natuurlijke plantaardige gastheer. Het identificeren van deze effector interacties via gist-twee-hybride-schermen is uitgegroeid tot een belangrijk instrument in het ontrafelen van de moleculaire pathogeniteit strategieën.

Het ontrafelen van de functie van een bacteriële Effector uit een niet-landbouw Plant Pathogeen Met behulp van een gist two-hybrid screen

Dit artikel presenteert een reeks protocollen voor het ontwikkelen van gemanipuleerde cellen en gefunctionaliseerde oppervlakken die het mogelijk maken synthetisch gemanipuleerde E. coli te beheersen en te manipuleren programmeerbare materiaal oppervlakken.

Met behulp van synthetische biologie levende cellen Engineer die interface met programmeerbare Materials

Hier, werd de kracht van een transposon-gemedieerde willekeurige invoeging van een niet-coderende DNA element gebruikt om op te lossen zijn optimale chromosomale positie.

Bepaling van de optimale chromosomale locatie (s) voor een DNA Element in Escherichia coli met behulp van een nieuwe benadering van Transposon-gemedieerde

De haalbaarheid van whole-genome sequencing (WGS) strategieën met behulp van benchtop instrumenten heeft de genoomondervraging van elke microbe van volksgezondheidsrelevantie in een laboratoriumomgeving vereenvoudigd. Een methodologische aanpassing van de workflow voor bacteriële WGS wordt beschreven en een bioinformatica pijplijn voor analyse wordt ook gepresenteerd.

Karakterisering van een pathogene Escherichia coli-stam afgeleid van Oreochromis spp. Boerderijen met behulp van whole-genome sequencing

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het ontwerpen, bouwen en leveren van tetracycline-gecontroleerde geïnduceerbare synthetische schakelingen. Het effect van de synthetische circuits op de eliminatie van parasieten en de expressie van cytokines kan worden bestudeerd door de gepresenteerde pijplijn te kanaliseren. Dit protocol is relevant voor onderzoekers die op synthetische circuits gebaseerde therapieën bestuderen bij infectieziekten.

Immunometabole circuits bij infectie voor het bevorderen van gastheergerichte therapieën

Leer functionele relaties tussen bacteriële genen en paden onderzoeken met eSGA-technologie in Escherichia coli. Deze methode identificeert genetische interacties via high-throughput screening van dubbele mutanten.

Het in kaart brengen Bacteriële Functionele Netwerken en Wegen in

Meer video's verkennen