Detectie van microRNA's in Microglia door Real-time PCR in Normal CNS en tijdens ontstekingsprocessen

Het algemene doel van deze procedure is het analyseren van de expressie van micro-RNA in microglia. Dit wordt bereikt door eerst de hersenen en het ruggenmerg te dissekeren en vervolgens het weefsel van het centraal zenuwstelsel of CZS te homogeniseren. In de tweede stap worden mononucleaire cellen uit het CZS geïsoleerd via een Percoll-gradiënt, waarna de microgliapopulatie wordt geïdentificeerd middels FACS.

Vervolgens wordt het microgliale RNA geïsoleerd en wordt de kwaliteit van de monster geanalyseerd. Ten slotte wordt real-time PCR uitgevoerd voor het specifieke micro RNA van belang. Uiteindelijk kan de delta delta CT-methode worden gebruikt om het relatieve expressieniveau van een specifiek micro RNA in microglia aan te tonen.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben omdat ze er niet in slagen een voldoende aantal mononucleaire cellen uit het CZS te isoleren of omdat het monster is verontreinigd met myeline en celresten. Beide gevallen resulteren in een preparatie van lage kwaliteit, respectievelijk door een lage RNA-concentratie of door eiwitverontreiniging. De procedure zal worden gedemonstreerd door mij en vir.

Dr.O fellow van na perfusie van alle muizen de hersenen en het ruggenmerg dissekeren. Plaats vervolgens telkens één brein en één ruggenmerg in een homogenisator van 15 milliliter en voeg telkens vijf milliliter PBS toe aan de weefsels. Voer 10 tot 20 zachte slagen uit en filter het homogenaat door cellstrainers van 70 micron in individuele conische buizen van 50 milliliter en centrifugeer de buizen gedurende vijf tot zeven minuten bij 834 ×g en vier °C.

Nadat het supernatant is weggegooid, wordt het homogenaat van de hersenen en het ruggenmerg van twee tot drie muizen resuspenderd in vijf tot zeven milliliter 70% percoll. Voeg vervolgens zeven milliliter 40% percoll toe als bovenlaag en centrifugeer de percoll- en celoplossing gedurende 30 minuten bij 850 ×g bij 20 °C zonder remming. Verwijder de beschadigde cellen, myeline en debris aan de bovenzijde van de 70% percoll.

Verzamel vervolgens de mononucleaire cellen op de interface tussen de 70% en 40% percoll-oplossingen en verdun de verzamelde cellen in PBS, in minimaal een verhouding van één-op-één. Na het centrifugeren van de cellen wordt het pellet resuspendeerd in een halve milliliter PBS en overgebracht naar een 1,7 milliliter eppendorf-buisje. Begin met het overbrengen van 50 microliter van de via dichtheidsgradiënt gesorteerde cellen naar een nieuw 1,7 milliliter eppendorf-buisje en voeg 350 microliter FACS-buffer aan het buisje toe.

Voeg vervolgens vijf tot 10 µL anti-FCR-antilichamen toe aan de buis en incubeer de cellen 10 tot 15 minuten op ijs. Verdeel het cellmonster over twee eppendorfbuisjes; voeg aan één buis één µL anti-CD11b- en twee µL anti-CD45-antilichamen toe.

Incubeer de cellen nog 10 tot 15 minuten op ijs. Label de tweede buis als negatieve controle en plaats deze op ijs. Voeg na incubatie met de kleuringsantilichamen één milliliter fax-buffer toe aan beide buizen en centrifugeer de cellen in een microcentrifuge gedurende vijf minuten bij 1200 ×g.

G. Fix vervolgens de pellets in 400 µL 1% paraformaldehyde in PBS en vortex de buisjes om klonteren te voorkomen. Analyseer tot slot de cellen via flowcytometrie met behulp van de negatieve controlecelmonsters en BD com beads. Begin met het subcutaan immuniseren van een groep van vijf tot 10, acht tot 12 weken oude C 57 black six muizen met 150 mg MOG 35-55 peptide in 4 mg/mL complete frons-adjuvans om EAE te induceren. Dien vervolgens op dag nul en op dag twee na immunisatie pertussistoxine intraperitoneaal toe.

Nadat de cellen zijn geïsoleerd en gekleurd zoals zojuist getoond, worden de pellets vlak voor het sorteren gesuspendeerd in 400 µL PBS in plaats van fixatief. Vul vervolgens twee 1,7 mL eppendorfbuisjes met 300 µL PBS aangevuld met 10% FBS voor het opvangen van de monsters. Sorteer tenslotte de microglia- en macrofaagpopulaties tot een hoge zuiverheid met behulp van de gating-strategie die wordt geïllustreerd in deze representatieve density plot.

Analyseer na het sorteren de microglia- en macrofaagpopulaties opnieuw om de zuiverheid van de geïsoleerde celmonsters te bepalen. Centrifugeer de gesorteerde celpopulaties 5 tot 7 minuten bij 1200 ×g in een microcentrifuge, verwijder voorzichtig het supernatant en vries de celpellets in op droogijs. Breng de bevroren celpellets vervolgens over naar gewoon ijs.

Voeg voor het ontdooien 300 µL lysislysisbuffer uit een Nirvana-kit toe en meng de celoplossing vervolgens voorzichtig door vijf tot zeven keer te pipetteren. Voeg daarna 30 µL van het homogenisatie-additief toe, vortex de celsuspensie gedurende 30 seconden en plaats de buizen vervolgens 10 minuten op ijs. Voeg nu 300 µL zuur fenol-chloroform toe en vortex de buis nogmaals 30 seconden.

Centrifuge de cellen vervolgens vijf minuten bij 9.500 ×g en breng daarna voorzichtig de bovenste 300 µL van het supernatant, dat de waterige fase bevat, over naar een nieuwe Eppendorf-buis van 1,7 mL. Meng de oplossing met 375 µL 100% ethanol. Breng de volledige inhoud van de buis over naar een filtercartridge uit de Nirvana-kit en centrifugeer de cartridge één minuut bij 9.500 ×g. Verwijder vervolgens de doorstroombuffer.

Voeg 700 µL wassoplossing één uit de Nirvana-kit toe en centrifugeer nog een minuut bij 9.500 ×g na het wassen van de cartridge. Herhaal dit nog twee keer met 500 µL wassoplossing twee uit de Nirvana-kit. Elueer het RNA uit de cartridge met 60 µL voorverwarmd nucleasevrij water.

Gebruik ten slotte een NanoDrop-spectrofotometer om de zuiverheid en kwantiteit van het RNA te beoordelen na het uitvoeren van realtime Q-R-T-P-C-R om micro RNA in de microglia- en macrofaagmonsters te detecteren. P-R-T-P-C-R-curves voor fluorescentiegelabelde mere 1 24 en snow RNA 55 PCR-producten kunnen worden gemaakt zoals hier in de eerste grafiek wordt getoond. Typische curves voor de hoeveelheid fluorescentiegelabelde specifieke PCR-producten voor controle snow RNA 55 RNA-monsters geïsoleerd uit microglia of uit beenmerg afgeleide macrofagen in verhouding tot het aantal PCR-cycli worden weergegeven.

Let op hoe de CT-waarden voor de analyse van de snow RNA 55-expressie van de verschillende celpopulaties worden bepaald op het snijpunt van de basislijn met het onderste deel van het lineaire bereik van de Q-R-T-P-C-R-curves, zoals in de grafiek wordt aangegeven door de groene en blauwe verticale lijnen. In deze tweede grafiek wordt de hoeveelheid fluorescentielabel-specifieke PCR-producten voor de experimentele mere 1 24 RNA-monsters van microglia of uit beenmerg afgeleide macrofagen weergegeven ten opzichte van het aantal PCR-cycli. Let op hoe de CT-waarden voor de analyse van de mere 1 24-expressie van de verschillende celpopulaties opnieuw worden bepaald op het snijpunt van de basislijn met het onderste deel van het lineaire bereik van de Q-R-T-P-C-R-curves, zoals in de grafiek wordt aangegeven door de groene en blauwe verticale lijnen.

Nadat de CT-waarden voor elk van de monsters zijn bepaald, zoals voor de expressie van snow RNA 55 en mere 1 24 in microglia en BM dms van normale en EAE-muizen in deze tabel, trekt u de CT-waarde van het controlemonster snow RNA 55 af van de CT-waarde van het experimentele mere 1 24-monster om de delta CT-waarden voor elk duplicaat van elk monster te berekenen. Trek vervolgens de delta CT van het referentiemonster af van de delta CT-waarden van de overige monsters om de delta delta CT-waarden te berekenen. Ten slotte wordt het relatieve expressieniveau voor elk monster berekend als twee tot de macht minus delta delta CT, zoals te zien is in deze density plot.

In het geval van een goede isolatie van microglia uit een normaal CZS zal 95 tot 98% van de cellen bestaan uit CD 11 B positieve CD 45 lage microglia, waarbij twee tot 5% van de cellsuspensie bestaat uit CD 11 B positieve CD 45 hoge perivasculaire macrofagen en minder dan 1% uit CD 11 B negatieve CD 45 hoge lymfocyten of CD 11 B negatieve CD 45 negatieve astroglia of oligodendrogliale cellen of celfragmenten. In een kwalitatief slechte preparatie is er sprake van een significante contaminatie met CD 11 B negatieve CD 45 negatieve cellen of celfragmenten, zoals astroglia of myelinepartikels, waardoor de cellen ongeschikt zijn voor RNA-isolatie en verdere analyse. Daarnaast kunnen CD 11 B negatieve CD 45 hoge cellen aanwezig zijn, wat duidt op contaminatie door bloedlymfocyten als gevolg van onvoldoende perfusie. In dit densiteitsplot worden de drie populaties cellen die aanwezig zijn in het CZS tijdens neuroinflammatie weergegeven: CD 11 B positieve CD 45 lage microglia, CD 11 B positieve CD 45 hoge macrofagen en CD 11 B negatieve CD 45 hoge lymfocyten.

De kwaliteit van RNA, bepaald via gelelektroforese na een goede versus een slechte isolatie, wordt getoond. Wanneer het RNA op een schone wijze wordt geïsoleerd, zijn een RNA-ladder en ribosomaal RNA duidelijk zichtbaar; wanneer het isolatieproces gebrekkig is uitgevoerd, zijn vegen en degradatieproducten met een laag molecuulgewicht zichtbaar. Deze uiteindelijke gegevens tonen de expressie van mere 1 24 aan in normale volwassen microglia, microglia van muizen met EAE en microglia geïsoleerd uit muizen tijdens vroege stadia van de ontwikkeling.

In deze eerste staafgrafiek is de relatieve expressie van mere 1 24 veel groter in microglia uit een normaal CZS in vergelijking met die waargenomen bij macrofagen afgeleid van het beenmerg. Hoewel er een toename is van mere 1 24 RNA in macrofagen uit het CZS van muizen met EAE, brengen microglia nog steeds vijf keer zoveel mere 1 24 RNA tot expressie. Deze laatste staafgrafiek laat zien hoe veranderingen in het expressieniveau van mere 1 24 in microglia tijdens de ontwikkeling van muizen van één, twee en vier weken oud, vergeleken met volwassen muizen van acht weken oud, ook met deze methode geëvalueerd kunnen worden tijdens het uitvoeren van de procedure.

Het is belangrijk om erop te letten dat er een voldoende hoeveelheid geïsoleerde cellen van goede kwaliteit aanwezig is, wat goede resultaten voor het gehele experiment zal garanderen.