Name: High-throughput Zuivering van Affinity gemerkte recombinante eiwitten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Leer hoe je His-gemerkte recombinante eiwitten hoogdoorvoers zuivert met vloeistofhanteringsrobotica. Deze methode minimaliseert menselijke fouten en zorgt voor reproduceerbare resultaten in eiwitbiochemie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een Wellcome Project Grant (078043/Z/05/Z) naar ROJW

DEEL A: High-throughput groei van bacteriekweken. 1. Overnachting groeien bacteriën op in 2 ml Zelfinductie Medium Met behulp van 24-well platen <ol><li> Steriliseer de 24-well platen met magnetron. </li><li> Inoculeer 1,5 ml van auto-inductie medium (Overnight Express Medium) met vers gekweekte bacteriële kolonies of bevroren glycerol voorraden. We normaal enten drie putjes per mutant met drie individuele kolonies gekloneerd. Reserve zes putten voor positieve en negatieve controles. Voor de positieve controles we groeien drie wildtype klonen en de negatieve controles we opgroeien 2 klonen die zijn getransformeerd met niet-expressie plasmide. Controleer op voldoende sterilisatie van de plaat door het verlaten van een put leeg voor de middellange-only controle. </li><li> Groeien de cellen gedurende 18 uur bij 37 ° C en schudden bij 250 rpm. Wij gebruiken lac-induceerbare BL21 (DE3) Rosetta 2 cellen. Auto-inductie medium bevat een mengsel van glucose en lactose. De bacteriën aanvankelijkvoeden glucose en dan beginnen lactose, die ook induceert de expressie van de recombinant eiwitten gebruikt. </li><li> Verwijder het deksel en plaats de plaat op de robot-platform. </li></ol> DEEL B: Robotic zuivering van recombinante eiwitten. 2. Bereid de Robotic Platform <ol><li> Vul de wasbuffer bestaande uit 20 mM imidazool, 0,1% Triton X-100, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-acetaat, pH 7,9, 10 mM MgOAc 2, 0,7 mM ZnOAc 2, 10% glycerol en de elutiebuffer bestaande van 0,5 M imidazool, 0,1% Triton X-100, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-acetaat, pH 7,9, 10 mM MgOAc 2, 0,7 mM ZnOAc 2, 10% glycerol. Deze buffers worden gebruikt om de korrels wassen na het gemerkte eiwitten zijn gebonden aan hen of de eiwitten elueren van de bolletjes respectievelijk. </li><li> Vul de bacteriële verdunningsmiddel (100 ml gedestilleerd water met 15 pi antischuim reagens). Deze oplossing wordt gebruiktverdunningen van de bacteriële culturen overnacht optische dichtheid (A600) metingen. De aanwezigheid van het verdunningsmiddel antischuim in de vorming van luchtbellen die zou interfereren met de plaatlezer metingen. </li><li> Make-up de lysis oplossing bestaande uit 10x Fastbreak reagens, 2 pl lysonase per monster en 15 mM MgOAc 2. Fastbreak bevat een mix van detergentia en zouten die de celwand afbreken en vergemakkelijken de afgifte van intracellulaire eiwitten. Lysonase is een eigen mix van lysozym en een nuclease. Lysozym helpt bij het verstoren van de celwand en de nuclease verteert het model bacteriële nucleïnezuren. </li><li> Optioneel: Maak een 6 M guanidine hydrochloride-oplossing. Sommige recombinante eiwitten hebben de neiging vast te houden aan de Teflon-coating pipetteren naalden. De guanidine hydrochloride-oplossing denatureert eiwitten en wast ze af effectiever dan water die routinematig wordt aan de wasbare robot pipetteren tips spoel gebruikt na iedere step. </li><li> Bereid de BCA (bicinchoninic zuur) eiwit kwantificatie reagens door mengen bicinchoninic zuuroplossing (reagens A) en de kopersulfaatoplossing (reagens B): peptidebindingen Cu 2 + verminderen van de CuSO 4 component in de BCA reagens Cu 1 + waarbij de hoeveelheid Cu 1 + evenredig is met het aantal peptidebindingen in de oplossing. In een tweede stap twee moleculen bicinchoninic zure chelaat Cu 1 + resulteert in een verschuiving absorptie tot 562 nm, resulterend in een paarse kleur. De kleurreactie is tijdsafhankelijk en meestal moet een aantal uren als definitief. Daarna wordt de kleur is stabiel gedurende enkele uren. </li><li> Vul troggen en platen van de juiste maat en plaats ze in hun pre-toegewezen posities op de robot-platform. </li><li> Plaats een 24-well plaat voor de guanidine hydrochloride afval, twee duidelijke 96-well platen voor OD 600 en absorptiemetingen en een blauwe 96-well plaat voor the gezuiverde eiwitten op hun posities op het platform. Plaats een 96-deepwell plaat op de magnetische voet. </li><li> Verdun MagneHis Ni-deeltjes die eiwitten binden door het vormen van chelaten met de His-tags 5-voudig in gedestilleerd water en vul deze in de kraal-unit roeren. Zet de roerder op de kralen in suspensie te houden. </li><li> Schakel de robot platform en spoel het pipetteren naalden gedurende enkele minuten om luchtbellen die anders zouden interfereren met de pipetteren nauwkeurigheid te verwijderen. De herbruikbare pipetteren naalden gespoeld tussen individuele pipetteerstappen. Alternatief zou wegwerptips worden gebruikt. Alle volgende stappen worden uitgevoerd robot. De robot protocol is op aanvraag beschikbaar. </li></ol> 3. Celgroei wordt gecontroleerd door het meten van de OD600 <ol><li> 10 pi overnacht kweek wordt verdund in 90 pi verdunningsmiddel oplossing. </li><li> Meet de OD 600 zodat de bacteriën gekweekt in vergelijkbare dichtheden(Figuur 1). </li></ol> 4. De cellen worden opengebroken om de eiwitten los en om Bead-bindende <ol><li> 100 pl van magnetische Ni-bead suspensie verdeeld in elk putje van een tweede plaat met 24 putjes. </li><li> 900 pl van elke kleinschalige bacteriekweek wordt omgezet in een 24-wells plaat met de korrels. Voeg 100 ul van de 10x Fastbreak / lysonase mix. </li><li> De plaat met 24 putjes overgebracht naar het schudplatform voor snelle schudden (800 rpm) gedurende 30 min bij kamertemperatuur. Celwand worden verstoord door een combinatie van mechanische krachten en chemische werking en het recombinant geproduceerde eiwitten vrij in oplossing. Met hun affiniteitsmerkers ze onmiddellijk binden de paramagnetische chelerende nikkel kralen. </li></ol> 5. De parels worden gewassen <ol><li> De cel-lysaten met de geresuspendeerde magnetische korrels worden overgebracht naar een 96-deepwell plaat die is geplaatst op een frame met magnetic staven die glijden tussen de putten. De 96-well platen hebben een vierkante kegelvormige bodem die gemakkelijker verwijdering van het supernatant maakt. De uitsparingen kunnen houden volumes tot 2,1 ml maar gevuld met veel kleinere volumes. Dit stelt ons in staat om krachtig schudden stappen zonder monster kruisbesmetting te voeren door spatten. </li><li> De pipetpunten werden gewassen tussen individuele pipetteerstappen met 6 M guanidine-HCl. Deze stap is cruciaal voor de zuivering van TFIIB en andere &quot;sticky&quot; eiwitten om kruisbesmetting te voorkomen. Met andere eiwitten kan het voldoende uitvoerig spoelen met water naalden tussen de pipetteerstappen. </li><li> De magnetische staven van het magnetische stand trekken paramagnetische deeltjes, trekken ze weg van het midden van de putten en laat het pipetteren naalden vrije toegang tot de supernatant. De supernatant wordt verwijderd. </li><li> 500 ui wasbuffer eerst toegevoegd aan de 24-well plaat en vervolgens overgebracht naar de 96-well plaat eNSure de volledige overdracht van de korrels. De 24-well plaat uit de shaker. </li><li> Een 500 ui wasbuffer wordt rechtstreeks toegevoegd aan de 96-well plaat, wordt de plaat naar de shaker en krachtig geschud gedurende 1 minuut. De plaat wordt verplaatst naar de magnetische standaard en de wasbuffer verwijderd. </li><li> Deze stap wordt tweemaal herhaald en de wasprocedure is voltooid door eventuele buffer resten van de plaat. </li></ol> 6. Elueer het Eiwitten in Elution Buffer <ol><li> 100 ul elutiebuffer toegevoegd aan de korrels, wordt de plaat naar de shaker en krachtig geschud gedurende 30 min bij kamertemperatuur. </li><li> De plaat wordt verplaatst naar de schudder en het eluaat met het gezuiverde recombinante eiwit wordt overgebracht naar een nieuwe plaat. </li></ol> 7. De concentraties van de gezuiverde eiwitten <ol><li> 190 pi van BCA reagens mengsel overgebracht naar een duidelijke 96-well plaat en 10 ul van het proeiwit-oplossing toegevoegd. </li><li> Na enkele uren incubatie (gewoonlijk 5-6 of overnacht), meet de absorptie en vergelijken met BSA standaarden de concentraties van elk van de gezuiverde eiwitpreparaten (figuur 2) bepalen. </li><li> De gezuiverde eiwitten kunnen nu worden gebruikt voor verdere toepassingen de geschikte concentraties (Figuur 3). </li></ol> 8. Representatieve resultaten De zuivering protocol biedt twee kwaliteitscontrole fasen, waarvan voorbeelden worden getoond. We kunnen identificeren en mogelijke problemen op het bacteriële document groeistadium (figuur 1) en later bij het ​​beoordelen van de opbrengsten van de gezuiverde eiwitten (Figuur 2). We meestal zuiveren eiwitten en test ze in drievoud. Dit, in combinatie met de twee stappen van kwaliteitscontrole, geeft ons vertrouwen dat alle variaties we waargenomen in onze functionele assays zijn het gevolg van de mutant phenotype (figuur 3) en niet veroorzaakt door experimentele variaties of mislukte zuivering. De opbrengsten bedraagt ​​gewoonlijk 50 tot 200 pg en meer dan voldoende voor verschillende functionele bepalingen. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig1.jpg" /> Figuur 1. Histogram van de OD metingen van een plaat met 24 putjes met Overnachtkweken. Drie klonen zes TFIIB mutante varianten alsmede het wildtype TFIIB zijn geteeld. Twee klonen die niet tot expressie plasmide en een goed met medium alleen als negatieve controles. De OD metingen tonen aan dat er kleine variaties in de groei tussen de afzonderlijke culturen. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig2.jpg" /> Figuur 2. Eiwitopbrengsten verkregen uit deze culturen zoals bepaald door een BCA assay en bevestigd door SDS PAGE. Een van de varianten niet tot expressie op een hoog niveau. In comcombinatie met figuur 1, kunnen we concluderen dat dit niet te wijten aan differentiële celgroei, maar als gevolg van eiwitexpressie niet goed geïnduceerd. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig3.jpg" /> Figuur 3. Representatief resultaat van een transcriptie assay. We hebben de stimulering activiteit van TFIIB varianten op de productie van kleine mislukte transcripten door RNAP. Hier worden de stimulatie-effecten van een volledige bibliotheek van enkelvoudige aminozuursubstituties van TFIIB residu K87 getoond. De hoge mate van reproduceerbaarheid wordt bevestigd door kleine fouten. Een monster gel die de resultaten van drie mutanten vergeleken met wildtype (wt), negatieve controles (NC) en elutiebuffer betreft alleen afgebeeld eronder.

<ol><li>Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleotide+addition+cycle+of+RNA+polymerase+is+controlled+by+two+molecular+hinges+in+the+Bridge+Helix+domain%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">The nucleotide addition cycle of RNA polymerase is controlled by two molecular hinges in the Bridge Helix domain.</a> BMC Biol. 8, 1741-7007 (2010).</li>
<li>Nottebaum, S., Tan, L., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+polymerase+factory%3A+a+robotic+in+vitro+assembly+platform+for+high-throughput+production+of+recombinant+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The RNA polymerase factory: a robotic in vitro assembly platform for high-throughput production of recombinant protein complexes.</a> Nucleic Acids Res. 36, 245-252 (2008).</li>
<li>Tan, L., Wiesler, S., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridge+helix+and+trigger+loop+perturbations+generate+superactive+RNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bridge helix and trigger loop perturbations generate superactive RNA polymerases.</a> J. Biol. 7, 40(2008).</li>
<li>Wiesler, S. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+linker+domain+of+basal+transcription+factor+TFIIB+controls+distinct+recruitment+and+transcription+stimulation+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The linker domain of basal transcription factor TFIIB controls distinct recruitment and transcription stimulation functions.</a> Nucleic Acids Res. 39, 464-474 (2011).</li>
<li>Weinzierl, R. O., Wiesler, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+Function+of+TFIIB%5BTitle%5D)+AND+%22Transcription%22%5BJournal%5D)">Revealing the Function of TFIIB.</a> Transcription. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Bell, S. D., Magill, C. P., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+and+regulated+transcription+in+Archaea%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+transactions%22%5BJournal%5D)">Basal and regulated transcription in Archaea.</a> Biochemical Society transactions. 29, 392-395 (2001).</li>
<li>Parvin, J. D., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+topology+and+a+minimal+set+of+basal+factors+for+transcription+by+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA topology and a minimal set of basal factors for transcription by RNA polymerase II.</a> Cell. 73, 533-540 (1993).</li>
<li>Tyree, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+minimal+set+of+proteins+that+is+sufficient+for+accurate+initiation+of+transcription+by+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Identification of a minimal set of proteins that is sufficient for accurate initiation of transcription by RNA polymerase II.</a> Genes. 7, 1254-1265 (1993).</li>
<li>Batada, N. N., Westover, K. D., Bushnell, D. A., Levitt, M., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+nucleoside+triphosphates+and+role+of+the+entry+site+to+the+RNA+polymerase+II+active+center%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Diffusion of nucleoside triphosphates and role of the entry site to the RNA polymerase II active center.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17361-17364 (2004).</li>
<li>Liu, X., Bushnell, D. A., Wang, D., Calero, G., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+an+RNA+Polymerase+II-TFIIB+Complex+and+the+Transcription+Initiation+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Structure of an RNA Polymerase II-TFIIB Complex and the Transcription Initiation Mechanism.</a> Science (New York, N.Y). 327, 206-209 (2010).</li>
<li>Kostrewa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+II-TFIIB+structure+and+mechanism+of+transcription+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase II-TFIIB structure and mechanism of transcription initiation.</a> Nature. 462, 323-330 (2010).</li>
<li>Werner, F., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+modulation+of+RNA+polymerase+core+functions+by+basal+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Direct modulation of RNA polymerase core functions by basal transcription factors.</a> Molecular and cellular biology. 25, 8344-8355 (2005).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De geautomatiseerde recombinant eiwit zuiveringswerkwijze hier beschreven maakt de productie en zuivering van een groot aantal mutante eiwitten in een kleinschalig format onder zeer reproduceerbare omstandigheden met minimale menselijke tussenkomst. Figuren 1 en 2 tonen de resultaten van systematische kwaliteit controles en voorbeelden van de gezuiverde eiwitten. Figuur 3 toont dat de gezuiverde transcriptiefactoren in dit voorbeeld uitvoeren in een zeer reproduceerbare wijze in functionele testen. Hoewel de procedure ontwikkeld voor de zuivering van archaeale TFIIB is breed toepasbaar voor de zuivering van affiniteit-gemerkte eiwitten. Het gebruik van dergelijke geautomatiseerde protocollen zuivering zal dus aanzienlijk vergemakkelijken biochemische analyse van recombinante eiwitten en aldus verder ons begrip van eiwit-eiwit interacties op een schaal die moeilijk handmatig bereiken.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> Overnight Express Instant TB Medium </td><td> Merck KGaA </td><td> 71.491-4 </td><td></td></tr><tr><td> Fastbreak </td><td> Promega Ltd </td><td> V8573 </td><td></td></tr><tr><td> Lysonase Bioprocessing Reagens / 1 ml </td><td> Merck KGaA </td><td> 71230 </td><td></td></tr><tr><td> Antifoam 204 </td><td> Sigma-Aldrich Company Ltd </td><td> A6426 </td><td></td></tr><tr><td> MagneHis Ni-deeltjes </td><td> Promega </td><td> V8565 </td><td></td></tr><tr><td> Imidazool </td><td> Sigma-Aldrich Company Ltd </td><td> 56750 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma basis </td><td> Sigma-Aldrich Compelke Ltd </td><td> 93362 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> VWR </td><td> 27810.295 </td><td></td></tr><tr><td> Bicinchoninic Acid eiwitbepaling </td><td> Sigma-Aldrich Company Ltd </td><td> BCA1-1KT </td><td></td></tr><tr><td> Deep Well Plate 2,2 ml Vierkante Wells PP PK10 </td><td> Anachem Ltd </td><td> 1810-00 </td><td></td></tr><tr><td> Microplate MicroWell 96 well platte bodem polystyreen niet behandeld 12 hulzen van 5 platen helder 0,4 ml en het volume 128 mm x 86 mm Thermo Scientific Nunc </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> DIS-984-090M </td><td></td></tr><tr><td> Microplate Blauw </td><td> VWR </td><td> NUNC367001 </td><td></td></tr><tr><td> 24-Well Blokken RB (24) </td><td> Qiagen </td><td> 19583 </td><td></td></tr><tr><td> Guanidinehydrochloride </td><td> VWR </td><td> ALFAA13543.0B </td><td></td></tr><tr><td> Wasbaar naald voor TheOnyx </td><td> Aviso GmbH </td><td> 8152-317001 </td><td></td></tr><tr><td> Reagens Rack voor Magnetic Beads </td><td> Aviso GmbH </td><td> 8152-035003 </td><td></td></tr><tr><td> Plate Reader Synergy HT </td><td> BioTek </td><td> 4200-000043 </td><td></td></tr><tr><td> Robotic Platform TheOnyx 44OH/150/100 </td><td> Aviso GmbH </td><td> 8145-050046 </td><td></td></tr><tr><td> Microplate Shaker Variomag Teleshaker </td><td> Inheco </td><td> 3800047 </td><td></td></tr><tr><td> 96-well Magneet Type A </td><td> Qiagen </td><td> 36915 </td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput zuivering van affinity gemerkte recombinante eiwitten

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray kristallografie is de voorkeursmethode voor het verkrijgen van een gedetailleerde weergave van de structuur van eiwitten. Dergelijke studies dienen te worden aangevuld met verdere biochemische analyses om gedetailleerd inzicht te krijgen in de structuur / functie relaties. Advances in oligonucleotide en gensynthese technologie grootschalige mutagenese strategieën steeds mogelijk, zoals de vervanging van doelresiduen door alle 19 andere aminozuren. Winst-of verlies-van-functie fenotype laat dan systematisch conclusies, zoals de bijdrage van bepaalde residuen de katalytische activiteit, eiwitstabiliteit en / of eiwit-eiwit interactie specificiteit. Om de verschillende fenotypes toeschrijven aan de aard van de mutatie - plaats van wisselende proefomstandigheden - het noodzakelijk is om de eiwitten te zuiveren en te analyseren in een gecontroleerde en reproduceerbare wijze. High-throughput strategieën en de automatisering van handmatige protocollen oprobot vloeistof-handling platforms hebben mogelijkheden om een dergelijke complexe moleculaire biologische procedures met weinig menselijke tussenkomst en minimale foutenpercentages 1 tot 5 uit te voeren. Hier geven we een algemene methode voor de zuivering van His-gelabeld recombinant eiwitten in een high-throughput manier. In een recente studie werd deze methode toegepast op een gedetailleerde structuur-functie onderzoek TFIIB, een component van het basale transcriptiemechanisme. TFIIB is onmisbaar voor promoter-gerichte in vitro transcriptie en is essentieel voor de rekrutering van RNA polymerase in een preinitiation complex 6-8. TFIIB bevat een flexibele linker domein dat de actieve plaats kloof van RNA polymerase 9-11 doordringt. Deze linker domein geeft twee biochemisch kwantificeerbare activiteiten TFIIB, namelijk (i) het stimuleren van de katalytische activiteit tijdens de &quot;mislukte&quot; fase van transcript initiatie en (ii) een extra bijdrage aan despecifieke werving van RNA-polymerase in de preinitiation complex 4,5,12. We gebruik gemaakt van de high-throughput zuiveringswerkwijze om enkele, dubbele en drievoudige substitutie en deleties mutaties genereren in de TFIIB linker en vervolgens te analyseren in functionele assays voor hun stimulerende werking op de katalytische activiteit van RNA polymerase 4. In totaal hebben we gegenereerd, gezuiverd en geanalyseerd 381 mutanten - een taak die zijn tijdrovend en arbeidsintensief om handmatig. Wij produceerden en de eiwitten getest in multiplicates die ons toeliet om een ​​experimentele variaties waarderen en gaf ons een duidelijk beeld van de reproduceerbaarheid van de resultaten. Deze methode als een algemeen protocol voor het zuiveren van His-gemerkte eiwitten en is met succes gebruikt om andere recombinante eiwitten te zuiveren. Het is geoptimaliseerd voor de zuivering van 24 eiwitten, maar kan worden aangepast om te zuiveren tot 96 eiwitten.

We beschrijven een werkwijze voor de affiniteit-gemerkte zuivering van recombinante eiwitten met vloeistof handling robotica. Deze methode is algemeen toepasbaar op de kleinschalige zuivering van oplosbare His-gemerkte eiwitten in een high-throughput format.

High-throughput Zuivering van Affinity gemerkte recombinante eiwitten

Röntgenkristallografie is de methode van voorkeur voor het verkrijgen van een gedetailleerd beeld van de structuur van eiwitten. Dergelijke studies moeten worden aangevuld met verdere ...

Het doel van deze procedure is om recombinant his-getagde eiwitten op een high-throughput manier te zuiveren met behulp van een geautomatiseerd protocol op een robotisch platform. Dit wordt bereikt door de eiwitten eerst te overexpresseren in e coli met behulp van kleine cultuurvolumes. Vervolgens worden de cellen chemisch gelyseerd om de eiwitten vrij te maken, die vervolgens binden aan magnetische nikkelkralen.Vervolgens worden de beads gewassen om contaminerende eiwitten te verwijderen en de zuiverheid van de gewenste eiwitten te verhogen. Ten slotte worden de eiwitten gezuiverd van de magnetische beads. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de concentratie en zuiverheid van de eiwitten aantonen via BCA-assays en SDS-PAGE, evenals aanvullende functionele assays om de activiteit van de eiwitten te bepalen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we nu een groot aantal eiwitten onder identieke omstandigheden kunnen zuiveren met minimale tussenkomst. Dit stelt ons in staat om een hoge mate van reproduceerbaarheid te verkrijgen en minimaliseert daarnaast menselijke fouten. Deze methode is met name nuttig voor het bestuderen van grote aantallen puntmutanten van een specifiek eiwit, aangezien het waarborgt dat variabiliteit in de activiteit van het eiwit daadwerkelijk te wijten is aan de mutatie en niet aan verschillen in de preparatie van de monsters.Om overnacht bacteriële culturen voor te bereiden, begint u met het vullen van 24-wells platen met water en het twee minuten magnetronen hiervan om ze steriel te maken. Gooi het water weg en magnetron de platen opnieuw gedurende twee minuten. Inoculeer 1,5 milliliters auto-inductiemedium dat een mengsel van glucose en lactose bevat, met vers gegroeide niet-induceerbare BL 21 Rosetta 2 bacteriële kolonies of bevroren glycerolstocks. Reserveer drie wells elk voor positieve en negatieve controles, en één well met enkel medium als controle.Kweek de cellen 18 uur lang bij 37 graden Celsius bij 250 RPM. Verwijder het deksel en plaats de plaat op het robotplatform. Het platform is voorzien van een grijparm om objecten van de ene naar de andere positie te verplaatsen, een pipetteerarm en diverse posities voor de platen en troggen, waaronder een schudplatform, een magnetische kraalroerder en een magnetisch platform.Bereid voor 96-wells platen de was- en verdunningsbuffers voor de zuiveringsprocedure volgens het geschreven protocol, met gebruik van 100 milliliters gedestilleerd water en 15 microliters van een antischuimreagens. Bereid een oplossing voor het verdunnen van overnight-culturen voor optische dichtheidsmetingen. Maak een lysisoplossing bestaande uit fast break reagent lyase en magnesiumacetaat en bereid een BCA-eiwitassay-oplossing.Aangezien TF twee B de neiging heeft aan de pipetteernaalden te kleven, dient er een zes M guaninehydrochloride-oplossing voor het wassen hiervan te worden voorbereid. Vul troggen of platen van de juiste afmeting met de betreffende buffers en plaats deze op de vooraf toegewezen posities op het robotplatform. Plaats één 24-wells plaat voor het guaninehydrochloride-afval, twee transparante 96-wells platen voor de OD 600- en absorbantiemetingen, en één blauwe 96-wells plaat voor de gezuiverde eiwitten.Plaats één 96-well plaat voor diepe putten op de magnetische houder. Gebruik water om de magna hair nikkeldeeltjes te verdunnen en voeg deze toe aan de roereenheid voor beads. Zet de roerder aan om de beads in suspensie te houden.Zet het robotplatform aan en spoel de pipetteernaalden gedurende enkele minuten door. Plaats de plaat op een schudplatform om luchtbellen te verwijderen en controleer de groei van de overnight celculturen. Verdun 10 µL cultuur in 90 µL verdunningsvloeistof, waarbij de pipetten tussen de toevoegingen worden gewassen.Meet vervolgens de dichtheid bij OD 600 wanneer de culturen vergelijkbare dichtheden hebben bereikt. Breng 100 µL magnetische nikkelbead-suspensie over naar de wells van een 24-wells plaat en breng 900 µL van elke cultuur over naar de wells, waarbij de pipetten tussen de stappen worden gewassen. Voeg vervolgens 100 µL fast break Lyase-mix toe.Plaats de plaat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op het schudplatform bij 800 RPM om de cellen te laten lyseren en de his-getagde eiwitten aan de beads te laten binden om de beads te wassen. Draagt ze over naar een 96-wellplaat op een standaard met magnetische staafjes die de beads wegtrekken uit het midden van de wells, verwijder het supernatant en gebruik zes mo iGuide hydrochloride om de pipetpunten te wassen. Voeg vervolgens 500 µL wasbuffer toe aan de wells van de 24.Neem een wellplaat en breng de monsters over naar de 96-wellplaat. Verwijder vervolgens het supernatant. Voeg 500 µL wasbuffer toe aan de 96-wellplaat.Wellplaat. Verplaats de plaat naar de schudmachine en schud de plaat gedurende één minuut krachtig. Plaats de plaat vervolgens terug op het magnetische rek en verwijder de wasbuffer.Voeg na de laatste wasbeurt 100 µL elutiebuffer toe aan de beads en schud krachtig gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Breng het eluaat vervolgens over naar een nieuwe plaat. Om de eiwitmonsters te kwantificeren, voegt u 190 µL BCA-reagens toe aan de wells van een transparante 96-wells plaat en voegt u 10 µL van de eiwitmonsters toe aan de wells.Incubeer de monsters gedurende ten minste vijf uur en meet de absorbentie met een set BSA-standaarden. De eiwitten worden vervolgens bewaard bij -80 °C. Het zuiveringsprotocol biedt twee kwaliteitscontrolefasen.Eerst tijdens de bacteriële groeifase, en later bij het bepalen van de eisopbrengsten. Door de eiwitten in triplicaat te zuiveren, kan worden vastgesteld of eventuele variaties in de functionele assays te wijten zijn aan de mutante fenotypen en niet zijn veroorzaakt door experimentele variaties of mislukte zuiveringen. De opbrengsten variëren doorgaans van 50 tot 200 micrograms en zijn meer dan voldoende voor functionele assays. Hoewel de techniek slechts ongeveer drie uur in beslag neemt zodra men deze beheerst, hoeft men, afgezien van het klaarzetten van het platform, het aanleggen van de culturen en het vervolgens verzamelen van de gezuiverde eiwitten, verder niets anders te doen.Na deze procedure kunnen functionele assays worden uitgevoerd. In ons geval betreft dit een reeks transcriptie-assays om te onderzoeken hoe de mutatie van TF twee B het effect op de katalytische activiteit van ar polymerase beïnvloedt.

high-throughput-purification-of-affinity-tagged-recombinant-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een roman en zeer efficiënte twee-staps affiniteitschromatografie protocol is ontwikkeld en wordt in detail beschreven. De methode is gebaseerd op een kleine zuivering tag met twee inherente affiniteit en is van toepassing op een breed scala van target eiwitten met verschillende eigenschappen.

Orthogonale Protein Purification Gesteund door een Small Bispecifieke Affiniteit Tag

Source: Becker, B., et al. A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain (RTA) Trafficking in Yeast. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the purification of a polyhistidine-tagged recombinant protein using nickel-based affinity chromatography. It outlines key steps, including bacterial lysis by sonication, clarification and filtration of the lysate, and selective binding and elution of the target protein using imidazole.

 An Affinity Chromatography Technique for the Purification of a Recombinant Bacterial Protein

In this video, we demonstrate the nickel affinity chromatography technique to purify histidine-tagged pyrophosphokinase enzymes from Clostridium difficile bacteria.

Nickel Affinity Chromatography-Based Protein Purification: A Technique to Purify Polyhistidine-Tagged Recombinant Proteins from Bacterial Cell Lysate

This video demonstrates tandem affinity purification — a technique to purify protein complexes from eukaryotic cells to study protein-protein interaction. The complex contains two proteins labeled with different epitope tags. Upon the purification of the complex using two resins with an affinity for the two different tags in a sequential manner, the presence of both proteins in the elute confirms the interaction between the two.

Tandem Affinity Purification Assay to Study Protein-Protein Interactions

Eiwitcomplexen katalyseren belangrijke cellulaire functies. Gedetailleerde functionele en structurele karakterisering van vele essentiële complexen vereist recombinante productie. MultiBac is een baculovirus / insectencelsysteem vooral afgestemd voor het uitdrukken van eukaryote eiwitten en hun complexen. MultiBac werd geïmplementeerd als een open-access platform en standaard operationele procedures ontwikkeld om het nut te maximaliseren.

De MultiBac Protein Complex Production Platform in het EMBL

In het huidige protocol, demonstreren we een zeer efficiënte en kosteneffectieve kleinschalige eiwitreiniging methode, die de zuivering van recombinante eiwitten mogelijk maakt door de unieke combinatie van een splitsbaar GST-tag en een kleine His-tag.

GST-Zijn zuivering: een twee-staps Affiniteitszuivering Protocol Meegevende Full-length gezuiverde eiwitten

Een protocol voor de kwantitatieve, high throughput screening expressie en analytische zuivering van fusie-eiwitten uit kleinschalige Escherichia coli culturen wordt beschreven en toegepast om de expressie van disulfide-rijke dierlijke gif eiwit targets.

High Throughput Screening Kwantitatieve Expressie en zuivering Toegepast op Recombinant Disulfide-rijke Venom eiwitten die in<em&gt; E. coli</em

Een procedure wordt gepresenteerd voor het uiteinde van de dCACHE periplasmische ligand bindend domein van Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 van integratie-organen en de zuivering aan opbrengst milligram hoeveelheden eiwit.

Methode voor het efficiënt uiteinde en zuivering van de Chemoreceptor-Ligand bindend domein

Een multi-kolom plaatadapter maakt het mogelijk om chromatografiekolommen te koppelen aan multi-well verzamelplaten voor parallelle affiniteit of ionenuitwisselingszuivering, wat een economische eiwitzuiveringsmethode met hoge doorvoer biedt. Het kan worden gebruikt onder zwaartekracht of vacuüm het leveren van milligram hoeveelheden eiwit via betaalbare instrumentatie.

Een economisch en veelzijdig eiwitzuiveringssysteem met hoge doorvoer met behulp van een plaatadapter met meerdere kolommen

Structurele en biochemische studies van menselijke membraantransporters vereisen milligramhoeveelheden stabiel, intact en homogeen eiwit. Hier beschrijven we schaalbare methoden om transporteurs van menselijke opgeloste stoffen te screenen, tot expressie te brengen en te zuiveren met behulp van codon-geoptimaliseerde genen.

High-Throughput expressie en zuivering van menselijke opgeloste stoffen voor structurele en biochemische studies

Dit artikel biedt een procedure voor de affiniteitszuivering van een humaan recombinant eiwit, flap endonuclease 1 (FEN1), dat is gelabeld met een 6X-histidine-tag. Het protocol omvat het gebruik van twee afzonderlijke geïmmobiliseerde metaalionkolommen voor de zuivering van het gelabelde eiwit.

Affiniteitszuivering van een 6X-His-gelabeld eiwit met behulp van een snel eiwitvloeistofchromatografiesysteem 

Leer hoe je His-gemerkte recombinante eiwitten hoogdoorvoers zuivert met vloeistofhanteringsrobotica. Deze methode minimaliseert menselijke fouten en zorgt voor reproduceerbare resultaten in eiwitbiochemie.

High-throughput Zuivering van Affinity gemerkte recombinante eiwitten

Meer video's verkennen