Het in kaart brengen Bacteriële Functionele Netwerken en Wegen in Escherichia Coli Gebruik van synthetische Genetische Arrays

Het doel van deze procedure is om de functionele relaties tussen bacteriële genen en paden te onderzoeken. Dit wordt bereikt door eerst een reeks ceia coli te bereiden, enkele mutante stammen die geconjugeerd of gekoppeld zullen worden. De tweede stap is om de enkele mutanten in een array-formaat op platen te conjugeren.

Vervolgens worden de dubbele mutanten geselecteerd. De laatste stap is om de dubbele mutant platen te beelden en dubbele mutant kolonies te kwantificeren om de fitheid van de stammen te bepalen. Uiteindelijk worden de gegevens over de koloniegrootte geanalyseerd om genetische interactiescores te berekenen en functioneel interacterende genen, paden en processen te identificeren.

Het grote voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals willekeurige mutagenese, is dat er veel individuele dubbele mutante stammen kunnen worden gecreëerd. Bovendien kunnen de interacties tussen veel genen tegelijkertijd worden beoordeeld, ongeacht de grootte van het gen, de essentieelheid of de fitheid van het enkele genmutant. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van systeembhewetenis, zoals die met betrekking tot genfuncties en functionele kruisgesprekken tussen paden en processen.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van bacteriële infecties omdat kennis over de meest functioneel centrale genen en processen, evenals het begrip van welke combinaties van bacteriële genen, paden en processen wanneer verstoord de bacteriële fitheid verbeteren of verminderen, zal helpen bij het ontwikkelen van de meest effectieve interventiestrategieën Om dit protocol te beginnen. Er wordt gebruik gemaakt van een twee-staps geneste PCR-amplificatie om het doelwit open leesraam te vervangen door een chlooramfenicolresistentiemarker van de PKD drie plasmide zoals beschreven in de schriftelijke procedure.

Bevestig het verwachte product en zuiver de verkregen fragment volgens het protocol van de fabrikant. Na het elueren van het PCR-product in 30 microliter sterieel gedistilleerd water verdunnen tot ongeveer 50 milligram per microliter concentratie. Het gezuiverde product wordt bewaard bij min 20 graden Celsius vóór transformatie.

Bereid vervolgens de hoge frequentie van recombinatie of HFR Caval competente cellen voor voor donorconstructie. Inoculeer eerst een milliliter van een verzadigde overnachtelijke cultuur van de HFR Cavalli-stam in 70 milliliter vers LB-medium met 35 microliters van 50 milligram per milliliter. Ampicilline in een 250 milliliter fles.

Incubeer de cultuur bij 32 graden Celsius door zachtjes te schudden bij 220 RPM tot een optische dichtheid van ongeveer 0,5 tot 0,6 is verkregen. Breng vervolgens de cultuur over naar een waterbad voor warmte-inductie van het Lambda Red Recombination-systeem bij 42 graden Celsius gedurende 15 minuten met schommelen bij 160 RPM om de inductie te stoppen. Breng de cultuur over naar een gekoeld ijsslurry waterbad gedurende 10 tot 20 minuten bij 160 RPM.

Zorg ervoor dat de cellen koud blijven tot na de transformatie. Na het wassen en oogsten van de cellen door centrifugatie zoals beschreven in het schriftelijke protocol, decant de senna en suspendeer de pellet in 500 microliter ijskoud, 10% glycerol Eloqua. De cellen in volumes van 50 microliter in afzonderlijke voorgekoelde 1,5 milliliter microcentribuizen en ga onmiddellijk verder met transformatie.

Voeg 100 nanogram gezuiverd gendeletiecassette toe aan de competente cellen. Draai het buisje en laat de suspensie vijf minuten op ijs zitten. Breng vervolgens de suspensie over naar een voorgekoelde elektroporatie vet electro, gebruik de celmengsel onmiddellijk.

Voeg een milliliter kamertemperatuur SOC-medium toe en breng de geelektroporeerde cellen in medium over in een 15 milliliter kweekbuis. Incubeer de cellen bij 32 graden Celsius gedurende een uur met orbitaal schommelen bij 220 RPM. Na incubatie worden de cellen gecentrifugeerd bij 4.400 keer G gedurende vijf minuten.

Bij kamertemperatuur verwijder ongeveer 850 microliter van de supinate en suspendeer het celpellet in de resterende vloeistof. Verdeel de cellen op LB-platen bevattende 17 microgram per milliliter chlooramfenicol en incubeer bij 32 graden Celsius overnacht. De volgende dag strekt u twee individuele transformanten uit op LB chlooramfenicol platen voor mutantbevestiging strekt u dezelfde transformanten uit op LB kan mycine platen om te bevestigen dat de stammen niet kan mycine resistent zijn.

Vervolgens wordt het DNA versterkt met drie verschillende sets van knockoutbevestigingsprimers zoals beschreven in de schriftelijke procedure. De eerste primerset bestaat uit een 20 nucleotide flankende voorwaartse primer gelegen 200 basenparen stroomopwaarts van de beoogde regio en een omgekeerde primer, die complementair is aan de chlooramfenicolresistentiecassette. Deze amplificatie zal naar verwachting een 445 nucleotide amplicon produceren.

De tweede set bevat een voorwaartse primer, een knie tot de chlooramfenicolresistentie cassette sequentie en een omgekeerde flankerende bevestigingsprimer, die is ontworpen om 200 basenparen stroomafwaarts van het drie prime-uiteinde van het verwijderde gen aan te brengen. Deze amplificatiereactie zal naar verwachting een 309 nucleotide amplicon produceren. De derde PCR bevat zowel stroomopwaarts als stroomafwaarts flankerende primers.

Deze reactie is vereist om te bevestigen dat de geselecteerde stam geen beenmerg diploïde is met één genlocus die is vervangen door de cassette en een andere gedupliceerd, maar anders een wild type genkopie nog steeds aanwezig. Deze amplificatie zal naar verwachting een 1,4 KB product produceren. De e coli ke io enkele niet-essentiële gendeletie mutant collectie wordt replica pind robotisch naar 24 384.

Wel, microplaat bevattende 80 microliter vloeibaar LB-medium per putje. Aangevuld met 50 microgram per milliliter kan mycine om ruimte te maken voor de grenscontrolestam, die als positieve controle ontbreken en helpen bij plaatnormalisatie en bij geautomatiseerde kolonie kwantificering. Verwijder het geïncubeerde medium uit de buitenste putjes van elke plaat en breng het over naar nieuwe platen, waarbij de buitenste putjes leeg blijven.

Maak even