Multi-parameter meting van de doorlatendheid Transitie Pore Openen in Geïsoleerde Muis Heart Mitochondria

Het doel van deze video is om een procedure te beschrijven voor het karakteriseren van de mitochondriële permeabiliteitsovergang. Gebrekkige opening in mitochondria, geïsoleerd uit muizenhart. Ten eerste worden de mitochondria uit muizenharten geïsoleerd.

Met de methode van differentiële centrifugatie wordt de kwaliteit van de geïsoleerde mitochondriën vervolgens beoordeeld met een thermische zuurstofelektrode die is aangesloten op een computer om de respiratoire controle-ratio te meten en de integriteit van het mitochondriale membraan te evalueren. Vervolgens wordt met spectrofluorimetrische instrumentatie gelijktijdige meting van de calciumhuishouding, het mitochondriale membraanpotentieel en het mitochondriale volume gebruikt om de permeabiliteitstransitieporie-opening te bepalen.

De resulterende gegevens toonden verschillen in het calciumretentievermogen en de mitochondriale permeabiliteitstransitie. Een geringe sensitiviteit van geïsoleerde mitochondriën en de opening van de mitochondriale permeabiliteitstransitieporie is een complex fenomeen dat veranderingen op verschillende niveaus in de mitochondriale fysiologie en anatomie omvat.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat de gelijktijdige meting van meerdere parameters een vollediger beeld van het fenomeen geeft dan de meting van individuele parameters alleen, zoals calcium, mobilisatie of zwelling. Ontdooi vóór aanvang van de procedure de mitochondriën-isolatiebuffer en controleer de pH, welke 7.4 moet zijn. Plaats vervolgens alle buffers, schaaltjes en buisjes die gebruikt zullen worden op ijs. Let op dat alle stappen van het mitochondriën-isolatieprotocol op ijs moeten worden uitgevoerd.

Plaats de harten van geëuthanaseerde muizen in een Petrischaal en spoel eventueel bloed weg met koud mitochondriaal isolatiebuffer. Verplaats de harten vervolgens met een scalpel naar een nieuwe Petrischaal, verwijder het vet en de atria, en hak de harten vervolgens fijn tot er een homogeen product is verkregen.

Breng de fijngehakte harten over naar een conische buis van 50 milliliter. Voeg 10 milliliter mitochondria-isolatiebuffer met 0,1 milligram per milliliter trypsine toe en laat het monster 10 minuten op ijs verteren. Let op dat het gebruik van trypsine de opbrengst van geïsoleerde mitochondria verhoogt en constant gehouden moet worden tussen verschillende mitochondria-preparaties.

Wij raden echter aan om de functionaliteit van geïsoleerde mitochondriën te testen op preparaten die zijn verkregen zonder trypsine, om er zeker van te zijn dat het enzym de ionen niet beïnvloedt. Voeg na de incubatie 10 milliliters mitochondriën-isolatiebuffer toe met 0,1% vetzuurvrije BS, a, en vijf milligram trypsineremmer en meng door de buis enkele keren om te keren. Om de trypsine te neutraliseren, wordt het verteerde weefsel teruggewonnen door centrifugatie gedurende één minuut bij vier graden Celsius op lage tot gemiddelde snelheid.

Resuspendeer na het centrifugeren het weefsel in acht milliliter mitochondriën-isolatiebuffer met 0,1% vetzuurvrije BSA, terwijl het monster op ijs wordt bewaard. Gebruik een gemotoriseerde Dounce-homogenisator met een Teflon stamper om het monster te homogeniseren met vier tot zes passages bij 1.200 tot 1.400 RPM. Breng het homogenaat over naar een conische buis van 15 milliliter en centrifugeer dit bij 800 ×g gedurende 10 minuten bij 4 °C.

Om de kernen en weefselresten te pelletteren. Breng na het centrifugeren het supernatant met de mitochondriën over in microcentrifugebuisjes en centrifugeer deze bij 8, 000 ×g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Na het centrifugeren bevindt zich een witte laag bovenop de pellet.

Gebruik een vacuümsysteem om de witte laag bovenop het mitochondriële pellet voorzichtig af te zuigen en te verwijderen. Resuspendeer vervolgens het resterende donkerdere pellet, dat de mitochondriën bevat, in één milliliter mitochondriën-isolatiebuffer.

Centrifugeer de mitochondriën vervolgens bij 8,000 ×g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de mitochondriële pellet in 150 µL mitochondriën-isolatiebuffer; bewaar de mitochondriën op ijs.

De respiratie van geïsoleerde mitochondriën wordt gemeten met een oxy thermische zuurstofelektrode die is aangesloten op een computer en wordt aangestuurd door de Oxy Plus-software; de zuurstofelektrode moet op de dag van het experiment worden gekalibreerd. Voeg twee milliliter mitochondriën-respiratiebuffer met een eindconcentratie van één micromol rotenon toe aan de oxy-kamer, sluit de kamer af en start de registratie van het zuurstofsignaal.

Het door het systeem geregistreerde signaal dat op het computerscherm wordt weergegeven, is proportioneel aan de zuurstofconcentratie in de oxy therm-kamer. Zodra het zuurstofsignaal stabiel is, voegt u 250 µg mitochondria toe en registreert u de basale respiratie gedurende één minuut. De respiratie moet op dit punt zeer laag zijn, aangezien de mitochondria ademen op endogene substraten.

Dit is respiratie toestand één. Voeg succinaat toe tot een eindconcentratie van 5 mM om mitochondriale respiratie bij complex twee te initiëren en registreer het signaal gedurende één minuut. Het zuurstofverbruik zou moeten toenemen tijdens respiratie toestand twee.

Om state-respiratie te induceren, voegt u DP toe tot een eindconcentratie van 150 micromolar. Op dit punt zou het zuurstofverbruik moeten toenemen als gevolg van TP-synthese via oxidatieve fosforylering. Registreer het signaal totdat de respiratie vertraagt, wat duidt op DP-consumptie en de overgang naar de registratie van state-vier-respiratie.

Staat vier, respiratie gedurende ten minste één minuut. Voeg CCCP toe tot een eindconcentratie van 1 µM en registreer het signaal gedurende één minuut. Op dit punt zou de ontkoppelde respiratie maximaal moeten zijn.

Bereken de respiratoire controle ratio door de zuurstofconsumptiesnelheid tijdens state three respiratie te delen door de zuurstofconsumptiesnelheid tijdens state four respiratie; een streefwaarde voor de RCR moet groter zijn dan vier. Induceer vervolgens state three respiratie in een nieuw monster mitochondriën door ADP toe te voegen tot een eindconcentratie van 1 mM om de integriteit van het mitochondriale membraan te beoordelen.

Registreer vervolgens het zuurstofverbruik gedurende één minuut, voeg 10 micromolar cytochroom C toe en registreer het zuurstofverbruik gedurende twee tot drie minuten. Omdat cytochroom C ondoordringbaar is voor intacte mitochondriale membranen in een goede mitochondriale preparatie, zal er geen of slechts een zeer geringe toename in de respiratie optreden. Een toename van de respiratie duidt op gebroken of beschadigde mitochondriale membranen.

De instrumentatie voor de multi-parameter meting van de opening van de mitochondriale permeabiliteitstransitieporie bestaat uit een quantum master dual emission spectrofluorimeter, computergestuurd via het Felix GX-programma. Maak met het Felix GX-programma een multi-detectie acquisitieprotocol aan en voer de parameters in voor de meting van calcium, het mitochondriale membraanpotentiaal en zwelling voor de ratiometrische kleurstoffen Forer en JC-1; genereer de afgeleide sporen voor de Forer-ratio en de JC-1-ratio in een wegwerp vierzijdige meth ACRL vete. Meng 1 mL mitochondria assay buffer met een eindconcentratie van 1 µM rotenon, 5 mM succinaat en 800 nM Forer. Voeg 250 µg mitochondria toe en plaats het monster in het monstercompartiment van de spectrofluorimeter.

Start na één minuut met het registreren van de fluorescentiesignalen, pauzeer de acquisitie, voeg 500 nanomolar JC-1 toe en start vervolgens de acquisitie opnieuw. Het JC-1 ratiosignaal moet toenemen, wat wijst op de opname van de kleurstof door actieve mitochondriën. Ga door met registreren tot het JC-1 signaal een plateau heeft bereikt.

Voeg gewoonlijk binnen vijf minuten calciumchloride toe tot een eindconcentratie van 20 micromolar. Er moet een onmiddellijke toename van het Fluor FF-ratio-signaal zichtbaar zijn, wat duidt op een verhoogde aanwezigheid van calcium in de assaybuffer, gevolgd door een geleidelijke afname door mitochondriale calciumopname. Het JC one-ratio-signaal moet een korte, voorbijgaande afname vertonen, wat wijst op een lichte depolarisatie van het mitochondriale membraan.

Wanneer het ER FF-ratio signaal terugkeert naar het basale niveau, gewoonlijk binnen één tot 1,5 minuut bij een verdere toevoeging van 20 micromolar calciumchloride, wordt het pulseren voortgezet met vaste intervallen totdat de mitochondria geen calcium meer kunnen accumuleren en calcium beginnen af te geven aan de assaybuffer. De opening van de mitochondriale permeabiliteitstransitieporie wordt gevisualiseerd door een gelijktijdige toename van het URA FF-ratio signaal als gevolg van de calciumvrijgave. Een afname in de JC-1 signaalratio als gevolg van het instorten van het membraanpotentiaal en een afname in lichtverstrooiing door mitochondriale zwelling, terwijl mitochondria geïsoleerd zijn van C56 black six J muizen.

Zoals in deze video wordt getoond, werd het zuurstofverbruik vervolgens gemeten tijdens state three-respiratie in aanwezigheid van succinaat en ADP, en tijdens state four-respiratie na ADP-consumptie. Zoals hier te zien is, verhoogt de toevoeging van ADP het zuurstofverbruik door oxidatieve fosforylering, waarna het zuurstofverbruik vertraagt. Zodra alle ADP is verbruikt, wordt de respons van geïsoleerde mitochondriën op ontkoppeling gemeten door de toevoeging van CCCP. In aanwezigheid van CCCP is de snelheid van het zuurstofverbruik hoger dan tijdens state three-respiratie, om zo de membraanintegriteit van de geïsoleerde mitochondriën te beoordelen.

Het zuurstofverbruik werd gemeten in aanwezigheid van succinaat en een DP, en na de toevoeging van cytochroom C. Zoals hier te zien is, verhoogt de toevoeging van cytochroom C het zuurstofverbruik niet significant ten opzichte van een DP en succinaat, wat aangeeft dat intacte mitochondriale membranen niet permeabel zijn voor cytochroom C. Om de mitochondriale permeabiliteitsovergang te beoordelen, werd de mPOP (mitochondrial permeability transition pore opening) in geïsoleerde hartmitochondriën gebruikt als indicator voor de mitochondriale calciumretentiecapaciteit. De mitochondriale permeabiliteitsovergang (mPOP) werd getriggerd door opeenvolgende toevoegingen van 20 micromolar.

Calciumchloride, extra-mitochondriaal calcium en membraanpotentiaal werden gemeten met ratiometrische indicatoren. URA FF is weergegeven als de groene lijn en JC-1 als de rode lijn; zwelling van mitochondria werd gemeten door lichtverstrooiing bij 525 nanometer te registreren, weergegeven door de zwarte lijn. De specificiteit van de JC-1- en zwellingssignalen werden getest met 1 µM CCCP en 5 µg/mL van het microbiële toxine ethin; zoals hier te zien is, gaat calciumopname door mitochondria gepaard met een lichte depolarisatie van het mitochondriale membraan.

Na vier calciumpulsen wordt de opening van de mitochondriale permeabiliteitsovergangspore gezien als een toename in URA FF, wat duidt op calciumvrijgave. Een afname in JC one duidt op het instorten van het membraanpotentiaal en een toename van het volume van de mitochondriale matrix, wat zichtbaar is als een vermindering van de lichtverstrooiing als marker voor zwelling om de specificiteit van de opening van de mitochondriale permeabiliteitsovergangspore te verifiëren. Dezelfde metingen werden uitgevoerd in aanwezigheid van cyclosporine A, dat bindt aan de component cyclofilline D van de mitochondriale permeabiliteitsovergangspore. Zoals in deze figuur wordt getoond, verhoogt de aanwezigheid van één micromolair cyclosporine A het aantal calciumchloridepulsen dat nodig is om de mitochondriale permeabiliteitsovergangspore te openen in vergelijking met het controlemonster.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u de opening van de mitochondriale permeabiliteitsovergangspore beoordeelt in geïsoleerde hartmitochondriën. Het meest uitdagende aspect van deze procedure is het verkrijgen van geïsoleerde mitochondriën van goede kwaliteit. Daarom is het belangrijk om kwaliteitscontrolemetingen uit te voeren voordat de mitochondriën worden gebruikt voor verdere experimenten.