Functionele Evaluatie van darmmotiliteit en de darmwand ontsteking in Knaagdieren: Analyses in een gestandaardiseerd model van Intestinal Manipulatie

Het algemene doel van de volgende experimenten is om een intestinale manipulatie uit te voeren om de ontwikkeling en het opheffen van de postoperatieve ileus in een knaagdiermodel te bestuderen; dit wordt bereikt door gestandaardiseerde manipulatie van de dunne darm tussen twee vochtige wattenstaafjes. Vervolgens worden de gastro-intestinale en colone transit geanalyseerd om de postoperatieve motiliteit te meten. Daarna worden histochemische analyse en organcultuur van de muscularis externa van de dunne darm uitgevoerd om de ontstekingswaarden te onderzoeken.

Er zijn resultaten verkregen die een sterke infiltratie van neutrofiele granulocyten in het slijmvlies en een overmatige productie van stikstofmonoxide in slijmvliesculturen laten zien, wat resulteert in vertragingen van de gastro-intestinale en colontransittijden. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over het ontstaan en de oplossing van postoperatieve ileus, en bij het onderzoeken van potentiële profylaxe of therapie. De procedure zal worden gedemonstreerd door Mario Lewison, een technicus uit ons laboratorium. Dien 0,8 tot 1% isofluraan in zuurstof toe aan een mannelijke muis. Plaats het dier in rugligging en gebruik plakband om de extremiteiten te fixeren.

Gebruik een lichte pijnstimulus om de diepe sedatie te testen. Voer vervolgens een mediaan laparotomie uit van twee centimeter lengte. Plaats daarna twee steriele retractoren om het abdomen open te houden, eventueer zorgvuldig de dunne darm naar links en plaats deze op nat watgaas.

Evacueer de luminale inhoud van de gehele dunne darm met twee vochtige wattenstaafjes door de applicators gelijktijdig van het pori naar het caecum te rollen. Plaats de darm terug in de peritoneale holte zonder deze te draaien om ischemie of mechanische obstructie te voorkomen, en gebruik hiervoor twee lagen continue 5.0 polyamide niet-resorbeerbare hechtingen. Sluit de abdominale incisie.

Plaats het dier onder een warmtelamp en houd het in de gaten tot het volledig bij bewustzijn is na de anesthesie. Plaats de muis vervolgens terug in de kooi en zorg dat deze toegang heeft tot voedsel en water. De volgende dag.

Nadat de muis volledig is geanestheseerd, wordt de kop voorzichtig hyperextendeerd en worden stompe pincetten gebruikt om de tong naar buiten te trekken. Vul een spuit van één milliliter met ten minste 100 µL fluoresceïne-gelabelde dextran. Verbind de spuit met een arteriële katheter en voer de katheter voorzichtig als maagsonde in de maag in. Injecteer snel 100 µL FITC-dextran en verwijder vervolgens de katheter.

Laat het dier weer bij bewustzijn komen en wacht 90 minuten. Euthanaseer na deze 90 minuten de muis en verwijder het volledige maag-darmkanaal, van de maag tot het rectum. Plaats de darm op een polystyreenmatje en vermijd uitrekking.

Meet vervolgens de totale lengte van de dunne darm en de dikke darm. Gebruik canules om de darm aan het polystyreenkussen te fixeren. Verdeel de dunne darm in 10 gelijke segmenten en de dikke darm in drie gelijke segmenten.

Nadat de darm op de aangegeven posities is doorgesneden, worden de secties één keer gespoeld met 1 mL Krebs-Heringel-bicarbonaatbuffer (KHB). Breng de secties over naar opeenvolgend gelabelde buisjes van 2 mL en vortex deze krachtig, waarna de monsters worden gecentrifugeerd. Breng vervolgens het supernatant over naar schone, genummerde buisjes van 1,5 mL.

Bewaar bij vier graden Celsius in het donker tot aan de analyse. Pipetteer vervolgens. Maak twee aliquots van honderd microliter van elk supernatant in een zwarte 96-wells plaat en gebruik een fluorescentielezer om de plaat uit te lezen om de colonzondertijd te controleren na de wekelijkse anesthesie van het dier.

Controleer zorgvuldig de doorgankelijkheid van het colon door een fistel in te brengen. Gebruik de sonde om via de anus het colon in te gaan. Plaats een glazen bolletje van twee millimeter drie centimeter diep in het colon en verwijder vervolgens de sonde.

Start onmiddellijk een timer. Plaats de muis in een transparante kooi en monitor de tijd die nodig is voordat de pellet wordt uitgescheiden. Voor histochemische analyse van middelste fecale monsters.

Nadat weefselsegmenten uit de darm zijn gesneden en zijn ondergedompeld in koud KHB in een met silicone gevulde schaal, worden insectenpinnen gebruikt om het mesenterium aan de schaal te bevestigen. Snijd de segmenten open langs de mesenteriale rand en rek het weefsel uit tot 120% van de oorspronkelijke lengte en breedte. Bevestig het weefsel met naalden, beginnend bij het mesenterium. Mechanisch.

Scheid de muscularis externa of me van de tunica mucosa. Fixeer en kleur de monsters volgens het geschreven gedeelte van dit protocol voor kweek. De me.

24 uur na de procedure voor intestinale manipulatie wordt de gehele dunne darm gereseceerd en geplaatst in koud KHB met penicilline G en streptomycine. Snijd de darm in stukken van drie centimeter en zet elk segment vast op een met silicone gecoate glazen schaal met een fijne schaar. Verwijder het mesenterium en schuif de darm met een scherp pincet op een nodding-naald.

Hanteer het membraan voorzichtig met een vochtige wattenstaaf. Scheid het van de submucosa en plaats het in koud KHB plus PS. Snijd vervolgens de stroken van het membraan in stukjes van twee tot vier millimeter lang en incubeer deze gedurende 30 minuten in ijskoud KHB plus PS. Spoel het preparaat meerdere keren.

Breng vervolgens ongeveer 50 tot 60 mg over naar een steriele 24-wells plaat die 500 µL DMEM bevat. Incubeer het weefsel gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% CO2. Verzamel het supernatant en centrifugeer dit gedurende vijf minuten bij 1000 RCF.

Bevries het vervolgens direct in vloeibare stikstof voor cytokine- of stikstofoxidemetingen. Droog tot slot het spierweefsel 30 seconden lang af met een schoon papieren tissues en weeg het vervolgens. De belangrijkste parameter voor het evalueren van de ernst van de postoperatieve ileus is het onderzoek naar de gastro-intestinale transit of GIT in vivo.

Deze figuur demonstreert een typische distributie van FITC-dextran langs het maag-darmstelsel in onbehandelde controles en intestinaal gemanipuleerde muizen 24 uur na de operatie. Zoals hier getoond, vertoonden sham-geopereerde dieren een normaal maag-darmstelsel met een berekend geometrisch centrum in het caecum. Hoewel Im leidde tot een significante vertraging in het maag-darmstelsel in het proximale jejunum, scheidden sham-geopereerde muizen bij de colontransportanalyse met een glazen bolletje de bol uit binnen 48 tot 200 seconden, terwijl Im de uitscheidingstijd verlengde tot 470 tot 775 seconden om ontsteking te meten.

Binnen de ME werden de leukocytenniveaus geanalyseerd met behulp van histochemie of immunohistochemie, zoals hier te zien is. In controlemuizen werden weinig polymorfnucleaire neutrofielen waargenomen, maar I van de dunne darm leidde tot een sterke infiltratie daarvan. Veel ontstekingsmediatoren die door cellen worden vrijgegeven, zijn moeilijk in weefsel aan te tonen.

Lysaten van organcultures maken de detectie van ontstekingsmarkers in de cultuur mogelijk. In het supernatant is stikstofmonoxide, of NO, een representatieve mediator bij POI; dit is een belangrijke inhiberende neurotransmitter in het gastro-intestinale kanaal. Deze figuur laat zien dat NO niet kon worden gedetecteerd in me.

In organoculturen en supernatanten van controle-dieren in schijngeopereerde muizen werden basale nno-niveaus waargenomen. Echter, culturen van intestinaal gemanipuleerde muizen produceerden na een incubatie van 24 uur significant meer nno. Zodra men deze techniek beheerst, kan de intestinale manipulatie binnen 15 minuten worden uitgevoerd indien deze correct wordt verricht.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u postoperatieve ileus bij muizen induceert en hoe u de ernst hiervan analyseert.