Identificatie van eiwit complexen in Escherichia coli Met Sequential Peptide Affinity Purification in combinatie met tandem massaspectrometrie
November 12th, 2012
Affiniteitszuivering van gemerkte eiwitten in combinatie met massaspectrometrie (APM) is een krachtige methode voor systematische mapping van eiwit interactie netwerken en het onderzoeken van de mechanistische basis van biologische processen. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde sequentiële peptide affiniteit (SPA) APM procedure ontwikkeld voor de bacterie Escherichia coli Die worden gebruikt voor het isoleren en stabiele multi-eiwitcomplexen karakteriseren buurt homogeniteit zelfs vanaf lage kopie-aantallen
Het doel van dit experiment is om eiwitten, eiwitinteracties en de subeenheidsamenstelling van inheemse MultiPro-complexen van e coli te identificeren. Dit wordt bereikt door de sequentiespecifieke lineaire PCR-producten te versterken, die het SPA-label en een selecteerbare marker coderen, die in frame worden geïntegreerd en tot expressie worden gebracht als carboxy-terminale fusies in een ddy 3, 3 0 achtergrond met behulp van het bacteriële Fage lambda-recombinatiesysteem. Als tweede stap wordt een tweedelige zuivering uitgevoerd met behulp van cow modlin en Anti-Flag-affiniteitkralen om efficiënt laag abundantie-eiwitcomplexen te herstellen. Vervolgens worden de gebonden eiwitten die met cow modlin zijn geallieerd, elutiebuffer of CEB gedigesteerd met trypsine en verwerkt met massaspectrometrie voor eiwitidentificatie.
De verkregen resultaten tonen aan dat de verschillende subeenheden van het kern-RNA-polymerase-enzym, inclusief de transcriptieterminatie, anti-determinatiefactoren, efficiënt meegezuiverd worden met het getagde RNA-polymerase subeenheid D-eiwit, wat aangeeft dat de nieuw geassocieerde componenten efficiënt kunnen worden ontdekt met behulp van deze aanpak. Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn voor deze methode worstelen met twee rondes affiniteitszuivering, waarbij zorgvuldige verwerking van de cellysaten met geschikte bufferoplossingen absoluut noodzakelijk is om succes te garanderen bij de efficiënte herstel van laag en hoog abundantie-lastcomplexen uit grootschalige culturen. Het demonstreren van de affiniteitszuivering en massaspectrometrieprocedures zullen Olga Kagan en HBO guo zijn, twee technici in mijn laboratorium. Dit protocol begint met het targeten van specifieke geamplificeerde sequenties naar de DDY drie 30-stam waarin de Lambda rode recombinatiemachinerie wordt uitgedrukt zoals beschreven in het geschreven protocol.
Vervolgens, waar de bacteriën farge Lambda recombinatiesysteem dat de stam overnacht in twee milliliters van Luria bati of LB-medium bij 32 graden Celsius, schuddend bij 180 RPM de volgende dag, inoculeer een milliliter van de overnachtelijke cultuur in 70 milliliter vers LB-medium in een 500 milliliter conische kolf. Laat het inoculum groeien bij 32 graden Celsius door te schudden bij 180 RPM tot de OD 600 ongeveer 0,8 bereikt. Induceer de cellen door de kolf in een waterbad bij 42 graden Celsius te incuberen door zachtjes te schudden bij 180 RPM gedurende 15 minuten.
Onmiddellijk na de inductie, incubeer de kolf in een ijs-waterslurrybad gedurende ten minste 30 minuten met schudden. Na het oogsten en wassen van de cellen zoals beschreven in de geschreven procedure, Reese suspendeer de celpellet in 700 microliter ijs, koud, steriel water resulterend in elektrocompetente cellen door middel van elektroporatie. Introduceer een microliter van het gezuiverde amplicon in 40 microliter van de elektrocompetente cellen.
De cellen worden geëlektroporeerd na homologe recombinatie en integratie. De transformanten die met succes de tag slash-cassette in het chromosoom hebben gecombineerd, worden geselecteerd op basis van resistentie tegen can mycine. Selecteer meerdere transformatoren voor western blotting om de correcte generatie van de SPA-gelabelde fusie-eiwitten te verifiëren met Anti-Flag M twee antilichaam dat selectief is tegen de flag-epitopen van de SPA-tag. Breng 10 milliliter van de overnachtelijke cultuur over in 990 milliliter vers tb. Aangevuld met 25 microgram per milliliter can mycine in een vierliterfles.
Laat de cultuur groeien bij 32 graden Celsius met constant schudden bij 250 RPM gedurende vijf tot zes uur tot de OD 600 tussen de twee tot drie bereikt. Breng de één liter e coli SPA-tagcultuur over naar schone centrifugatieflessen en centrifugeer de cellen bij vier graden Celsius en 3.993 keer G gedurende 15 minuten. Na hersuspensie van de cellen zoals beschreven in het geschreven protocol.
Breng de monsters over naar een steriele roestvrijstalen kom geplaatst op ijs voor sonicatie. Dompel de sonde in het monster en soniceer gedurende drie minuten. Laat na sonicatie nog eens twee minuten staan om het monster te laten afkoelen van oververhitting na centrifugatie van het sonicaatlysaat.
Breng voorzichtig de S-supernatant van de centrifugeerbuis over naar een 50 milliliter polypropyleen valkenbuis. Vries het monster in vloeibaar stikstof in en bewaar het gesoniceerde bevroren celextract maximaal zes maanden bij minus 80 graden Celsius voor toekomstig gebruik. Om te beginnen met affiniteitszuivering voor het bevroren gesoniceerde celextract door de buis in koud water te plaatsen, incubeer het TH-celextract met drie microliters van benzo, een nuclease gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius.
Voeg aan dit mengsel niet-ionisch detergent Triton X 100 en 200 microliter suspensie van Anti-Flag M twee agrokralen toe. Meng voorzichtig de inhoud door de buis gedurende drie uur bij vier graden Celsius te draaien na drie uur draaien, centrifugeer de buis bij 1.700 keer G gedurende zes minuten. Verwijder na centrifugatie voorzichtig zoveel mogelijk sate zonder de losse snelheidspellet te verstoren.
Hersuspenseer de pellet in de resterende SNA en breng het vervolgens over in een polypropyleen prep-kolom. Verwijder de bodemplugs van de kolom om de eluaat door zwaartekrachtstroom te laten weglopen. Was vervolgens de kolom vijf keer met 200 microliter van een keer FC-buffer en ga verder met Cleve met TEV zoals beschreven in het geschreven protocol.
Volg de splitsing snel aan zowel de boven- als onderkant van de kolom stevig. Meng voorzichtig de inhoud in de kolom door overnacht bij vier graden Celsius te draaien. Laat de eluaat weglopen door de bovenkap en de bodemplug in de nieuwe kolom te verwijderen.
Was de oude kolom met 400 microliter van een keer cal Modlin-bindingsbuffer en 150 microliter suspensie van Cal Modlin-bindingskralen. Eluteer het gebonden eiwit in vier fracties van 50 microliter in een verse eend of orph-buis. Gebruik een keer cal Modlin-elutiebuffer.
Verdeel de geelueerde fractie in twee schone eend of orph-buizen in gelijke volumes.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een geoptimaliseerde sequentiële peptide affiniteit massaspectrometrie (APMS) procedure voor het isoleren en karakteriseren van eiwitcomplexen in Escherichia coli. De methode maakt het mogelijk om eiwitinteracties en de samenstelling van native MultiPro complexen te identificeren, zelfs van eiwitten met een lage abundantie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Biochemie
- Proteomics
- Microbiologie
Achtergrond
- Affiniteitszuivering gecombineerd met massaspectrometrie is cruciaal voor het in kaart brengen van eiwitinteracties.
- De studie richt zich op de bacterie Escherichia coli.
- Eiwitten met een laag kopienummer kunnen moeilijk te isoleren zijn.
- Sequentiële peptide affiniteit (SPA) tags verhogen de zuiveringsefficiëntie.
Doel van de studie
- Om eiwitinteracties en subseenhedensamenstellingen van MultiPro complexen te identificeren.
- Om een methode te ontwikkelen die efficiënt lage abundantie eiwitcomplexen herstelt.
- Om de effectiviteit van dubbel-staps zuiveringstechnieken te demonstreren.
Gebruikte methoden
- Amplificatie van sequentie-specifieke lineaire PCR-producten.
- Integratie van SPA tags en selecteerbare markers in E. coli.
- Gebruik van cow modlin en Anti-Flag affiniteit beads voor zuivering.
- Massaspectrometrie voor eiwitidentificatie na vertering met trypsine.
Belangrijkste resultaten
- Kern RNA polymerase subunits werden efficiënt meegezuiverd met getagged eiwitten.
- Nieuw geassocieerde componenten werden ontdekt met behulp van de SPA methode.
- Zorgvuldige verwerking van cellysaten is cruciaal voor succes.
- Demonstratie van de methode door laboratoriumtechnici Olga Kagan en HBO Guo.
Conclusies
- De SPA APMS procedure is effectief voor het bestuderen van eiwitcomplexen in E. coli.
- Deze methode kan belangrijke interacties en componenten in biologische processen onthullen.
- Het biedt een betrouwbare aanpak voor onderzoekers die met eiwitten met een lage abundantie werken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Protein-protein interaction mapping in bacterial systems enables target validation and mechanistic de-risking for antimicrobial discovery. Sequential peptide affinity purification combined with mass spectrometry provides high-confidence interaction data that supports predictive confidence in pathway analysis. This approach facilitates portfolio triage by revealing novel components in well-studied complexes such as RNA polymerase and iron-sulfur cluster biosynthesis machinery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through systematic identification of stable protein complexes in E. coli.
- Operational Value: Supports biological de-risking by uncovering unexpected components in essential complexes like RNA polymerase.
- Scientific Value: Enhances target confidence by identifying co-purifying factors such as transcription termination anti-determination factors with functional implications.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by generating reproducible interaction networks from chromosomally tagged strains.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG beads.
- Scientific Value: Enables reliable compound evaluation by producing quantitative mass spectrometry readouts with low nanogram detection limits.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease relevance by linking E. coli complex architecture to orthologous gene products in pathogens with limited functional annotations.
- Operational Value: Ensures translational continuity by integrating PPI data with genetic and genomic-context predictions for pathway-level insights.
- Scientific Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions through mechanistic de-risking of novel associations in conserved biological processes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification by providing interaction data that informs mechanistic models and screening readiness.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by identifying stably co-purifying proteins such as SUFB, SUFC, and SUFD in iron-sulfur cluster biosynthesis.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs via mass spectrometry detection of low-abundance complexes after dual-step enrichment.
- Analytics: Enables comparative analysis through co-purification scoring and graph clustering (e.g., Markov clustering) to define high-confidence interactions.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by revealing functional neighborhoods in E. coli that predict mechanistic roles in orthologous systems.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for genome-wide interaction mapping in recommengeering-capable bacterial strains.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in bacterial systems.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of affinity purification workflows across large-scale cultures.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in antimicrobial programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on validated interaction networks.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, bacterial recombineering, and affinity purification techniques.
- Dependent on instrumentation for sonication, centrifugation, and nanoLC-MS/MS systems with Orbitrap detection.
- Necessitates cross-team standardization of tag integration, lysis buffers, and purification conditions for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when extending the SPA-tag system to other bacterial species or pathogenic strains.
- Includes practical limitations such as the need for careful lysate processing to prevent loss of low-abundance complexes during multi-step purification.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:47
Construction of Gene-specific SPA-tagging in E. Coli DY330 Strain
3:54
Culturing and Sonication
5:26
Affinity Purification
7:53
Proteolysis and Sample Preparation for Mass Spectrometry
9:38
Protein Identification by LTQ Orbitap Velos Mass Spectrometer
11:02
Results
14:27
Conclusion
