The Green Monster Werkwijze voor de generatie van giststammen dragen Meerdere gendeleties

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van giststammen met meerdere deleties, gemarkeerd met een reportergen voor groen fluorescent proteïne. Dit wordt bereikt door eerst haploïde enkelvoudige mutanten te prepareren, zogenaamde pro-monsters, waarvan elk een GFP-deletiecassette bevat in plaats van een van de doelgenen. De tweede stap is het sorteren van de deleties via paring en sporulatie van giststammen met behulp van twee sets diploïde en haploïde selectiemarkers, aangeduid als GM toolkit A en GM toolkit alpha, die ook aanwezig zijn in de pro-monsterstammen.

Vervolgens worden sterk fluorescerende cellen uit de meiotische populatie geselecteerd met behulp van flowcytometrie om te verrijken voor stammen met twee deleties. De laatste stap is het bevestigen van de genotypen van de gesorteerde stammen. Uiteindelijk leiden herhaalde ronden van paring en flowcytometrische verrijking, beginnend met de resulterende stammen, tot de generatie van stammen met meerdere deleties.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de G-methode voor hergebruik van markers en sequentiële gen deletie, is dat er per cyclus meerdere deleties kunnen worden verkregen, wat resulteert in een snellere assemblage van multi-mutanten. Na de generatie van pro-monsters, zoals beschreven in het schriftelijke protocol bij deze video, wordt de seksuele cycli gestart door culturen van de gevestigde pro-monster GFP deletiestammen voor te bereiden in een 1,6 ml Eppendorf-buisje. Bereid de deletiestam van paringstype A voor in 100 µL synthetisch compleet medium zonder histamine, aangeduid als minus his medium. Bereid daarnaast de deletiestam van paringstype alpha voor in 100 µL synthetisch compleet medium zonder leucine, of minus lu medium, in een 1,6 ml Eppendorf-buisje voor luchtuitwisseling.

Maak gaatjes in de doppen van de buisjes met een punaise die is behandeld met 70% ethanol. Roteer de buisjes horizontaal bij 30 °C gedurende de nacht. De rotatieas moet parallel lopen aan de lengteas van het buisje.

Schat op basis van de optische dichtheid ongeveer 250.000 a-haploïde cellen en 250.000 alpha-haploïde cellen van GFP-deletiestammen en meng deze in een Eppendorf-buisje van 1,6 milliliter. Dit aantal cellen komt gewoonlijk overeen met zeven µL van elke overnight-cultuur; vortexeer het mengsel. Bereid deze cellen verder voor door ze eerst te centrifugeren bij 800 ×g gedurende twee minuten.

Verwijder het supernatant en maak een gaatje in het dopje met een punaise die is behandeld met 70% ethanol. Voeg voor de luchtuitwisseling 50 µL YPDA-medium toe, gevolgd door een korte vortexbehandeling en centrifugering van uw monster bij 800 G gedurende vijf minuten. Plaats de buis vervolgens in een vochtige box, gemaakt van een lege tipbox, een klein tiprekje en een natte papieren handdoek.

Incubeer de box een nacht bij 30 °C. Breng 10 µL van het paringsmengsel over naar 500 µL GNA-medium zonder agar dat antibiotica G 4 1 8 en nat bevat in een cultuurbuis van 5 mL met een loszittend deksel; de beginnende optische dichtheid bij 600 nm is ongeveer 0,1. Roteer de cultuur gedurende 24 uur bij 30 °C.

Dit maakt de selectie van diploïden mogelijk, omdat alleen diploïden die zowel MX4 uit GM toolkit A als nat MX4 bevatten, kunnen groeien in de aanwezigheid van G418 en Nat. Draag 20 µL van de eendaagse cultuur over naar 500 µL vers GN-medium dat G418 en Nat bevat. De beginnende optische dichtheid bij 600 nm is ongeveer 0,2.

Roteer de buis bij 30 °C gedurende vijf uur om de cellen in de log-fase te brengen. Om s, correleer de diploïden en isoleer sporen. Volg de procedure zoals beschreven in het schriftelijke protocol.

Verdeel de suspensie van SPO-gerelateerde cellen in twee delen van 300 µL en breng elk deel over in een aparte 1,5 mL eppendorfbuis. Centrifugeer de buizen 5 minuten bij 800 G. Verwijder na afloop het supernatant en maak een gaatje in het dopje van elke buis.

Voeg met behulp van een pushpin 100 µL minus his-medium toe aan het pellet van één buis. Om haploïden van het PT-type in de andere buis te selecteren, voegt u 100 µL minus loo-medium toe om alfa-haploïden te selecteren.

Roteer de buisjes gedurende de nacht bij 30 °C. De uiteindelijke optische dichtheid bij 600 nanometer moet lager zijn dan 0,5. Als de optische dichtheid bij 600 nanometer te hoog neigt te zijn, incubeer dan bij kamertemperatuur.

Om GFP te induceren, voegt u 100 µL vers minus hiss- of minus LU-medium toe aan de verschillende stammen, bevattend 20 µg/mL doxycycline. De uiteindelijke concentratie doxycycline is 10 µg/mL. Vortex de buis en roteer deze gedurende twee dagen bij 30 °C.

Om te beginnen met de flowcytometrie, voegt u 900 µL vooraf gefilterde TE-buffer toe aan een polypropylene buis van 5 mL, waarbij de dop is vervangen door een dop met celzeef uit een polystyreen buis van 5 mL. Polypropylene buizen zijn geschikt voor flowcytometrie. De zeefdop is bedoeld voor het verwijderen van grote deeltjes.

Breng voorzichtig 75 µL van de buffer aan op de dop van de celzeef. Voeg 25 µL van de geïnduceerde cellen toe aan de oplossing op de dop, terwijl u de tip van de pipet tegen het gaas drukt. Spuit de gehele gecombineerde oplossing door de zeef.

Druk de dop van de zeef naar beneden en vortex de buis. Bereid de opvangbuisjes voor: 1,6 milliliter fendor-buisjes gevuld met 200 microliters minus hiss- of minus lube-medium. Start de cel sorter en pas de instellingen aan volgens de handleiding van de fabrikant.

Vortex de opvangbuisjes om de wand te coaten met het medium. Vortex ook het buisje met de cellen voordat deze op de cell sorter worden geladen. Verzamel de flowcytometrie-gegevens van het monster.

Een stam zonder GFP kan dienen als negatieve controle. Teken gates voor de sortering om celaggregaten te vermijden, aangezien deze een hoge GFP-intensiteit kunnen vertonen. Verwijder outliers met een onevenredig grote pulsbreedte of oppervlakte voor forward scatter (afgekort FSC) met behulp van een plot van pulsbreedte en pulshoogte, of een plot van FSC-oppervlakte en FSC-hoogte.

Aangezien voor celaggregaten een grote FSC wordt verwacht, worden alleen cellen in de onderste 20% van de FSC meegenomen. Vermijd regio's met de laagste waarden voor FSC en side scatter of SSC, waar vaak celresten worden aangetroffen. SSC en het GFP-signaal zijn vaak positief gecorreleerd.

Om te voorkomen dat de cellen met een hogere SSC-waarde worden verrijkt, trekt u een gate langs de periferie van de populatie met behulp van een plot van GFP-intensiteit en SSC, om in totaal een vergelijkbaar percentage van de helderste cellen van elk punt langs de SSC-as te nemen. 0,1 tot 1% van de subpopulatie die vóór deze stap met FSC- en SSC-gates is geselecteerd, moet worden gemarkeerd voor sortering; sorteer 200 cellen in de opvangbuis. Vortex de opvangbuis om de gesorteerde cellen met medium te bedekken en plaat ze vervolgens uit.

Een subset van cellen op een A-Y-P-D-A plaat voor genotypering. Incubeer de plaat na incubatie gedurende twee dagen bij 30 °C. Maak een lysaat van ongeveer 12 koloniën.

Volg de stappen zoals beschreven in het geschreven protocol voor genotypering. Analyseer één µL van een verdund lysaat met behulp van een 10 µL PCR-reactie met een forward-primer. Deze primer bindt aan de upstream-flankerende regio van elk gedeleteerd gen, gepaard met een gemeenschappelijke primer die bindt binnen alle deletieloci.

De PCR kan worden uitgevoerd in een 96- of 384-wells formaat. Analyseer na amplificatie de PCR-producten met behulp van elektroforese.

Identificeer de haploïden die waarschijnlijk de gewenste genotypen hebben. Zet deze stammen over op een nieuwe plaat. Vries ze daarnaast in in 25% glycerol bij -80 °C.

Aanvullende tests, zoals de bevestiging van de afwezigheid van wild-type sequenties voor verwijderde genen en post-veldgelelektroforese, worden aanbevolen. Herhaal de seksuele cyclus met bruikbare stammen. Haploïde nakomelingen uit een kruising van twee stammen werden gestimuleerd om GFP tot expressie te brengen.

Elke gen-deletie bevatte een GFP-cassette. Met behulp van gates op een flowcytometer werd een populatie van de resulterende cellen geselecteerd. In deze populatie is de aanwezigheid van debris of celaggregaten onwaarschijnlijk. De helderste 1% van de cellen werd gesorteerd en behouden door de cellen te gaten op basis van forward scatter area en forward scatter height.

Celaggregaten, die de neiging hebben een buitenproportioneel groot forward scatter-oppervlak te hebben, werden uitgesloten door cellen te gaten op basis van forward scatter en side scatter; cellen in de onderste 20% van de forward scatter werden geaccepteerd, terwijl debris met de laagste forward scatter en side scatter werd uitgesloten door de cellen te gaten op basis van side scatter en GFP-signaal. De meest fluorescerende cellen binnen een bepaald side scatter-bereik werden geselecteerd om vergelijking mogelijk te maken tussen de myotische mix en de negatieve controlemonster dat geen GFP tot expressie brengt. Een GA, identiek aan degene die werd gebruikt voor het selecteren van de P drie-populatie, wordt in het diagram getoond. Voor de op vergelijkbare wijze geselecteerde cellen van de negatieve controle in een aparte haplo werden analyses uitgevoerd met PCR nadat ze waren geïnduceerd om GFP tot expressie te brengen en waren gesorteerd op basis van fluorescentie. Het verwachte aantal deleties voor een ongesorteerde cel als gevolg van willekeurige segregatie was 7,5.

In dit specifieke experiment hadden de gesorteerde cellen een gemiddeld aantal deleties van 8,8 plus of min 0,3, waaronder vijf cellen met 10 deleties. DO-genotype. De PCL van de gesorteerde stammen werd uitgevoerd met gebruik van een reverse primer.

Die bindt aan de stroomafwaartse flankerende regio in combinatie met een forward primer. Die bindt aan het uiteinde van de cassette. De aanwezigheid van een band duidt op de aanwezigheid van de GFP-cassette.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u de green Monster Method gebruikt om deleties in gist te induceren.