Name: Detectie van microRNAs in Microglia door Real-time PCR in Normal CNS en tijdens ontstekingsprocessen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Leer microRNA-detectie in microglia via real-time PCR in het normale CZS en tijdens ontstekingsprocessen. Deze methode analyseert expressieniveaus met de delta delta CT-methode.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk werd ondersteund door de NIH R01 NS071039-01A1 onderzoek te verlenen.

<ol><li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Microglia+in+the+Healthy+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Role of Microglia in the Healthy Brain.</a> J. Neurosci. 31, 16064-16069 (2011).</li>
<li>Graeber, M. B., Li, W., Rodriguez, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+microglia+in+CNS+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Role of microglia in CNS inflammation.</a> FEBS Lett. , (2011).</li>
<li>Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+cell+activation+and+proliferation+precedes+the+onset+of+CNS+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity.</a> J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).</li>
<li>Perruisseau-Carrier, C., Jurga, M., Forraz, N., McGuckin, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNAs+stem+cell+reprogramming+for+neuronal+induction+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">miRNAs stem cell reprogramming for neuronal induction and differentiation.</a> Mol. Neurobiol. 43, 215-227 (2011).</li>
<li>McCoy, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+miRNAs+in+cytokine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">The role of miRNAs in cytokine signaling.</a> Front Biosci. 17, 2161-2171 (2010).</li>
<li>He, M., Xu, Z., Ding, T., Kuang, D. M., Zheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-155+regulates+inflammatory+cytokine+production+in+tumor-associated+macrophages+via+targeting+C%2FEBPbeta%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-155 regulates inflammatory cytokine production in tumor-associated macrophages via targeting C/EBPbeta.</a> Cell Mol. Immunol. 6, 343-352 (2009).</li>
<li>Ponomarev, E. D., Veremeyko, T., Barteneva, N., Krichevsky, A. M., Weiner, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-124+promotes+microglia+quiescence+and+suppresses+EAE+by+deactivating+macrophages+via+the+C%2FEBP-alpha-PU.1+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-124 promotes microglia quiescence and suppresses EAE by deactivating macrophages via the C/EBP-alpha-PU.1 pathway.</a> Nat. Med. 17, 64-70 (2011).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Specific+Cell+Population+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> J. Vis. Exp. (41), e1546-3791 (2010).</li>
<li>Gabriely, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+21+promotes+glioma+invasion+by+targeting+matrix+metalloproteinase+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA 21 promotes glioma invasion by targeting matrix metalloproteinase regulators.</a> Mol. Cell Biol. 28, 5369-5380 (2008).</li>
<li>Caffarelli, E., Filetici, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+in+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation in cancer development.</a> Front Biosci. 17, 2682-2694 (2011).</li>
<li>Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li>
<li>Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+magnetic+separation+method+for+high-yield+isolation+of+pure+primary+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia.</a> J. Neurosci. Methods. 194, 287-296 (2011).</li>
<li>Moltzahn, F., Hunkapiller, N., Mir, A. A., Imbar, T., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Throughput+MicroRNA+Profiling%3A+Optimized+Multiplex+qRT-PCR+at+Nanoliter+Scale+on+the+Fluidigm+Dynamic+ArrayTM+IFCs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs.</a> J. Vis. Exp. (54), e2552(2011).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Onlangs grote belangstelling werd gegeven aan microglia en de betrokkenheid van deze cellen in een groot aantal pathologieën geassocieerd met neuroinflammatie en neurodegeneratie. Daarnaast is de rol van microRNA&#39;s in de differentiatie van immuun-en kankercellen sterk gegroeid de afgelopen jaren 5,10. We hebben recent de rol van miR-124 in het onderhoud van niet-geactiveerde of rust-fenotype van microglia in normale CNS 7, maar de rol van de andere soorten van microRNA&#39;s in de microglia fen...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td> GIBCO </td><td> 14190 </td><td> Kunnen worden bereid uit droge componenten in het laboratorium, pH: 7,2-7,4 </td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30258.02 </td><td> Kunnen worden bereid uit droge componenten in het laboratorium, pH: 7,2-7,4 </td></tr><tr><td> DMEM; FBS </td><td> GBCO </td><td> 11965; 10438 </td><td></td></tr><tr><td> Mirvana kit </td><td> Invitrogen </td><td> AM1561 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> Sigma </td><td> P4937-500 ml </td><td> 100 ml van 100% Percoll wordt bereid door 10 ml 10X PBS en 90 ml Percoll van Sigma. 50 ml 70% Percoll isbereid door 35 ml van 100% Percoll en 15 ml DMEM 50 ml 40% Percoll wordt bereid door 20 ml van 100% Percoll en 30 ml PBS 1X </td></tr><tr><td> MOG 35-55 peptide </td><td> AnaSpec Inc </td><td> 60130-5 </td><td></td></tr><tr><td> CFA </td><td> Difco </td><td> 263810 </td><td></td></tr><tr><td> Pertussistoxine </td><td> Sigma </td><td> P7208 </td><td></td></tr><tr><td> FcR blokkerende antilichamen </td><td> BD Biosciences </td><td> 553142 </td><td> Clone 2.4G2 </td></tr><tr><td> Anti-CD11b - PE mAb </td><td> BD Biosciences </td><td> 553311 </td><td> Kan gebruikt worden met verschillende fluoroforen (bijv. AF488) </td></tr><tr><td> Anti-CD45-APC-Cy7 mAb&#39;s </td><td> Biolegend </td><td> 103116 </td><td> Kan gebruikt worden met verschillende fluoroforen (bv. APC) </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde (16%) </td><td> EMS Inc </td><td> 15710 </td><td> Verdun 1:15 in PBS 1X </td></tr><tr><td> 15% TBE-Urea Gel </td><td> Life Technologies Inc </td><td> EC68855BOX </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4366596 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan Universal PCR Master Mix </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4304437 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan MicroRNA Testen MMU-miR-124a </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4427975 ID 001182 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan MicroRNA Testen snoRNA-55 </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4427975 ID 001228 </td><td></td></tr><tr><td> Nuclease-vrij water </td><td> Life Technologies Inc </td><td> AM9937 </td><td> Nuclease-vrij water </td></tr><tr><td> 384-wells duidelijke optische reactieplaat </td&gt; <td> Life Technologies Inc </td><td> 4309849 </td><td> Kan worden gesubstitueerd met andere platen (bijv. 96 wei-plaat) in verschillende real-time PCR instrumenten </td></tr><tr><td> Dounce homogenisator (15 ml) </td><td> Wheaton Science Products. </td><td> 358044 </td><td> Teflon / glas </td></tr><tr><td> 40 μ nylon cel zeef </td><td> Valk </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> Big centrifuge </td><td> Sorval </td><td> RT 6000B </td><td> Rotor diameter 18,5 cm </td></tr><tr><td> Kleine centrifuge </td><td> Eppendorf </td><td> 5415 R </td><td> Rotor diameter 6,5 cm </td></tr><tr><td> Real-time PCR-instrument </td><td> Life Technologies Inc </td><td> AB 7900 HT </td><td> Kan worden gesubstitueerd met andere instrumenten </td></tr><tr><td> Flowcytometer </td><td> BD Biosciencess </td><td> LSR II </td><td> Kan worden gesubstitueerd met andere instrumenten </td&gt; </tr><tr><td> FACS </td><td> BD Biosciences </td><td> FACSAria </td><td> Kan worden gesubstitueerd met andere instrumenten </td></tr><tr><td> NanoDrop spectrofotometer </td><td> Thermo Scientific </td><td> NanoDrop 1000 </td><td></td></tr></tbody></table>

detectie van microrna&#39;s in microglia door real-time pcr in normal cns en tijdens ontstekingsprocessen

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglia cellen van de myeloïde afstamming die zich in het centrale zenuwstelsel (CNS) 1. Deze cellen spelen een belangrijke rol in de pathologie van de vele ziekten die samenhangen met neuroinflammatie zoals multiple sclerose (MS) 2. Microglia in een normale CNS te uiten macrofaag marker CD11b en vertonen een rust-fenotype met het uitspreken van een laag niveau van activatie markers zoals CD45. Tijdens de pathologische gebeurtenissen in het CZS, microglia geactiveerd zoals bepaald worden door verhoogde expressie van CD45 en andere markers 3. De factoren die microglia fenotype en functies in het centraal zenuwstelsel aantasten zijn niet goed onderzocht. MicroRNA (miRNAs) zijn een groeiende familie van geconserveerde moleculen (~ 22 nucleotiden lang) die betrokken zijn bij veel normale fysiologische processen, zoals celgroei en-differentiatie 4 en aandoeningen zoals ontsteking 5. MiRNAs downregulate de expressie van bepaalde genen door binding complementaire sequenties van deir. mRNA&#39;s en spelen een belangrijke rol in de activering van aangeboren immuunsysteem cellen waaronder macrofagen 6 en microglia 7. Om te onderzoeken miRNA gemedieerde paden die de microgliale fenotype, biologische functie te definiëren, en om microglia te onderscheiden van andere vormen van macrofagen, is het belangrijk om kwantitatief beoordelen van de expressie van bepaalde microRNA&#39;s in verschillende subsets van CNS-ingezeten microglia. Gemeenschappelijke methoden voor het meten van de expressie van miRNAs in het centraal zenuwstelsel zijn onder andere kwantitatieve PCR uit hele neuronaal weefsel en in situ hybridisatie. Echter, kwantitatieve PCR van hele weefsel homogenaat niet wordt het mogelijk de expressie van miRNA in microglia die slechts 5-15% van de cellen van neuronale weefsel vormen. Hybridisatie in situ laat de evaluatie van de expressie van microRNA in specifieke celtypen in weefselcoupes, maar deze methode is niet geheel kwantitatief. In dit rapport beschrijven we een kwantitatieve en senstieve methode voor de detectie van miRNA door real-time PCR in microglia geïsoleerd van normale CNS of tijdens neuroinflammatie met behulp van experimentele auto-immune encephalomyelitis (EAE), een muismodel voor MS. De beschreven methode zal nuttig zijn om het niveau van expressie van microRNA&#39;s in microglia in normale CNS of tijdens neuroinflammatie in verband met diverse aandoeningen zoals MS, beroerte, traumatisch letsel, de ziekte van Alzheimer en hersentumoren te meten.

Microglia zijn gevestigd macrofagen dat de eerste lijn van verdediging en het immuunsysteem de bewaking van het centrale zenuwstelsel te bieden. MicroRNA zijn moleculen die een belangrijke rol spelen in tal van fysiologische processen, zoals activatie en differentiatie van macrofagen. In dit artikel beschrijven we de methode voor het meten van microRNA&#39;s in de microglia.

Detectie van microRNA&#39;s in Microglia door Real-time PCR in Normal CNS en tijdens ontstekingsprocessen

Microglia zijn cellen van de myeloïde lijn die zich in het centrale zenuwstelsel (CZS) bevinden1. Deze cellen spelen een belangrijke rol bij de pathologie van vele ...

Het algemene doel van deze procedure is het analyseren van de expressie van micro-RNA in microglia. Dit wordt bereikt door eerst de hersenen en het ruggenmerg te dissekeren en vervolgens het weefsel van het centraal zenuwstelsel of CZS te homogeniseren. In de tweede stap worden mononucleaire cellen uit het CZS geïsoleerd via een Percoll-gradiënt, waarna de microgliapopulatie wordt geïdentificeerd middels FACS.Vervolgens wordt het microgliale RNA geïsoleerd en wordt de kwaliteit van de monster geanalyseerd. Ten slotte wordt real-time PCR uitgevoerd voor het specifieke micro RNA van belang. Uiteindelijk kan de delta delta CT-methode worden gebruikt om het relatieve expressieniveau van een specifiek micro RNA in microglia aan te tonen.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben omdat ze er niet in slagen een voldoende aantal mononucleaire cellen uit het CZS te isoleren of omdat het monster is verontreinigd met myeline en celresten. Beide gevallen resulteren in een preparatie van lage kwaliteit, respectievelijk door een lage RNA-concentratie of door eiwitverontreiniging. De procedure zal worden gedemonstreerd door mij en vir.Dr.O fellow van na perfus

detection-micrornas-microglia-real-time-pcr-normal-cns-during

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een sleutel tot succesvolle onderzoek van microglia biologie is het behoud van microglia immunofunction ex vivo tijdens isolatie van CZS-weefsel. Isoleren microglia via roterende schudden resulteert in zeer zuivere en immunofunctional celculturen zoals beoordeeld door fluorescerende beeldvorming, immunocytochemie, en ELISA na microglia-activatie met de pro-inflammatoire stimuli lipopolysaccharide (LPS) en Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolatie van corticale Microglia met Conserven immunofenotype en functionaliteit van Muriene Pasgeborenen

We beschrijven een protocol van real time PCR om microRNA profileren in de cerebrospinale vloeistof (CSF). Met uitzondering van RNA-extractie protocollen kan de procedure worden uitgebreid tot RNA geëxtraheerd uit andere lichaamsvloeistoffen, gekweekte cellen of weefselmonsters.

Cerebrospinale vloeistof MicroRNA Profiling Met behulp van kwantitatieve real time PCR

Microglia-activatie en microgliose zijn de belangrijkste reacties op chronische neurodegeneratie. Hier presenteren we werkwijzen voor in vivo visualisatietechnieken retinale CX3CR1-GFP + cellen door microgliale confocale Ophthalmoscopie, en drempel en morfometrische analyses worden geïdentificeerd en gekwantificeerd hun activering. We monitoren microglia veranderingen tijdens de vroege stadia van leeftijdsgebonden glaucoom.

In Vivo Dynamiek van retinale Microgliale Activering Tijdens Neurodegeneratie: Confocal oftalmoscopisch Imaging en Cell Morphometry in Mouse Glaucoom

Microglia (immuuncellen van de hersenen), worden gebruikt als een surrogaat biosensor om te bepalen hoe nanodeeltjes neurotoxiciteit beïnvloeden. We beschrijven een reeks experimenten die zijn ontworpen om de microgliale respons op nanodeeltjes te meten en de blootstelling van hypothalamusneuronen aan supernatant van geactiveerde microglia om neurotoxiciteit te bepalen.

Microglia als een surrogaat Biosensor om te bepalen nanodeeltjes Neurotoxiciteit

Hier presenteren we een protocol microglia van postnatale muizen pups isolaat (dag 1) voor in vitro experimenten. Deze geïmproviseerde winmethode genereert zowel hoge opbrengst en zuiverheid, een significant voordeel boven alternatieve werkwijzen die breed experimenten met het oog op toelichting van microgliale biologie maakt.

Snelle en Geraffineerde CD11b magnetische Isolatie van Primary Microglia met verbeterde zuiverheid en veelzijdigheid

We bieden een protocol voor isolatie van Microglia uit verschillende ontleed gebieden van een volwassen muis hersen halfrond, gevolgd door semi-geautomatiseerde bibliotheek voorbereiding voor diepe eencellige RNA-sequencing van volledige lengte transcriptomes. Deze methode zal helpen om functionele heterogeniteit van Microglia in gezondheid en ziekte te verhelmaken.

Isolatie van regiospecifieke Microglia van één volwassen muis hersen halfrond voor diepe eencellige RNA-sequencing

Primaire microgliaculturen worden vaak gebruikt om nieuwe ontstekingsremmende moleculen te evalueren. Het huidige protocol beschrijft een reproduceerbare en relevante methode om microglia magnetisch te isoleren van pasgeboren pups.

Magnetische isolatie van microgliale cellen van neonate muis voor primaire celculturen

Dit artikel beschrijft een methode voor chronische in vivo observatie van de rustende microglia in de hippocampus CA1 van de muis met behulp van nauwkeurig gecontroleerde chirurgie en twee-fotonenmicroscopie.

In Vivo Chronische twee-foton beeldvorming van microglia in de hippocampus van de muis

We beschrijven een protocol voor het isoleren van microgliacellen uit de hypothalamus van de muis (of gelijkwaardige kleine hersenstructuren) met behulp van magnetisch geactiveerde celsortering (MACS), in een relatief korte tijd. De MACS-gesorteerde hypothalamische microglia kunnen worden gebruikt voor ex vivo-analyse en kunnen worden geplateerd om in vitro-assays uit te voeren.

Isolatie van hypothalamische microglia uit vers doorbloede volwassen muizenhersenen door magnetisch geactiveerde celsortering  

Dit artikel demonstreert een methode om microglia-motiliteit en contact met postsynaptische puncta in het netvlies te visualiseren en te kwantificeren met behulp van spinning disk confocale microscopie.

Live beeldvorming en karakterisering van microglia-dynamica en interacties met synapsen in een zieke muisnetvlies

Mapping Microglial Parameters Software (MMPS) is een gebruiksvriendelijke analysepijplijn die geen codeerexpertise vereist en semi-automatiseert single-cel microgliale morfologieanalyse op basis van immunofluorescentiebeelden. Gevalideerd in een door knaagdieren geïnduceerd neuro-inflammatiemodel, detecteert MMPS reproductief activatie-geassocieerde morfologische veranderingen en maakt gestandaardiseerde, schaalbare microgliale fenotypering mogelijk.

Mapping Microglial Parameters Software (MMPS): Een open-source, gebruiksvriendelijke tool voor kwantitatieve microglia-morfologieanalyse

Leer microRNA-detectie in microglia via real-time PCR in het normale CZS en tijdens ontstekingsprocessen. Deze methode analyseert expressieniveaus met de delta delta CT-methode.

Detectie van microRNA's in Microglia door Real-time PCR in Normal CNS en tijdens ontstekingsprocessen

Meer video's verkennen