Name: Multi-parameter meting van de doorlatendheid Transitie Pore Openen in Geïsoleerde Muis Heart Mitochondria (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 42 s
Description: Leer een spectrofluorometrisch protocol voor het meten van mitochondriale doorlaatbaarheidstransitie in geïsoleerde muizenhartmitochondriën. Deze methode meet gelijktijdig calcium, membraanpotentiaal en volume.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door HL094536 (BJH).

1. Isolatie van mitochondriën van Mouse Hart <ol><li> Te isoleren hart mitochondriën, verdoven en te offeren muizen volgens de procedures die zijn goedgekeurd door uw lokale Institutionele Animal Care en gebruik Comite. </li></ol> Opmerking: Alle stappen van de mitochondria isolatie-protocol moet worden uitgevoerd op ijs. Gebruik ijskoude buffers en voorgekoeld Petrischalen, Falcon buizen en Eppendorf buizen. De volumes die in het protocol zijn voor een monster dat 2 muis harten. <ol start="2"><li> Harten verwijderen, ze in koud Mitochondria Isolatie buffer (300 mM sucrose, 10 mM Na-HEPES, 200 uM EDTA, pH 7,4) en spoelen bloed. </li></ol> Opmerking: Voor een optimaal resultaat, de pH van mitochondriale buffers dienen te worden aangepast met KOH en azijnzuur. <ol start="3"><li> Plaats harten op een koude petrischaaltje, verwijder vet en atria en gehakt fijn met behulp van een mes tot het verkrijgen vantot instelling van een homogeen product. </li><li> Overdracht gehakt harten in een 50 ml Falcon buis 10 ml Mitochondria Isolatie buffer met 0,1 mg / ml trypsine en laat het monster op ijs gedurende 10 minuten verteren. </li></ol> Opmerking: Trypsine tijdens de isolatieprocedure verhoogt het rendement van geïsoleerde mitochondria en moet constant gehouden tussen mitochondriale preparaten worden. We raden testen mitochondriële functies op geïsoleerde preparaten is de afwezigheid van trypsine te zorgen dat het enzym niet interfereert met functionaliteit. <ol start="5"><li> Voeg 10 ml Mitochondriën Isolatie buffer met 0,1% vetzuur vrij BSA en 5 mg trypsine-remmer (soja) en meng door het buisje om een ​​paar keer naar de trypsine te neutraliseren. </li></ol> Opmerking: Mitochondria Isolation Buffer worden voorbereid en worden bewaard bij -20 ° C. Controleer de pH bij het ​​ontdooien. Trypsine, trypsine inhibitor of BSA moet eenT OEGEVOEGDE de Mitochondria Isolatie Buffer op de dag van het experiment. <ol start="6"><li> Terugwinnen gedigereerd weefsel laag naar medium snelheid centrifugatie gedurende 1 min bij 4 ° C. </li><li> Resuspendeer weefsel in 8 ml Mitochondria Isolatie Buffer met 0,1% vrij vetzuur BSA en homogeniseren met een gemotoriseerde Dounce homogenisator met een Teflon stamper (4-6 passages bij 1,200-14,00 rpm). Houd het monster op ijs onder homogeniseren. </li><li> Breng gelijkmatig verdelen in een 15 ml Falcon buis en centrifugeer bij 800xg gedurende 10 min bij 4 ° C tot pellet kernen en weefselafval. </li><li> Herstel de supernatant die de mitochondria in Eppendorf buizen en centrifugeer bij 8000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. </li><li> Verwijder voorzichtig de bovenste witte laag en was de resterende donkerder pellet met daarin de mitochondriën in 1 ml Mitochondriën Isolatie buffer. </li><li> Centrifugeer bij 8000xg gedurende 15 minuten bij 4 ° C. Gooi supernatant en resuspendeer mitochondria pellet in 150 ui Mitochondriale Isolatie Buffer. Mitochondria houden op ijs voor verdere assays. </li></ol> Opmerking: Voor het beste resultaat tijdens de functionele testen, mitochondriën gebruiken binnen 4 uur van isolatie. <ol start="12"><li> Kwantificeren mitochondriaal eiwit met de Bradford assay. </li></ol> 2. Kwaliteitscontrole van geïsoleerde Mitochondria 2.1. Meting van ademhaling ratio (RCR) <ol><li> Kalibreer de Oxytherm zuurstof elektrode met lucht verzadigde water om de maximale zuurstofopname lijn vast te stellen. Wanneer een stabiel niveau van zuurstof verkregen voeg 100 ul van een vers bereide 10 mM natriumhydrosulfiet oplossing van het zero zuurstof lijn stellen. Voer metingen bij 30 ° C. </li><li> Voeg 2 ml Mitochondria Respiration Buffer (125 mM KCl, 20 mM HEPES, 3 mM MgCl2, 400 uM EGTA, 300 uM DTT, 5 mM KH 2PO 4, pH 7,2) met 1 uM rotenone de Oxytherm kamer, de kamer afdichten en start RECORding. </li><li> Wanneer zuurstof signaal stabiel is, voeg 250 ug mitochondria en basale plaat ademhaling gedurende 1 min. De ademhaling op dit punt moet heel laag als mitochondriën zijn ademende op de endogene substraten (staat 1 ademhaling). </li><li> Voeg 5 mM succinaat en opnemen signaal gedurende 1 minuut. Zuurstofverbruik moet stijgen tijdens het staatsbezoek van twee ademhaling. </li><li> State 3 induceren ademhaling door toevoeging van 150 uM ADP. Op dit punt zuurstofverbruik moet toenemen als gevolg van de ATP-synthese door middel van oxidatieve fosforylering. Record signaal tot ademhaling vertraagt, wat aangeeft ADP verbruik en de overgang naar 4 ademhaling staat. Record State 4 ademhaling ten minste 1 min. </li><li> Voeg 1 uM CCCP en opnemen van signaal gedurende 1 minuut. Ontkoppelde ademhaling moet maximaal zijn. </li></ol> Opmerking: Het effect van CCCP op de mitochondriale ademhaling is dosisafhankelijk: hoge concentraties van CCCP kan zuurstofverbruik remmen en moet daarom zorgvuldig worden titrated. <ol start="7"><li> Bereken de luchtwegen controle ratio (RCR) wordt berekend door zuurstof verbruik tijdens het staatsbezoek van 3 ademhaling door de zuurstof verbruik tijdens het staatsbezoek van 4 ademhaling. Een doel RCR dient ≥ 4. </li></ol> 2.2. Beoordeling van de mitochondriale membraan integriteit (cytochroom c-test) <ol><li> Grondig wassen Oxytherm kamer met 70% ethanol en water en herhaal de stappen 2.1.2 -2.1.4. </li><li> Voeg 1 mM ADP en opnemen van zuurstof verbruik gedurende 1 minuut. </li><li> Voeg 10 uM cytochroom c. Aangezien cytochroom c ondoordringbaar is voor intact membranen, een toename geeft ademhaling gebroken of beschadigde mitochondriale membranen. </li></ol> 3. Meting van de mitochondriale permeabiliteit Transitie porie openend <ol><li> Stel de spectrofluorometer voor de multi-parameter meting van mtPTP opening. Met behulp van de FelixGx programma, maak een nieuwe hardware-configuratie (Quanta meester gestage state) omvattende de lichtbron, excitatie monochromator, monstercompartiment en twee detectors geplaatst op 90 ° en 270 ° ten opzichte van de excitatie monochromator (figuur 4). Om maximale tijdsresolutie te bereiken, moeten zowel emissie monochromatoren (90 ° en 270 °) worden uitgeschakeld en de emissie filters bij 90 ° en 270 ° in de steekproef compartiment ingeschakeld in de hardware configuratie menu. Deze stap verwijdert de motorbesturing van de emissiegolflengten en bevestig elk monochromator bij een bepaalde golflengte. Als de emissie monochromatoren niet zijn uitgeschakeld, zal elke detector cyclus tussen beide golflengten en dubbele metingen zullen worden opgenomen. </li><li> Maak een nieuwe aanwinst protocol met behulp van de Multi Dye en voer de volgende kleurstoffen: <ul><li> Fura (hoog Ca + +): excitatie 340 nm, emissie 525 nm (detector 1) </li><li> Fura (laag Ca + +): excitatie 380 nm, emissie 525 nm (detector 1) </li><li> JC1 (totaal): excitatie 543 nm, Emissie 595 nm (detector 2) </li><li> JC1 (monomeer): excitatie 498 nm, emissie 525 nm (detector 1) </li><li> Zwelling: excitatie 525 nm, emissie 525 nm (detector 1) </li></ul></li><li> Stel de excitatie en emissie spleten tot 1 nm en de temperatuur tot 37 ° C. </li><li> De ratiometrische signaal Fura en JC-1 te verkrijgen, genereren twee afgeleide sporen: Fura (hoog Ca + +) / Fura (laag Ca + +) en JC1 (totaal) / JC1 (monomeer). </li><li> Handmatig de emissiegolflengte van detectoren 1 en 2 525 nm en 595 nm respectievelijk. </li><li> Meng 1 ml Mitochondria Assay Buffer (120 mM KCl, 10 mM NaCl, 1 mM KH 2PO 4, 20 mM HEPES-Tris, pH 7,2) met 1 uM rotenon, 5 mM succinaat en 800 nM Fura FF in een wegwerp 4-zijdige methacrylaat cuvette. Voeg 250 mg mitochondriën en plaats monster in het monster compartiment. Ervoor zorgen dat de magnetische roerder aangezet. </li><li> Start de opname. Na 1 min, de overname pauzeren, voeg 500 nM JC-1 en start de eencquisition. De JC-1-ratio-signaal moeten toenemen, wat aangeeft kleurstof opname door actieve mitochondriën. Opnemen totdat JC-1 signaal heeft een plateau bereikt (gewoonlijk binnen 5 min). </li><li> Voeg 20 uM CaCl2. Een instantane toename in Fura FF verhoudingssignaal opgemerkt door de verhoogde Ca 2 + aanwezigheid in de assay buffer, gevolgd door een geleidelijke daling door mitochondriale Ca2 + opname. De JC-1 ratio signaal moet vertonen een korte voorbijgaande daling wijst op een lichte mitochondriale membraan depolarisatie. </li><li> Wacht tot Fura FF verhoudingssignaal terug naar het basale niveau voorafgaand aan toevoeging van een CaCl2 puls (1-1,5 min). Verder pulseren op vaste intervallen mitochondriën niet kan ophopen Ca 2 + en beginnen los Ca 2 + in de assay buffer. mtPTP opening gevisualiseerd met een gelijktijdige toename in het Fura FF verhoudingssignaal door Ca2 + afgifte, een daling van het JC-1 signaalverhouding door membraan potential instorting, en een afname van de lichtverstrooiing te wijten aan mitochondriale zwelling (figuur 5). </li><li> Na activatie mtPTP respectievelijk controleert de specificiteit van Fura FF, JC-1 en zwelling signalen met 1 mM EGTA, 1 uM CCCP en 5 ug / ml alamethicin. </li><li> Om specificiteit van mtPTP opening controleren stappen herhaalt 3,6 - 3,9 in aanwezigheid van 1 uM van de cyclofiline D inhibitor cyclosporine A (cyclofiline D is een onderdeel van de mtPTP). In aanwezigheid van cyclosporine A, opening van de mtPTP vraagt ​​aanzienlijk meer CaCl 2 pulsen dan controlemonsters (Figuur 6). </li></ol> 4. Representatieve resultaten Figuur 2 toont een typische ademhaling geïsoleerde muizenhart mitochondria. State 3 ademhaling door toevoeging van ADP aan mitochondria ademende op succinaat, en wordt gekenmerkt door significant verhoogd zuurstofverbruik met betrekking tot de Hydrote alleen. Uitputting van toegevoegde ADP ingewijden State 4 ademhaling, waarbij zuurstofverbruik vertraagt ​​en is vergelijkbaar met tarieven voor behaald aan ADP toevoeging. RCR wordt verkregen door het zuurstofverbruik tarief voor Provincie 3 ademhaling door die van State 4 ademhaling. Het cytochroom c test wordt gebruikt om de assay voor de buitenste mitochondriale membraan: wanneer cytochroom c wordt toegevoegd aan mitochondria ademende op succinaat en ADP, geen verdere toename waargenomen ademhaling, geeft een intact buitenste membranen (Figuur 3). Een vertegenwoordiger voor de mtPTP opening in geïsoleerde hart mitochondria is weergegeven in figuur 4. In dit geval mtPTP opening werd veroorzaakt door de toevoeging van 4 CaCl2 pulsen (20 pM elk) van 1,5 min intervallen. mtPTP opening is duidelijk door de nabije gelijktijdige release van mitochondriale Ca 2 + (toename van de Fura FF verhouding signaal), ineenstorting van mitochondRial membraanpotentiaal (afname van de JC-1 ratio-signaal) en verhoogde mitochondriale volume (afname van de zwelling signaal). Wanneer cyclosporine A wordt toegevoegd, dat bindt aan het cyclofiline D component van mtPTP, mtPTP opengesteld 7 pulsen van CaCl2 in plaats van 4 (figuur 5). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig1.jpg" /> Figuur 1. Stroomschema van de multi-parameter mitochondriale permeabiliteit transitie porie opening protocol voor geïsoleerde hart mitochondria. Hart wordt gewonnen uit muizen en mitochondriën zijn geïsoleerd door middel van differentiële centrifugatie. De mitochondriale preparaat wordt vervolgens kwalitatief geëvalueerd door meting van de polarografische ademhaling verhouding en mitochondriale membraan intact in de aanwezigheid van cytochroom c. Mitochondriale permeabiliteit transitie porie opening in geïsoleerde mitochondria wordt geactiveerd door sequentiële CaCl 2 toevoegingen en wordt gemeten met een spectrofluorometer door het bewaken van Ca 2 + release van mitochondriën, membraanpotentiaal instorting en zwelling van de mitochondriale matrix. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig2.jpg" /> Figuur 2. Meting van ademhaling ratio (RCR) van geïsoleerde hart mitochondriën. Zuurstofverbruik door geïsoleerde hart mitochondria wordt tijdens State 3 ademhaling in aanwezigheid van ADP en succinaat en tijdens State 4 ademhaling na ADP consumptie. De reactie van geïsoleerde mitochondriën ontkoppelrails wordt gemeten door de toevoeging van CCCP. Getallen in de grafiek zijn de percentages van zuurstofverbruik door geïsoleerde mitochondriën in nmol / min / mg eiwit. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig3.jpg" /> Figuur 3. Meet<html> ling van membraan integriteit van geïsoleerde hart mitochondriën. Mitochondriale membraan integriteit wordt bepaald door zuurstofverbruik in mitochondria die in aanwezigheid van ADP en succinaat en na toevoeging van cytochroom c. Getallen in de grafiek zijn de percentages van zuurstofverbruik door geïsoleerde mitochondriën in nmol / min / mg eiwit. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig4.jpg" /> Figuur 4. Spectrofluorometer hardwareconfiguratie voor de multi-parameter meting van mtPTP opening. De hardwareconfiguratie van de spectrofluorometer omvat een lichtbron, een excitatie monochromator, een monstercompartiment en twee detectoren met vaste emissiegolflengte bij 525 nm en 595 nm. Detector 1 wordt gebruikt voor de signaaldetectie van Fura FF hoge en lage Ca 2 +, JC-1 monomeer en de zwelling signaal. Detector 2 meet de JC-1 aggregaat signaal. jove_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig5.jpg" /> Figuur 5. Multi-parameter meting van mtPTP opening in geïsoleerde hart mitochondriën. mtPTP opening werd veroorzaakt door opeenvolgende toevoegingen van 20 uM CaCl 2 en werd gekenmerkt door Ca 2 + release van mitochondriën, mitochondriale membraanpotentiaal instorting en een verhoogde mitochondriale matrix volume (zwelling). Extramitochondrial Ca 2 + en membraanpotentiaal werd gemeten met de ratiometrische indicatoren Fura FF (groen trace) en JC-1 (rood trace). Zwelling van mitochondriën werd gemeten door lichtverstrooiing bij 525 nm (zwart spoor). Specificiteit van JC-1 en zwelling signalen werd getest met 1 uM CCCP en 5 ug / ml alamethicin (een microbieel toxine). <img alt="Figuur 6" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig6.jpg" /> Figuur 6. Multi-Parameter meting van mtPTP opening in geïsoleerde hart mitochondria in aanwezigheid van cyclosporine A. Cyclosporine A (1 uM) verhoogt het aantal pulsen CaCl2 moeten mtPTP openen in geïsoleerde hart mitochondria.

<ol><li>Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Membrane+Permeabilization+in+Cell+Death%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Membrane Permeabilization in Cell Death.</a> Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).</li>
<li>Elrod, J., Wong, R., Mishra, S., Vagnozzi, R. J., Sakthievel, B., Goonasekera, S. A., Karch, J., Gabel, S., Farber, J., Force, T., Brown, J. H., Murphy, E., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclophilin+D+controls+mitochondrial+pore-dependent+Ca2%2B+exchange%2C+metabolic+flexibility%2C+and+propensity+for+heart+failure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca2+ exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice.</a> J. Clin. Invest. 120, 3680-3687 (2010).</li>
<li>Hom, J. R., Quintanilla, R. A., Hoffman, D. L., de Mesy Bentley, K. L., Molkentin, J. D., Sheu, S. S., Porter, G. A. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+permeability+transition+pore+controls+cardiac+mitochondrial+maturation+and+myocyte%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte.</a> 21, 469-478 (2011).</li>
<li>Halestrap, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+mitochondrial+permeability+transition+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">What is the mitochondrial permeability transition pore.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46, 821-831 (2009).</li>
<li>Wei, A. C., Liu, T., Cortassa, S., Winslow, R. L., O'Rourke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Ca2%2B+influx+and+efflux+rates+in+guinea+pig+cardiac+mitochondria%3A+low+and+high+affinity+effects+of+cyclosporine+A%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Ca2+ influx and efflux rates in guinea pig cardiac mitochondria: low and high affinity effects of cyclosporine A.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1813, 1373-1381 (2011).</li>
<li>Saks, V. A., Kuznetsov, A. V., Kupriyanov, V. V., Miceli, M. V., Jacobus, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creatine+kinase+of+rat+heart+mitochondria.+The+demonstration+of+functional+coupling+to+oxidative+phosphorylation+in+an+inner+membrane-matrix+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Creatine kinase of rat heart mitochondria. The demonstration of functional coupling to oxidative phosphorylation in an inner membrane-matrix preparation.</a> J. Biol. Chem. 260, 7757-7764 (1985).</li>
<li>Boehm, E. A., Jones, B. E., Radda, G. K., Veech, R. L., Clarke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+uncoupling+proteins+and+decreased+efficiency+in+palmitate-perfused+hyperthyroid+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22AJP+-+Heart%22%5BJournal%5D)">Increased uncoupling proteins and decreased efficiency in palmitate-perfused hyperthyroid rat heart.</a> AJP - Heart. 280, 977-983 (2001).</li>
<li>Fontaine, E., Eriksson, O., Ichas, F., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+Permeability+Transition+Pore+in+Skeletal+Muscle+Mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of the Permeability Transition Pore in Skeletal Muscle Mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 273, 12662-12668 (1998).</li>
<li>Berman, S. B., Watkins, S. C., Hastings, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+biochemical+and+ultrastructural+comparison+of+mitochondrial+permeability+transition+in+isolated+brain+and+liver+mitochondria%3A+evidence+for+reduced+sensitivity+of+brain+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Quantitative biochemical and ultrastructural comparison of mitochondrial permeability transition in isolated brain and liver mitochondria: evidence for reduced sensitivity of brain mitochondria.</a> Exp. Neurol. 164, 415-425 (2000).</li>
<li>Panov, A., Dikalov, S., Shalbuyeva, N., Hemendinger, R., Greenamyre, J. T., Rosenfeld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-+and+tissue-specific+relationships+between+mitochondrial+permeability+transition+and+generation+of+ROS+in+brain+and+liver+mitochondria+of+rats+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Species- and tissue-specific relationships between mitochondrial permeability transition and generation of ROS in brain and liver mitochondria of rats and mice.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 292, 708-718 (2007).</li>
<li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+isolation%3A+functional+mitochondria+from+mouse+liver%2C+muscle+and+cultured+filroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured filroblasts.</a> Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).</li>
<li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De hier gepresenteerde protocol beschrijft de benodigde experimentele stappen permeabiliteit transitie porie opening beoordelen geïsoleerde hart mitochondria (figuur 1 en figuur 4): de werkwijze voor het isoleren muizenhart mitochondria, de luchtwegen controles die de integriteit en functionaliteit, de mitochondriale parameters gecontroleerd tijdens mtPTP opening en de kleurstoffen gebruikt voor de meting, het opzetten van de spectrofluorimetrische instrumentatie, en de karakterisering ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> Trypsine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T3030 </td></tr><tr><td> Trypsineremmer (soja) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9128 </td></tr><tr><td> Natriumhydrosulfiet </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 71699 </td></tr><tr><td> Rotenon </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R8875 </td></tr><tr><td> Cytochroom c </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7752 </td></tr><tr><td> Alamethicin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4665 </td></tr><tr><td> CCCP </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C2759 </td></tr><tr><td> Cyclosporine A </td><td> Calbiochem </td><td> 239835 </td></tr><tr><td> Fura FF </td><td> Invitrogen </td><td> F14180 </td></tr><tr> &lt;td&gt; JC-1 </td><td> Invitrogen </td><td> T3168 </td></tr><tr><td> Tissue grinder Potter-Elvehjem met Teflon stamper 15 ml </td><td> Wheaton Industries </td><td></td></tr><tr><td> Overhead roerder </td><td> Wheaton Industries </td><td> 903475 </td></tr><tr><td> Oxytherm (temperatuurgestuurde zuurstofelektrode) </td><td> Hansatech Instrumenten </td><td></td></tr><tr><td> QuantaMaster 80 dual-emissie spectrofluorometer </td><td> Photon Technology International, Inc </td><td></td></tr></tbody></table>

multi-parameter meting van de doorlatendheid transitie pore openen in geïsoleerde muis heart mitochondria

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

De mitochondriale permeabiliteit transitie poriën (mtPTP) is een niet specifiek kanaal vormt in het binnenste mitochondriale membraan opgeloste stoffen transport met een moleculaire massa kleiner dan 1,5 kDa. Hoewel de definitieve moleculaire identiteit van de porie nog steeds ter discussie, eiwitten zoals cyclofiline D, VDAC en ANT bijdragen aan de vorming mtPTP. Hoewel de betrokkenheid van mtPTP opening in celdood is goed ingeburgerd 1, accumuleren gegevens blijkt dat het mtPTP een fysiologische rol dient tijdens mitochondriale Ca2 + homeostase 2, bio-energetica en redox signalering 3. mtPTP opening wordt geactiveerd door matrix Ca 2 +, maar de activiteit kan gemoduleerd worden door verschillende factoren zoals oxidatieve stress, adenine nucleotide uitputting hoge concentraties Pi, mitochondriale membraan depolarisatie of ontkoppelen en lange vetzuurketens 4. In vitro, mtPTP opening kan achieved door meer Ca2 + concentratie in de mitochondriale matrix door exogene toevoeging van Ca 2 + (calcium retentievermogen). Wanneer Ca 2 + niveaus binnen mitochondria bereiken van een bepaalde drempel, de mtPTP opent en faciliteert Ca 2 + release, dissipatie van het proton beweging veroorzakende kracht, membraanpotentiaal ineenstorting en een toename van de mitochondriale matrix volume (zwelling), die uiteindelijk leidt tot de breuk van de buitenste mitochondriale membraan en onomkeerbaar verlies van organellen functie. Hier beschrijven we een fluorometrische assay waarmee een uitgebreide karakterisering van mtPTP opening in geïsoleerde muizenhart mitochondria. De bepaling omvat de gelijktijdige meting van drie mitochondriale parameters die gewijzigd wanneer mtPTP opening plaatsvindt: mitochondrial Ca 2 + handling (opname en afgifte, zoals gemeten door Ca2 + concentratie in het testmedium), mitochondriale membraanpotentiaal en mitochondrial volume. De kleurstoffen toegepast voor Ca 2 + meting in het testmedium en mitochondriale membraanpotentiaal zijn Fura FF, een membraan impermeant, ratiometrisch indicator die een verschuiving in de golflengte in aanwezigheid van Ca 2 +, en JC-1, een kationische ondergaat, ratiometrische indicator die groen of rood monomeren aggregaten vormt bij lage en hoge membraanpotentiaal respectievelijk. Veranderingen in de mitochondriale volume worden gemeten door lichtverstrooiing door de mitochondriale schorsing. Sinds hoogwaardige, functionele mitochondriën nodig zijn voor de mtPTP opening test, hebben we ook een beschrijving van de stappen die nodig zijn voor het verkrijgen intact, zeer gekoppeld en functionele geïsoleerde hart mitochondriën.

Een spectrofluorimetrische protocol voor het meten van de mitochondriale permeabiliteit transitie porie opening in geïsoleerde muizenhart mitochondria wordt hier gepresenteerd. De bepaling omvat de gelijktijdige meting van Ca mitochondria<sup&gt; 2 +</sup&gt; Handling, mitochondriale membraanpotentiaal en mitochondriale volume. De procedure voor het verkrijgen van hoge kwaliteit en functionele hart mitochondria wordt ook beschreven.

Multi-parameter meting van de doorlatendheid Transitie Pore Openen in Geïsoleerde Muis Heart Mitochondria

De mitochondriale permeabiliteitsovergangspore (mtPTP) is een aspecifiek kanaal dat zich vormt in het binnenste mitochondriale membraan om opgeloste stoffen te transporteren met ...

Het doel van deze video is om een procedure te beschrijven voor het karakteriseren van de mitochondriële permeabiliteitsovergang. Gebrekkige opening in mitochondria, geïsoleerd uit muizenhart. Ten eerste worden de mitochondria uit muizenharten geïsoleerd.Met de methode van differentiële centrifugatie wordt de kwaliteit van de geïsoleerde mitochondriën vervolgens beoordeeld met een thermische zuurstofelektrode die is aangesloten op een computer om de respiratoire controle-ratio te meten en de integriteit van het mitochondriale membraan te evalueren. Vervolgens wordt met spectrofluorimetrische instrumentatie gelijktijdige meting van de calciumhuishouding, het mitochondriale membraanpotentieel en het mitochondriale volume gebruikt om de permeabiliteitstransitieporie-opening te bepalen.De resulterende gegevens toonden verschillen in het calciumretentievermogen en de mitochondriale permeabiliteitstransitie. Een geringe sensitiviteit van geïsoleerde mitochondriën en de opening van de mitochondriale permeabiliteitstransitieporie is een complex fenomeen dat veranderingen op verschillende niveaus in de mitochondriale fysiologie en anatomie omvat.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat de gelijktijdige meting van meerdere parameters een vollediger beeld van het fenomeen geeft dan de meting van individuele parameters alleen, zoals calcium, mobilisatie of zwelling. Ontdooi vóór aanvang van de procedure de mitochondriën-isolatiebuffer en controleer de pH, welke 7.4 moet zijn. Plaats vervolgens alle buffers, schaaltjes en buisjes die gebruikt zullen worden op ijs. Let op dat alle stappen van het mitochondriën-isolatieprotocol op ijs moeten worden uitgevoerd.Plaats de harten van geëuthanaseerde muizen in een Petrischaal en spoel eventueel bloed weg met koud mitochondriaal isolatiebuffer. Verplaats de harten vervolgens met een scalpel naar een nieuwe Petrischaal, verwijder het vet en de atria, en hak de harten vervolgens fijn tot er een homogeen product is verkregen.Breng de fijngehakte harten over naar een conische buis van 50 milliliter. Voeg 10 milliliter mitochondria-isolatiebuffer met 0,1 milligram per milliliter trypsine toe en laat het monster 10 minuten op ijs verteren. Let op dat het gebruik van trypsine de opbrengst van geïsoleerde mitochondria verhoogt en constant gehouden moet worden tussen verschillende mitochondria-preparaties.Wij raden echter aan om de functionaliteit van geïsoleerde mitochondriën te testen op preparaten die zijn verkregen zonder trypsine, om er zeker van te zijn dat het enzym de ionen niet beïnvloedt. Voeg na de incubatie 10 milliliters mitochondriën-isolatiebuffer toe met 0,1% vetzuurvrije BS, a, en vijf milligram trypsineremmer en meng door de buis enkele keren om te keren. Om de trypsine te neutraliseren, wordt het verteerde weefsel teruggewonnen door centrifugatie gedurende één minuut bij vier graden Celsius op lage tot gemiddelde snelheid.Resuspendeer na het centrifugeren het weefsel in acht milliliter mitochondriën-isolatiebuffer met 0,1% vetzuurvrije BSA, terwijl het monster op ijs wordt bewaard. Gebruik een gemotoriseerde Dounce-homogenisator met een Teflon stamper om het monster te homogeniseren met vier tot zes passages bij 1.200 tot 1.400 RPM. Breng het homogenaat over naar een conische buis van 15 milliliter en centrifugeer dit bij 800 ×g gedurende 10 minuten bij 4 °C.Om de kernen en weefselresten te pelletteren. Breng na het centrifugeren het supernatant met de mitochondriën over in microcentrifugebuisjes en centrifugeer deze bij 8, 000 ×g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Na het centrifugeren bevindt zich een witte laag bovenop de pellet.Gebruik een vacuümsysteem om de witte laag bovenop het mitochondriële pellet voorzichtig af te zuigen en te verwijderen. Resuspendeer vervolgens het resterende donkerdere pellet, dat de mitochondriën bevat, in één milliliter mitochondriën-isolatiebuffer.Centrifugeer de mitochondriën vervolgens bij 8,000 ×g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de mitochondriële pellet in 150 µL mitochondriën-isolatiebuffer; bewaar de mitochondriën op ijs.De respiratie van geïsoleerde mitochondriën wordt gemeten met een oxy thermische zuurstofelektrode die is aangesloten op een computer en wordt aangestuurd door de Oxy Plus-software; de zuurstofelektrode moet op de dag van het experiment worden gekalibreerd. Voeg twee milliliter mitochondriën-respiratiebuffer met een eindconcentratie van één micromol rotenon toe aan de oxy-kamer, sluit de kamer af en start de registratie van het zuurstofsignaal.Het door het systeem geregistreerde signaal dat op het computerscherm wordt weergegeven, is proportioneel aan de zuurstofconcentratie in de oxy therm-kamer. Zodra het zuurstofsignaal stabiel is, voegt u 250 µg mitochondria toe en registreert u de basale respiratie gedurende één minuut. De respiratie moet op dit punt zeer laag zijn, aangezien de mitochondria ademen op endogene substraten.Dit is respiratie toestand één. Voeg succinaat toe tot een eindconcentratie van 5 mM om mitochondriale respiratie bij complex twee te initiëren en registreer het signaal gedurende één minuut. Het zuurstofverbruik zou moeten toenemen tijdens respiratie toestand twee.Om state-respiratie te induceren, voegt u DP toe tot een eindconcentratie van 150 micromolar. Op dit punt zou het zuurstofverbruik moeten toenemen als gevolg van TP-synthese via oxidatieve fosforylering. Registreer het signaal totdat de respiratie vertraagt, wat duidt op DP-consumptie en de overgang naar de registratie van state-vier-respiratie.Staat vier, respiratie gedurende ten minste één minuut. Voeg CCCP toe tot een eindconcentratie van 1 µM en registreer het signaal gedurende één minuut. Op dit punt zou de ontkoppelde respiratie maximaal moeten zijn.Bereken de respiratoire controle ratio door de zuurstofconsumptiesnelheid tijdens state three respiratie te delen door de zuurstofconsumptiesnelheid tijdens state four respiratie; een streefwaarde voor de RCR moet groter zijn dan vier. Induceer vervolgens state three respiratie in een nieuw monster mitochondriën door ADP toe te voegen tot een eindconcentratie van 1 mM om de integriteit van het mitochondriale membraan te beoordelen.Registreer vervolgens het zuurstofverbruik gedurende één minuut, voeg 10 micromolar cytochroom C toe en registreer het zuurstofverbruik gedurende twee tot drie minuten. Omdat cytochroom C ondoordringbaar is voor intacte mitochondriale membranen in een goede mitochondriale preparatie, zal er geen of slechts een zeer geringe toename in de respiratie optreden. Een toename van de respiratie duidt op gebroken of beschadigde mitochondriale membranen.De instrumentatie voor de multi-parameter meting van de opening van de mitochondriale permeabiliteitstransitieporie bestaat uit een quantum master dual emission spectrofluorimeter, computergestuurd via het Felix GX-programma. Maak met het Felix GX-programma een multi-detectie acquisitieprotocol aan en voer de parameters in voor de meting van calcium, het mitochondriale membraanpotentiaal en zwelling voor de ratiometrische kleurstoffen Forer en JC-1; genereer de afgeleide sporen voor de Forer-ratio en de JC-1-ratio in een wegwerp vierzijdige meth ACRL vete. Meng 1 mL mitochondria assay buffer met een eindconcentratie van 1 µM rotenon, 5 mM succinaat en 800 nM Forer. Voeg 250 µg mitochondria toe en plaats het monster in het monstercompartiment van de spectrofluorimeter.Start na één minuut met het registreren van de fluorescentiesignalen, pauzeer de acquisitie, voeg 500 nanomolar JC-1 toe en start vervolgens de acquisitie opnieuw. Het JC-1 ratiosignaal moet toenemen, wat wijst op de opname van de kleurstof door actieve mitochondriën. Ga door met registreren tot het JC-1 signaal een plateau heeft bereikt.Voeg gewoonlijk binnen vijf minuten calciumchloride toe tot een eindconcentratie van 20 micromolar. Er moet een onmiddellijke toename van het Fluor FF-ratio-signaal zichtbaar zijn, wat duidt op een verhoogde aanwezigheid van calcium in de assaybuffer, gevolgd door een geleidelijke afname door mitochondriale calciumopname. Het JC one-ratio-signaal moet een korte, voorbijgaande afname vertonen, wat wijst op een lichte depolarisatie van het mitochondriale membraan.Wanneer het ER FF-ratio signaal terugkeert naar het basale niveau, gewoonlijk binnen één tot 1,5 minuut bij een verdere toevoeging van 20 micromolar calciumchloride, wordt het pulseren voortgezet met vaste intervallen totdat de mitochondria geen calcium meer kunnen accumuleren en calcium beginnen af te geven aan de assaybuffer. De opening van de mitochondriale permeabiliteitstransitieporie wordt gevisualiseerd door een gelijktijdige toename van het URA FF-ratio signaal als gevolg van de calciumvrijgave. Een afname in de JC-1 signaalratio als gevolg van het instorten van het membraanpotentiaal en een afname in lichtverstrooiing door mitochondriale zwelling, terwijl mitochondria geïsoleerd zijn van C56 black six J muizen.Zoals in deze video wordt getoond, werd het zuurstofverbruik vervolgens gemeten tijdens state three-respiratie in aanwezigheid van succinaat en ADP, en tijdens state four-respiratie na ADP-consumptie. Zoals hier te zien is, verhoogt de toevoeging van ADP het zuurstofverbruik door oxidatieve fosforylering, waarna het zuurstofverbruik vertraagt. Zodra alle ADP is verbruikt, wordt de respons van geïsoleerde mitochondriën op ontkoppeling gemeten door de toevoeging van CCCP. In aanwezigheid van CCCP is de snelheid van het zuurstofverbruik hoger dan tijdens state three-respiratie, om zo de membraanintegriteit van de geïsoleerde mitochondriën te beoordelen.Het zuurstofverbruik werd gemeten in aanwezigheid van succinaat en een DP, en na de toevoeging van cytochroom C. Zoals hier te zien is, verhoogt de toevoeging van cytochroom C het zuurstofverbruik niet significant ten opzichte van een DP en succinaat, wat aangeeft dat intacte mitochondriale membranen niet permeabel zijn voor cytochroom C. Om de mitochondriale permeabiliteitsovergang te beoordelen, werd de mPOP (mitochondrial permeability transition pore opening) in geïsoleerde hartmitochondriën gebruikt als indicator voor de mitochondriale calciumretentiecapaciteit. De mitochondriale permeabiliteitsovergang (mPOP) werd getriggerd door opeenvolgende toevoegingen van 20 micromolar.Calciumchloride, extra-mitochondriaal calcium en membraanpotentiaal werden gemeten met ratiometrische indicatoren. URA FF is weergegeven als de groene lijn en JC-1 als de rode lijn; zwelling van mitochondria werd gemeten door lichtverstrooiing bij 525 nanometer te registreren, weergegeven door de zwarte lijn. De specificiteit van de JC-1- en zwellingssignalen werden getest met 1 µM CCCP en 5 µg/mL van het microbiële toxine ethin; zoals hier te zien is, gaat calciumopname door mitochondria gepaard met een lichte depolarisatie van het mitochondriale membraan.Na vier calciumpulsen wordt de opening van de mitochondriale permeabiliteitsovergangspore gezien als een toename in URA FF, wat duidt op calciumvrijgave. Een afname in JC one duidt op het instorten van het membraanpotentiaal en een toename van het volume van de mitochondriale matrix, wat zichtbaar is als een vermindering van de lichtverstrooiing als marker voor zwelling om de specificiteit van de opening van de mitochondriale permeabiliteitsovergangspore te verifiëren. Dezelfde metingen werden uitgevoerd in aanwezigheid van cyclosporine A, dat bindt aan de component cyclofilline D van de mitochondriale permeabiliteitsovergangspore. Zoals in deze figuur wordt getoond, verhoogt de aanwezigheid van één micromolair cyclosporine A het aantal calciumchloridepulsen dat nodig is om de mitochondriale permeabiliteitsovergangspore te openen in vergelijking met het controlemonster.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u de opening van de mitochondriale permeabiliteitsovergangspore beoordeelt in geïsoleerde hartmitochondriën. Het meest uitdagende aspect van deze procedure is het verkrijgen van geïsoleerde mitochondriën van goede kwaliteit. Daarom is het belangrijk om kwaliteitscontrolemetingen uit te voeren voordat de mitochondriën worden gebruikt voor verdere experimenten.

multi-parameter-measurement-permeability-transition-pore-opening

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Vergelijking van het mitochondriale membraanpotentieel tussen monsters levert waardevolle informatie op over de cellulaire status. Gedetailleerde stappen voor het isoleren van mitochondriën en het beoordelen van de respons op remmers en ontkoppelaars met behulp van fluorescentie worden beschreven. De methode en het nut van dit protocol worden geïllustreerd door het gebruik van een celcultuur en een diermodel van cellulaire stress.

Isolatie en functionele analyse van Mitochondriën uit gekweekte cellen en muis Tissue

Mitochondriën kan de elektrochemische potentiaal over hun binnenste membraan (Δ Ψm) te gebruiken om calcium sekwestreren (Ca 2+), waardoor ze vorm te geven cytosolische Ca 2+ het signaleren binnen de cel. We beschrijven een werkwijze voor het gelijktijdig meten van mitochondriën Ca2 + opname en ΔΨ m in levende cellen met fluorescerende kleurstoffen en confocale microscopie.

Gelijktijdige meting van mitochondriale calcium en mitochondriale membraan potentieel in levende cellen door fluorescentie microscopie

Hier presenteren we twee protocollen voor het meten van mitochondriale Ca2 + toestroom in geïsoleerde mitochondriën en gekweekte cellen. Voor geïsoleerde mitochondriën, detailleren wij een plaat lezer gebaseerde Ca2 + import assay met behulp van de Ca2 + gevoelige kleurstof calcium groen-5N. Voor gekweekte cellen beschrijven we een methode van de confocal microscopie met behulp van de Ca2 + kleurstof Rhod-2/AM.

Analyses van mitochondriale Calcium toestroom in geïsoleerde Mitochondria en gekweekte cellen

Hier presenteren we een protocol dat gebruikmaakt van JC-1 kleurstof te beoordelen van de Mitochondriale membraanpotentiaal van cellen na wordt blootgesteld aan hypoxie/heroxygenatie met of zonder een beschermende agent.

Een stroom Cytometry gebaseerde Assay voor het meten van de Mitochondriale membraanpotentiaal in cardiale Myocytes na Hypoxia/heroxygenatie

Hier gedemonstreerd zijn protocollen voor het isoleren van (1) vers intact cerebrale endothelial "buizen" en (2) gelijktijdige metingen van endothelial calcium en membraanpotentiaal tijdens endotheel afkomstige hyperpolarisatie. Verder, deze methoden toestaan voor farmacologische tuning van endothelial cel calcium en elektrische signalering als individuele of interactieve experimentele variabelen.

Gelijktijdige metingen van intracellulair Calcium en membraanpotentiaal in vers geïsoleerd en Intact muis cerebrale endotheel

In dit werk beschrijven we een aangepast protocol om mitochondriale respiratoire substraatflux te testen met behulp van recombinant perfringolysine O in combinatie met respirometrie op basis van microplaten. Met dit protocol laten we zien hoe metformine de mitochondriale ademhaling van twee verschillende tumorcellijnen beïnvloedt.

Meten van mitochondriale substraatflux in recombinante perfringolysine O-permeabiliseerde cellen

We beschrijven een experimentele opstelling voor het toedienen van hyperpolarized 13C-gelabelde metabolieten in continue perfusiemodus aan een geïsoleerd geperfuseerd muizenhart. Een speciale 13C-NMR-acquisitiebenadering maakte de kwantificering van metabole enzymactiviteit in realtime mogelijk, en een multiparametrische 31P-NMR-analyse maakte de bepaling van het atp-gehalte en de pH van het weefsel mogelijk.

Onderzoek naar hartmetabolisme in het geïsoleerde geperfuseerde muizenhart met hyperpolarisatie [1-13 C] pyruvaat en 13C / 31P NMR-spectroscopie

Deze methode maakt gebruik van de bijdrage van de mitochondriale permeabiliteitstransitieporie aan protonlek met lage geleiding om de spanningsdrempel voor porieopening te bepalen bij neonatale fragiele X-syndroommuizen met een verhoogd cardiomyocyt mitochondriaal co-enzym Q-gehalte in vergelijking met wildtypecontrole.

Beoordeling van de open waarschijnlijkheid van de mitochondriale permeabiliteitstransitieporie in de setting van co-enzym Q-overmaat

Dit protocol beschrijft een vergelijkende test, met behulp van mitochondriale complexe activiteiten CI+CIII en CII+CIII in de aan- of afwezigheid van Na+, om het bestaan van gedeeltelijk gesegmenteerde functionele CoQ-pools te bestuderen.

Interne mitochondriale membraangevoeligheid voor Na + onthult gedeeltelijk gesegmenteerde functionele CoQ-pools

Hier beschrijven we een uitgebreide methode voor het meten van mitochondriale oxidatieve fosforylering in verse gepermeabiliseerde skeletspiervezels van menselijke of muizenspieren. Deze methode maakt de real-time kwantificering van de mitochondriale ademhaling en de beoordeling van brandstofvoorkeur en metabole flexibiliteit mogelijk, met behoud van bestaande mitochondriale netwerken en membraanintegriteit.

Meting van mitochondriale ademhaling in skeletspiervezels van mens en muis door middel van respirometrie met hoge resolutie

Leer een spectrofluorometrisch protocol voor het meten van mitochondriale doorlaatbaarheidstransitie in geïsoleerde muizenhartmitochondriën. Deze methode meet gelijktijdig calcium, membraanpotentiaal en volume.

Multi-parameter meting van de doorlatendheid Transitie Pore Openen in Geïsoleerde Muis Heart Mitochondria

Meer video's verkennen