Name: The Green Monster Werkwijze voor de generatie van giststammen dragen Meerdere gendeleties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-15T15:03:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: Leer de Green Monster-methode voor het genereren van giststammen met meerdere gendeleties gemarkeerd met GFP. Deze techniek gebruikt seksuele assortiment en fluorescentie-gebaseerde flowcytometrie om efficiënt multi-mutanten te creëren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de US Defense Advanced Research Projects Agency contract N66001-12-C-4039 aan YS, een subsidie ​​van de Alfred P. Sloan Foundation om RSL, en de Amerikaanse National Institutes of Health subsidies R01 HG003224 en R21 CA130266 te FPRFPR was ook ondersteund door een beurs van de Canadese Institute for Advanced Research en door de Canada Excellence Research Chairs programma.

1. Generatie ProMonsters <ol><li> Bereid de universele GFP vervanging cassette door het amplificeren van een tetO 2-GFP marker en de URA3 marker uit het plasmide pYOGM012 (ampicillineresistentie) met behulp van primers met sequenties: GGATCCCCGGGTTAATTAAGGCGCGCCAGATCTGTTTAGCTTGCC CAAGCTCCTCGAGTAATTCG en GGCGTTAGTATCGAATCGACAGCAGTATAGCGACCAGCATTCAC GTACCGGGTAATAACTGATATAAT (vetgedrukt regio bieden homologie met de flankerende gebieden van de cassette zodat KanMX4 gerichte vervangen). De PCR-reactie worden uitgevoerd met Phusion polymerase, HF buffer en 3% dimethylsulfoxide (New England BioLabs) vanaf het matrijs-DNA concentratie van 0,5 ng / pl. Het PCR programma 98 ° C gedurende 30 sec en 35 cycli van 98 ° C gedurende 10 sec, 49 ° C gedurende 30 sec en 72 ° C gedurende 1,5 minuten. Het reactievolume moet&gt; 50 pi zijn om voldoende DNA voorzien elke transformatie experiment. We zuiverenhet product met een QIAquick PCR purification kit (Qiagen) met ~ 50 pi van de PCR reactie verwerkt per kolom, maar slaan de zuiveringsstap kan de opbrengst van transformanten. Alternatief laat een fragment dat de tetO 2-GFP en URA3 markers, evenals homologe gebieden voor KanMX4 targeting door digestie van het plasmide pYOGM057 (ampicillineresistentie) met het restrictie-enzym EcoRI (New England Biolabs). De DNA-concentratie in deze reactie moet ~ 30 ng / ul. Het reactievolume moet&gt; 34 pi zijn. Voor integratie van de GFP cassette in een ander gebied dan KanMX4 Pas de homologiegebied van de PCR primers boven de juiste homologe sequenties. </li><li> Transformeer een a-haploïde stam van de KanMX4 gist knock-out collectie 12 met de universele GFP verwijdering cassette. Naar aanleiding van het protocol door de Woods en Gietz 13 0,34 pl van deDNA (gezuiverd PCR product of niet-gezuiverde restrictie digest) worden gebruikt voor elk transformatie experiment. Plaat een vijfde van de transformatie mengsel op een CAA-Ura plate (0,67% giststikstofbase, 2% glucose, 0,6% casaminozuur, 0,0025% adenine hemisulfaat, 0,005% tryptofaan, en 2% agar). </li><li> Streak uit de transformanten op een frisse CAA-Ura plaat om geïsoleerde kolonies te verkrijgen. </li><li> Breng cellen van een kolonie op een YPDA plaat met 200 ug / ml G418 het ontbreken van groei bevestigen. Om succesvol te GFP-integratie te bevestigen, volgt u de stappen (1,5) - (1,9) naar kolonie PCR uit te voeren. </li><li> Toevoegen cellen van een kolonie in 2 ui lysis buffer (0,1 M natriumfosfaat, pH 7,4, 1 eenheid zymolyase van ZymoResearch) in een 0,2 ml PCR-buis of een putje van een 96-well plaat. Mix door pipetteren de oplossing in en uit een pipetpunt. </li><li> Overlay met een druppel (ongeveer 20 ul) van minerale olie met behulp van een P200 Pipetman (Gilson). </li><li> Incubeer het mengsel bij 37 °C gedurende 20 minuten en vervolgens bij 95 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Verdun het lysaat met 50 ul water. Meng door pipetteren de oplossing en tien keer. </li><li> Analyseer 1 pi van het lysaat met 10 pi PCR reacties met (A) een voorwaartse primer die bindt met de stroomopwaartse flankerende gebied gekoppeld aan een primer van sequentie CCTGAGAAAGCAACCTGACC (285 bp vanaf het begin van de cassette), (B) een omgekeerde primer die bindt met de downstream regio gekoppeld aan een primer van sequentie GCATTGGGTCAACAGTATAG (375 bp vanaf het einde), (C) twee primers die hybridiseren aan KanMX4 met de sequenties CGTACTCCTGATGATGCATG en GACGAAATACGCGATCGCTG (181 bp) en (D) twee primers die hybridiseren aan de wild-type sequentie van het gerichte gen (figuur 4). (D) is belangrijk omdat ongeveer 8% van de stammen in de deletie collecties bekend aneuploïdie 14 bevatten. Een correcte transformant positief zijn met (A) en (B), en negatief met (C) en (D). </li><li> Om een ​​te introducerenGMToolkit in de transformant, voeg ongeveer 250.000 cellen uit de getransformeerde stam en 250.000 cellen ofwel RY0146 (met GMToolkit-a) of RY0148 (met GMToolkit-α) in een 1,6 ml Eppendorf-buis. Vortex. De genotypen van RY0146 en RY0148 zijn MATα lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 can1Δ :: GMToolkit-a [CMVpr-rtTA KanMX4 STE2pr-Sp-his5] en MATα lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 can1Δ :: GMToolkit-α [CMVpr-rtTA NatMX4 STE3pr- LEU2] respectievelijk. pr geeft promotor. Celaantal worden bepaald optische dichtheid van de voorgaande cultuur. </li><li> Centrifugeer bij 800 xg gedurende 2 minuten. </li><li> Verwijder het supernatant. </li><li> Om rekening te houden luchtverversing, maak een gat in het deksel met behulp van een punaise behandeld met 70% ethanol. </li><li> Voeg 50 ul YPDA medium (1% gistextract, 2% pepton, 2% glucose en 0,003% adenine hemisulfate). Vortex. </li><li> Centrifugeer bij 800 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Plaats de buis in een vochtige doos. Dit kan worden gemaakt met een lege tip box, een kleine fooi standaard, en een natte papieren handdoek. </li><li> &#39;S nachts incubeer het vat bij 30 ° C. </li><li> Selecteer gedekt diploïden door eerst strepen uit de cellen op een CAA-Ura plaat. Incubeer de plaat bij 30 ° C gedurende een dag. </li><li> Waarbij cellen van de bulk gebied streak ze om geïsoleerde kolonies op YPDA-platen (1% gistextract, 2% pepton, 2% glucose, 0,003% adenine hemisulfaat en 2% agar) bevattende 200 ug / ml G418 voor de selectie maken diploïde met GMToolkit-a of 100 ug / ml nourseothricin (Nat) 15 voor het selecteren diploïden met GMToolkit-α. </li><li> Incubeer de plaat bij 30 ° C gedurende 3 dagen. </li><li> Uitgaande van een geïsoleerde kolonie overdragen meeste cellen tot 500 pi GNA medium zonder agar (1% gistextract, 3% Difco kweekbouillon, en 5% glucose, glucose autoclaaf en de rest van thij componenten afzonderlijk als 2 × oplossingen karamelisatie vermijden) in een 5 ml kweekbuis met het deksel los. </li><li> Horizontaal draaien de buis gedurende vijf uur bij 30 ° C. De as van de rotatie moet parallel aan de lengteas van de buis. </li><li> Bevestig dat de volken die gebruikt in (1.21) zijn Ura + door uitstrijken ze uit op een CAA-Ura plaat. </li><li> Centrifugeer het buisje bij 800 xg gedurende 2 minuten. Verwijder het supernatant. </li><li> Voeg 500 ul minimaal sporulatie medium (1% kaliumacetaat, 0,005% zinkacetaat, filter-gesteriliseerd). Vortex. </li><li> Centrifugeer het buisje bij 800 xg gedurende 2 minuten. Verwijder het supernatant. </li><li> Repeat (1,25) - (1.26) twee keer. </li><li> Voeg 1 ml van minimaal sporulatie medium aangevuld met 7,5 ug / ml lysine, 7,5 ug / ml leucine, 5 ug / ml histidine, 5 ug / ml methionine en 1,25 ug / ml uracil (de sporulatie snelheid van de auxotrofe stammen verbeteren) . Vortex. </li><li> Draai de buis bij kamertemperatuur gedurende een dag. </li><li> Draai de buis bij 30 ° C gedurende 2 dagen. </li><li> Centrifuge 125 ul van dit mengsel in een 1,6 ml Eppendorf buisje bij 800 xg gedurende 2 minuten. Verwijder het supernatant. </li><li> Voeg 50 ul zymolyase-oplossing (100 mM natriumfosfaat buffer, pH 7,4, 1 M sorbitol en 2 eenheden zymolyase van ZymoResearch). Mix door pipetteren de oplossing in en uit een pipetpunt. </li><li> Incubeer bij 30 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Voeg 50 ul van 0,02% NP-40. Mix door pipetteren de oplossing in en uit een pipetpunt. </li><li> Laat de buis bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. </li><li> Voeg 500 pl water. </li><li> Plaats de buis op ijs. </li><li> Twee keer Sonificeer dit mengsel aan de uitgang instelling van 1 (zwakste instelling) gedurende 15 sec met behulp van een 3,2-mm microtip met Sonifier 450 (Branson). Tussen de beide van sonificatie, plaats de buis op ijs om de temperatuur weer ~ 0 ° C. </li><li> Centrifugeer de buisjes bij 800 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant. </li><li> Voeg 200 pl SC-Ura-His(A) of SC-Ura-Leu (α) medium, naargelang het kruis is voor het opnemen GMToolkit-a of GMToolkit-α. De media bereiden, maak SC-Ura-His-Leu medium (0,67% giststikstofbase, 2% glucose, 0,01% arginine, asparaginezuur 0,01%, 0,01% glutaminezuur, 0,01% isoleucine, 0,01% lysine, methionine 0,01% , 0,01% fenylalanine, serine 0,08%, 0,04% threonine, tyrosine 0,002%, 0,03% valine, 0,0025% adenine, 0,005% tryptofaan, 0,003% adenine en 0,005% tryptofaan) en met steriele histidine of leucine vullen vóór gebruik de eindconcentratie van 0,01%. </li><li> Maak een gat op het deksel met behulp van een punaise behandeld met 70% ethanol. </li><li> Horizontaal draaien de buis bij 30 ° C gedurende 2 dagen. De as van de rotatie moet parallel aan de lengteas van de buis. </li><li> Streak de cellen op een SC-Ura-His of SC-Ura-Leu agarplaat (dezelfde ingrediënten als hierboven plus 2% agar, threonine en asparaginezuur worden toegevoegd na eenutoclaving, voeg histidine of leucine voor het storten) om geïsoleerde kolonies voor de ProMonster stammen te maken. </li></ol> 2. Seksuele Fietsen <ol><li> Draai een cultuur van een vastgestelde GFP deletiestam in 100 pl SC-His (a) of SC-Leu (α) afhankelijk mating type bij 30 ° C gedurende de nacht met een 1,6 ml Eppendorf buis. Voor de uitwisseling van lucht, maak een gat met behulp van een punaise behandeld met 70% ethanol. Horizontaal Draai de buis. De as van de rotatie moet parallel aan de lengteas van de buis. Het is mogelijk om over meerdere stammen via massaal paring. Wanneer een monster wordt gesorteerd direct voor dit doel cultuur de cellen in 200 ul bij 30 ° C gedurende 2 dagen. Om het medium te bereiden, voeg uracil (eindconcentratie: 0,0025%) en histidine (0,01%) of leucine (0,01%) tot SC-Ura-His-Leu medium. </li><li> Meng 250.000 per-haploïde cellen en 250.000 α-haploïde cellen van GFP deletiestammen in een 1,6-ml Eppendorf buis. Vortex. </li><li> Paren deze cellen door stap (1.11) - (1.17). </li><li> Breng 10 pl van de parende mengsel 500 pl GNA medium dat 200 ug / ml G418 en 100 ug / ml Nat in een 5 ml kweekbuis met een losse deksel. Het uitgangspunt OD 600 is ongeveer 0,1. </li><li> Draai de cultuur bij 30 ° C gedurende 24 uur. Dit maakt de selectie van diploïde omdat slechts diploïden met zowel KanMX4 in GMToolkit-a en NatMX4 in GMToolkit-α kunnen groeien in aanwezigheid van G418 en Nat (figuur 3). </li><li> Breng 20 pl van de eendaagse cultuur 500 pl vers GNA met G418 en Nat. Het uitgangspunt OD 600 is ongeveer 0,2. </li><li> Draai de buis bij 30 ° C gedurende 5 uur om cellen brengen de logfase (OD 600 van ~ 1). </li><li> Volg de stappen (1,24) - (1.38) om de diploïde sporuleren en sporen te isoleren. </li><li> Splitsing van de opschorting van gesporuleerde cellen in twee 300-uldelen en zet elk in een aparte 1,5 ml Eppendorf buis. </li><li> Centrifugeer de buisjes bij 800 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant. </li><li> De pellet van een tube, 100 pl SC-His-medium een haploïden selecteren. De pellet van de andere buis, 100 pl SC-Leu medium tot α-haploiden selecteren. </li><li> Draai de buizen bij 30 ° C geroerd. De uiteindelijke OD 600 lager moeten zijn dan 0,5. Als OD600 neiging te hoog, probeer kweken bij kamertemperatuur. </li><li> Om GFP induceren, 100 pl vers SC-His (a) of SC-Leu (α) medium dat 20 ug / ml doxycycline. De eindconcentratie van doxycycline is 10 ug / ml. Vortex. </li><li> Draai de buizen bij 30 ° C gedurende 2 dagen. </li></ol> 3. Flow Cytometry <ol><li> Voeg 900 ul van voorgefilterde TE buffer (pH 7,5) die 10 ug / ml doxycycline een 5-ml polypropyleen buis (BD Falcon # 352063) met de dop verwisseld met een cel-schroefdop van een 5-ml polystyreen buis (BD Falcon # 352235). Polypropyleenbuisjes geschikt voor flowcytometrie. De schroefdop is gewenst voor het verwijderen van grote deeltjes. </li><li> Plaats voorzichtig 75 ul van TE-buffer met doxycycline op de mobiele zeef cap. </li><li> Voeg 25 ul van de geïnduceerde cellen aan de oplossing van de dop. </li><li> Houd de punt van Pipetman tegen het gaas, schiet alle van de gecombineerde oplossing door de zeef. </li><li> Druk de schroefdop en vortex de tube. </li><li> Bereid verzamelbuizen (1,6 ml Eppendorf buisjes) gevuld met 200 pl SC-His-Leu of SC. </li><li> Start de cel sorteerder en instellingen aan te passen in overeenstemming met de handleiding van de fabrikant. </li><li> Vortex zowel de verzamelbuis (het bekleden van de muur met het medium) en de buis met cellen voordat ze op de celsorteerder. </li><li> Verwerven flowcytometrie data van het monster. Een stam zonder GFP kan een negatieve controle. </li><li> Teken poorten voor het sorteren. (A)Naar cel aggregaten, die een hoge GFP intensiteit kunnen vertonen te vermijden, gooi uitschieters met onevenredig grote pulsbreedte voor voorwaartse verstrooiing (FSC) met behulp van een perceel van pulsbreedte en pulse hoogte voor MoFlo sorteerder of onevenredig klein FSC hoogte met behulp van een perceel van FSC hoogte en FSC gebied FACSAria sorter (Figuur 5, panel linksboven). (B) Aangezien grote FSC (gebied) wordt verwacht celaggregaten, alleen cellen in de onderste 20% in FSC en vermijdt gebieden met de laagste FSC en zijwaartse verstrooiing (SSC) waarden wanneer celresten vaak gevonden (figuur 5, top-rechter paneel). (C) SSC (gebied) en GFP-signaal (gebied) worden vaak positief gecorreleerd. Omdat uitsluitend het helderste cellen gezien de poorten bovenstaande zou verrijken voor cellen met een hoge waarde SSC, opneming van een opening aan de omtrek van de populatie met een plot van GFP intensiteit en SSC een vergelijkbaar percentage van de helderste cellen uit elk punt van de SSC as (figuur 5, bottom-linker diagram). De populatie geselecteerd in (C) 0,1-1% van de bevolking geselecteerd in (B). </li><li> Sorteer 200 cellen in de verzamelbuis gegeven aan de criteria in (3.10). Voor een massaal proces of voor andere projecten die een meer complexe bevolking, sorteren meer cellen als nodig is. </li><li> Vortex de collectie buis naar de gesorteerde cellen met medium te dekken. </li><li> Plaat een subset van cellen (bijvoorbeeld 50 cellen) op YPDA plaat voor genotypering. </li><li> Incubeer de plaat bij 30 ° C gedurende 2 dagen. </li><li> Een lysaat van ~ 12 kolonies na stappen (1,5) - (1,8). </li><li> Breng de resterende cellen van de gebruikte tip in (1,5) naar een plek op een YPDA plaat met G418 en Nat door voorzichtig aanraken van de plaat met de tip. Geselecteerde haploiden mag niet groeien op deze plaat. Diploïden kunnen meer GFP kopieën en kan daarom helderder. Deze test kan aantonen van de efficiëntie van haploïde selectie. </li><li> Voor genotypering, analyseren 1 ul van het lysaat met een 10-pl PCR reaction met een voorwaartse primer die bindt met de stroomopwaartse flankerende gebied van elke verwijderde gen gekoppeld aan een primer van de sequentie CCTGAGAAAGCAACCTGACC. Multiplex PCR reacties indien mogelijk (voorwaarden kan worden bepaald met lysaten van enkele mutanten). PCR kan op een 96 - of 384-wells formaat. De laatste formaat is geschikt voor de reactie volume van slechts 5 ui. Rangschikken van PCR mastermengsels verschillen in primers en toevoeging van cellysaten deze mengsels kunnen worden uitgevoerd met een multi-kanaal pipet of een vloeistofverwerking robot. Tip veranderingen zijn optioneel bij het toevoegen van hetzelfde lysaat aan verschillende PCR mixen. </li><li> PCR-producten te analyseren. De Gel XL Ultra V-2 elektroforese systeem (Labnet) is compatibel met het monster laden met behulp van multi-channel pipetten. </li><li> Gebaseerd op informatie van (3.16) en (3.18), te identificeren waarschijnlijk haploiden die gewenste genotypen. </li><li> Vaststellen van deze stammen op een verse plaat (YPDA, CAA-Ura, of SC-Ura-His/Leu). Ook invriezen in25% glycerol bij -80 ° C. Aanvullende tests zoals een bevestiging van de afwezigheid van wild-type sequenties voor verwijderde genen en pulsed-field gelelektroforese worden aanbevolen. </li><li> Herhaal seksuele fietsen uit (2.1) met handige stammen. </li></ol>

<ol><li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%27s+STKE%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science's STKE. 294, 2364-23 (2001).</li>
<li>Hillenmeyer, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+genomic+portrait+of+yeast%3A+uncovering+a+phenotype+for+all+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320, 362-365 (2008).</li>
<li>Beh, C. T., Cool, L., Phillips, J., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlapping+functions+of+the+yeast+oxysterol-binding+protein+homologues%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Overlapping functions of the yeast oxysterol-binding protein homologues.</a> Genetics. 157, 1117(2001).</li>
<li>Wieczorke, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+knock-out+of+at+least+20+transporter+genes+is+required+to+block+uptake+of+hexoses+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Concurrent knock-out of at least 20 transporter genes is required to block uptake of hexoses in Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS letters. 464, 123-128 (1999).</li>
<li>Alani, E., Cao, L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+gene+disruption+that+allows+repeated+use+of+URA3+selection+in+the+construction+of+multiply+disrupted+yeast+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A method for gene disruption that allows repeated use of URA3 selection in the construction of multiply disrupted yeast strains.</a> Genetics. 116, 541-545 (1987).</li>
<li>Akada, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-mediated+seamless+gene+deletion+and+marker+recycling+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">PCR-mediated seamless gene deletion and marker recycling in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23, 399-405 (2006).</li>
<li>Guldener, U., Heck, S., Fielder, T., Beinhauer, J., Hegemann, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+efficient+gene+disruption+cassette+for+repeated+use+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast.</a> Nucleic acids research. 24, 2519(1996).</li>
<li>Delneri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+redundancy+in+the+yeast+genome%3A+an+improved+strategy+for+use+of+the+cre-loxP+system%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Exploring redundancy in the yeast genome: an improved strategy for use of the cre-loxP system.</a> Gene. 252, 127-135 (2000).</li>
<li>Storici, F., Lewis, L. K., Resnick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+site-directed+mutagenesis+using+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">In vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides.</a> Nat. Biotech. 19, 773-776 (2001).</li>
<li>Noskov, V. N., Segall-Shapiro, T. H., Chuang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+repeat+coupled+with+endonuclease+cleavage+%28TREC%29%3A+a+seamless+modification+tool+for+genome+engineering+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Tandem repeat coupled with endonuclease cleavage (TREC): a seamless modification tool for genome engineering in yeast.</a> Nucl. Acids Res. 38, 2570-2576 (2010).</li>
<li>Suzuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knocking+out+multigene+redundancies+via+cycles+of+sexual+assortment+and+fluorescence+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Knocking out multigene redundancies via cycles of sexual assortment and fluorescence selection.</a> Nat. Methods. 8, 159-164 (2011).</li>
<li>Winzeler, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Characterization+of+the+S.+Genome+by+Gene+Deletion+and+Parallel+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional Characterization of the S. Genome by Gene Deletion and Parallel Analysis.</a> Science. 285, 901-906 (1999).</li>
<li>Woods, R. A., Gietz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transformation+of+plasmid+DNA+into+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transformation of plasmid DNA into yeast.</a> Methods Mol. Biol. 177, 85-97 (2001).</li>
<li>Hughes, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+aneuploidy+revealed+by+DNA+microarray+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Widespread aneuploidy revealed by DNA microarray expression profiling.</a> Nature. 25, 333-337 (2000).</li>
<li>Goldstein, A. L., McCusker, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+new+dominant+drug+resistance+cassettes+for+gene+disruption+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 15, 1541-1553 (1999).</li>
<li>Newman, J. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+proteomic+analysis+of+S.+cerevisiae+reveals+the+architecture+of+biological+noise%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell proteomic analysis of S. cerevisiae reveals the architecture of biological noise.</a> Nature. 441, 840-846 (2006).</li>
<li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulation+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. 307, 1962(2005).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Bij het ontwikkelen van de Green Monster benadering zijn we bezig met de mogelijkheid van recombinatie tussen verschillende GFP vervangen cassettes, waardoor genoom omlegging. Verzachten tegen deze mogelijkheid is onze selectie voor cellen die succes hebben ondergaan meerdere ronden van paring en meiose. Cellen die herschikt genomen naar verwachting minder geschikt na koppeling met een identieke cellen zonder omlegging. Inderdaad, we hebben niet in acht te nemen genoom instabiliteit als gevolg van recombinatie tussen GF...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens of het instrument </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> G418 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A1720 </td><td> Oplossen in water en filter-steriliseren (0,2-um filter). De concentratie: 200 mg / ml. Bewaar bij 4 ° C. </td></tr><tr><td> ClonNAT (nourseothricin) </td><td> WERNER BioAgents </td><td> 5001000 </td><td> Oplossen in water en filter-steriliseren (0,2-um filter). De concentratie: 100 mg / ml. Bewaar bij 4 ° C. </td></tr><tr><td> Doxycycline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9891 </td><td> Oplossen in 50% ethanol en filter-steriliseren (0,2 urn filter). De concentratie: 10 mg / ml. Maak verse elke vier weken. Schild van licht met behulp van aluminiumfolie en bewaar bij 4 ° C. </td></tr><tr><td> Zymolyase </td><td> ZymoResearch </td><td> E1005 </td><td></td></tr><tr><td> Difco giststikstofbase w / o aminozuren </td><td> BD </td><td> 291940 </td><td></td></tr><tr><td> Revolver (rotator voor buizen) </td><td> Labnet </td><td> H5600 </td><td></td></tr><tr><td> Enduro Gel XL elektroforeseapparaat </td><td> Labnet </td><td> E0160 </td><td></td></tr><tr><td> Sonifier 450 </td><td> Branson </td><td> 101-063-198 </td><td></td></tr><tr><td> Microtip voor Sonifier 450 </td><td> Branson </td><td> 101-148-062 </td><td></td></tr><tr><td> FACSAria celsorteerder </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MoFlo celsorteerder </td><td> Beckman Coulter- </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Biomek FX of gelijkwaardig robot </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td> Optioneel. Voor het instellen van genotypering PCR&#39;s. </td></tr></tbody> &lt;/ Table&gt;

the green monster werkwijze voor de generatie van giststammen dragen meerdere gendeleties

The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions

Fenotypes voor gendeletie vaak onthuld wanneer de mutatie getest in een bepaalde genetische achtergrond of omgevingsconditie 1,2. Er zijn voorbeelden waar veel genen moeten worden verwijderd om te ontmaskeren verborgen genfuncties 3,4. Ondanks het potentieel voor belangrijke ontdekkingen, zijn genetische interacties met drie of meer genen grotendeels onontgonnen. Uitputtende zoekopdrachten van multi-mutant interacties zou onpraktisch zijn als gevolg van het grote aantal mogelijke combinaties van verwijderingen. Zou echter studies van geselecteerde sets van genen, zoals sets van paralogen met meer a priori kans van een gemeenschappelijke functie informatief. In de gist Saccharomyces cerevisiae is knockout bewerkstelligd door vervanging van een gen met een selecteerbare merker via homologe recombinatie. Omdat het aantal markers beperkt zijn werkwijzen ontwikkeld voor het verwijderen en opnieuw de sam<html> e marker 5,6,7,8,9,10. Echter achtereenvolgens techniek meerdere mutaties met deze methoden is tijdrovend omdat de tijdschalen lineair vereist met het aantal deleties te genereren. Hier beschrijven we de Green Monster methode voor routinematig engineering van meerdere deleties in gist 11. In deze methode wordt een groen fluorescerend eiwit (GFP) reporter geïntegreerd in deleties gebruikt om kwantitatief label stammen volgens het aantal deleties in elke stam (figuur 1). Herhaalde rondes van het assortiment van GFP-gemerkt deleties via gist mating en meiose gekoppeld met flow-cytometrische verrijking van stammen die meer van deze deleties leiden tot de ophoping van deleties in stammen (figuur 2). Het uitvoeren van meerdere processen in parallel met elk proces waarin een of meer deleties per ronde minder tijd nodig voor stam constructie. inhoud &quot;&gt; De eerste stap is de voorbereiding van haploïde single-mutanten genoemd &#39;ProMonsters,&#39; die elk draagt ​​een GFP reporter in een verwijderde locus en een van de &#39;toolkit&#39; loci-ofwel Green Monster GMToolkit-a of GMToolkit-α in de . can1Δ locus (Figuur 3) Gebruik stammen van de gist deletie collectie 12 kan GFP-gemerkte deleties eenvoudig worden gegenereerd door het vervangen van de gemeenschappelijke KanMX4 cassette bestaande in deze stammen met een universele GFP - URA3 fragment Elke GMToolkit bevat:. hetzij de a - of α-mating-type-specifieke haploïde selectiemerker 1 en precies een van de twee markers die, wanneer beide GMToolkits aanwezig zijn, samen zorgen voor selectie van diploïde. De tweede stap is het uitvoeren van de seksuele fietsen waardoor deletie loci kunnen in een cel worden gecombineerd door de willekeurige sortering en / of meiotische Recombination dat elke cyclus van de paring en sporulatie begeleidt.

Wanneer een a-haploïde stam die vier GFP-gemerkte deleties (ycl033cΔ yer042wΔ ykl069wΔ yol118cΔ) werd gekruist met een α-haploïde stam die vier deleties (ycl033cΔ ydl242wΔ ydl227cΔ yer042wΔ) met twee deleties (ycl033cΔ yer042wΔ) gedeeld door twee stammen, representant resultaat verkregen. De paring mengsel werd gekweekt in YPDA medium dat G418 en Nat te diploïden te selecteren. De resulterende diploïden werden gekweekt in de sporulatie medium. De sporen werden verspreid door z...

De Green Monster methode kan de snelle montage van meerdere deleties gemarkeerd met een reportergen codeert groen fluorescent eiwit. Deze methode is gebaseerd op een giststammen door herhaalde cycli van seksuele assortiment van deleties en fluorescentie gebaseerde verrijking van cellen die meer deleties.

The Green Monster Werkwijze voor de generatie van giststammen dragen Meerdere gendeleties

Fenotypen voor een gendelletie worden vaak pas onthuld wanneer de mutatie wordt getest in een specifieke genetische achtergrond of onder een bepaalde omgevingsconditie1,2. ...

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van giststammen met meerdere deleties, gemarkeerd met een reportergen voor groen fluorescent proteïne. Dit wordt bereikt door eerst haploïde enkelvoudige mutanten te prepareren, zogenaamde pro-monsters, waarvan elk een GFP-deletiecassette bevat in plaats van een van de doelgenen. De tweede stap is het sorteren van de deleties via paring en sporulatie van giststammen met behulp van twee sets diploïde en haploïde selectiemarkers, aangeduid als GM toolkit A en GM toolkit alpha, die ook aanwezig zijn in de pro-monsterstammen.Vervolgens worden sterk fluorescerende cellen uit de meiotische populatie geselecteerd met behulp van flowcytometrie om te verrijken voor stammen met twee deleties. De laatste stap is het bevestigen van de genotypen van de gesorteerde stammen. Uiteindelijk leiden herhaalde ronden van paring en flowcytometrische verrijking, beginnend met de resulterende stammen, tot de generatie van stammen met meerdere deleties.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de G-methode voor hergebruik van markers en sequentiële gen deletie, is dat er per cyclus meerdere deleties kunnen w

the-green-monster-process-for-generation-yeast-strains-carrying

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

GFP-fusie-eiwitten worden op grote schaal gebruikt om de organellen visualiseren door confocale microscopie. Echter, screening voor mutaties die de morfologie van organellen invloed vereist in het algemeen individueel mutagenese en is tijdrovend. Hier tonen we een methode om simultaan te nemen organel-GFP markers in bijna 5.000 niet-essentiële genen in gist.

Een high-throughput methode om wereldwijd de studie van de morfologie organel in S. cerevisiae

Hier voorgesteld is een enkelvoudige beschrijving van technieken die kunnen worden gebruikt voor het ontwikkelen, veranderen, beheren en testen heterologe eiwitexpressie van de probiotische gist Saccharomyces boulardii.

Transformatie van probiotische gist en hun herstel van gastro-intestinale Immune Tissues Na orale sondevoeding in Muizen

We presenteren een gedetailleerd protocol om mutantenbibliotheken te construeren en te screenen voor gerichte evolutiecampagnes in Saccharomyces cerevisiae.

Geregisseerd Evolution Method in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Bibliotheek Creatie en Screening

Wij rapporteren hier methoden over de moleculair-genetische manipulatie van de Yarrowia lipolytica Po1g stam voor verbeterde gendeletie-efficiëntie. De resulterende gemanipuleerde Y. lipolytica stammen hebben potentiële toepassingen in biobrandstof en biochemische productie.

Genetische manipulatie van een onconventionele Gist voor duurzame biobrandstoffen en biochemische Production

We beschrijven een robuuste gen vervangende strategie om de vuiligheid schimmel Ustilago maydis genetisch te manipuleren. Dit protocol wordt uitgelegd hoe u deletiemutanten genereren om infectie fenotypes onderzoeken. Kan worden uitgebreid tot genen in elke gewenste wijze, bijvoorbeeld wijzigen door toevoeging van een sequentie die codeert voor een fluorescerend eiwit tag.

Genetische Manipulatie van de Plant Pathogeen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Om Fungal Biology and Plant Microbe Interactions Studie

Gen deletie mutanten gegenereerd door homologe recombinatie zijn de gouden standaard voor genfunctie studies. De OSCAR (One Step Construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids) methode voor snelle generatie van deletieconstructen wordt beschreven. Agrobacterium gemedieerde schimmel transformatie volgt. Tenslotte wordt een PCR-gebaseerde bevestigingsmethode van gendeleties in zwamtransformanten gepresenteerd.

Snelle verwijdering Productie in Fungi via<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Gemedieerde Transformatie van OSCAR Deletion Constructs

Een strategie voor het genereren van mutaties in histongenen op hun endogene locatie in Saccharomyces cerevisiae wordt gepresenteerd.

gerichte<em&gt; In Situ</em&gt; Mutagenese van histon genen in gist

Dit artikel beschrijft een gedetailleerde methodologie voor willekeurige mutagenese van een target-gen in kernsplijting gist. Als voorbeeld, wij de doelstelling van rpt4 +, die codeert een subeenheid van de 19S proteasoom, en het scherm voor mutaties die heterochromatin te destabiliseren.

Gen-gerichte willekeurige mutagenese Heterochromatin-destabiliserende proteasoom mutanten in Fission gist selecteren

Het CRISPR/Cas12a systeem in combinatie met een enkele crRNA array maakt efficiënte multiplex bewerking van de S. cerevisiae genoom op meerdere loci tegelijk mogelijk. Dit wordt aangetoond door het construeren van Carotenoïde producerende giststammen die vervolgens worden gebruikt om gist pixel kunst te maken.

CRISPR/Cas12a multiplex genoom bewerking van Saccharomyces cerevisiae en de creatie van gist pixel art

Het doel van dit protocol is om een gedetailleerde, stapsgewijze handleiding te bieden voor het assembleren van multi-gen constructies met behulp van het modulaire kloonsysteem op basis van Golden Gate klonen. Het geeft ook aanbevelingen over kritieke stappen om een optimale montage te garanderen op basis van onze ervaringen.

Snelle assemblage van multigenconstructies met behulp van modulair klonen van golden gate

Leer de Green Monster-methode voor het genereren van giststammen met meerdere gendeleties gemarkeerd met GFP. Deze techniek gebruikt seksuele assortiment en fluorescentie-gebaseerde flowcytometrie om efficiënt multi-mutanten te creëren.

The Green Monster Werkwijze voor de generatie van giststammen dragen Meerdere gendeleties

Meer video's verkennen