Multi-parameter meting van de doorlatendheid Transitie Pore Openen in Geïsoleerde Muis Heart Mitochondria

Het doel van deze video is om een procedure te beschrijven voor het karakteriseren van de mitochondriale permeabiliteitstransitie. Slechte opening in mitochondriën, geïsoleerd uit muizenharten. Eerst worden mitochondriën geïsoleerd uit muizenharten.

Met behulp van de differentiële centrifugatiemethode wordt vervolgens de kwaliteit van de geïsoleerde mitochondriën beoordeeld met behulp van een oxythermische zuurstofelektrode die op een computer is aangesloten om de respiratoire controleverhouding te meten en de integriteit van de mitochondriale membraan te evalueren. Vervolgens worden met behulp van spectrofluorometrische instrumenten gelijktijdige metingen van calciumbehandeling, mitochondriaal membraanpotentieel en mitochondriaal volume gebruikt om de permeabiliteitstransitie te bepalen. Slechte opening.

De resulterende gegevens toonden verschillen in de calciumretentiecapaciteit en mitochondriale permeabiliteitstransitie. Slechte gevoeligheid van geïsoleerde mitochondriën, Opening van de mitochondriale permeabiliteitstransitie. Pore is een complex fenomeen dat veranderingen op verschillende niveaus in mitochondriale fysiologie en anatomie omvat.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat het meten van meerdere parameters tegelijkertijd een meer volledig beeld van het fenomeen biedt dan het meten van individuele parameters alleen, zoals calcium, mobilisatie of zwelling. Voordat u met de procedure begint, ontdooit u het mitochondriale isolatiebuffer en controleert u de pH, die 7,4 moet zijn. Plaats vervolgens alle buffers, schalen en buisjes die zullen worden gebruikt op ijs. Merk op dat alle stappen van het mitochondria-isolatieprotocol op ijs moeten worden uitgevoerd.

Plaats de harten van geëuthanaseerd muizen op een petrischaal en spoel eventueel bloed af met koude mitochondriën. Isolatie buffer. Breng vervolgens de harten over naar een nieuwe petrischaal met behulp van een mes, verwijder het vet en de atria en hak de harten fijn totdat een homogeen product is verkregen.

Breng gehakte harten over naar een 50 milliliter conische buis. Voeg 10 milliliter mitochondriaal isolatiebuffer toe met 0,1 milligram per milliliter tripsine en laat het monster 10 minuten op ijs verteren. Merk op dat het gebruik van trypsine de opbrengst van geïsoleerde mitochondriën verhoogt en constant moet worden gehouden tussen mitochondriale bereiding.

Wij raden echter aan om de functionaliteit van geïsoleerde mitochondriën te testen op bereidingen verkregen in afwezigheid van trypsine om ervoor te zorgen dat het enzym niet interfereert met hun ionen. Na de incubatie, voeg 10 milliliter mitochondriaal isolatiebuffer toe die 0,1% vetzuurvrije BS, a en vijf milligram trypsineremmer bevat en meng door het buisje meerdere keren om te keren. Om de trypsine te neutraliseren, herstelt u het verteerde weefsel door centrifugatie met lage tot gemiddelde snelheid gedurende één minuut bij vier graden Celsius.

Na de spin Resus, suspendeert u het weefsel in acht milliliter mitochondriaal isolatiebuffer met 0,1% vetzuurvrije BSA, waarbij het monster op ijs wordt gehouden. Gebruik een gemotoriseerde danshomogenisator met een teflonstamper om het monster te homogeniseren met vier tot zes passages bij 1.200 tot 1.400 RPM. Breng het homogenaat over naar een 15 milliliter conische buis en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 800 keer G en vier graden Celsius.

Om de kernen en weefselresten te pellen. Na de spin, herstelt u het supinate dat de mitochondriën bevat in microcentrifugebuisjes en centrifugeert u ze gedurende 15 minuten bij 8.000 keer G en vier graden Celsius. Na de spin zal de pellet een witte laag bovenop hebben.

Gebruik een vacuümsysteem om voorzichtig de witte laag bovenop de mitochondriale pellet te aspireren en te verwijderen. Breng vervolgens het resterende donkerdere pellet opnieuw op, dat de mitochondriën bevat, in één milliliter mitochondriaal isolatiebuffer.

Centrifugeer vervolgens de mitochondriën gedurende 10 minuten bij 8.000 keer G en vier graden Celsius. Gooi het supinate weg en suspendeer de mitochondriale pellet. In 150 microliter mitochondriën isolatiebuffer, houd de mitochondriën op ijs.

De ademhaling van geïsoleerde mitochondriën wordt gemeten met een oxythermische zuurstofelektrode die op een computer is aangesloten en wordt bestuurd door oxy. Het plus-softwareprogramma, de zuurstofelektrode moet op de dag van het experiment worden gekalibreerd. Voeg twee milliliter mitochondriaal ademhalingsbuffer toe met een uiteindelijke concentratie van één micromolair rotenon aan de oxy-the-kamer, verzegel de kamer en begin met het opnemen van het zuursignaal.

Het signaal dat door het systeem wordt opgenomen en op het computerscherm wordt weergegeven, is evenredig met de zuurstofconcentratie in de oxythermkamer. Zodra het zuursignaal stabiel is, voegt u 250 microgram mitochondriën toe en neemt u basale ademhaling gedurende één minuut op. De ademhaling op dit punt moet erg laag zijn, omdat mitochondriën aspireren op endogene substraten.

Dit is ademhaling in toestand een. Voeg succinaat toe tot een uiteindelijke concentratie van vijf millimolair om mitochondriale ademhaling bij complex twee te initiëren en neem het signaal gedurende één minuut op. Zuurstofverbruik zou moeten toenemen tijdens ademhaling in toestand twee.

Om toestand ademhaling te induceren, voegt u een DP toe tot een uiteindelijke concentratie van 150 micromolair. Op dit punt zou het zuurstofverbruik moeten toenemen als gevolg van een TP-synthese door oxidatieve fosforylering. Neem het signaal op totdat de ademhaling vertraagt, wat aangeeft dat DP wordt geconsumeerd en overgang naar toestand vier ademhaling record.

Toestand vier, ademhaling gedurende ten minste één minuut. Voeg CCCP toe tot een uiteindelijke concentratie van één micromolair en neem het signaal gedurende één minuut op. Op dit punt zou ontkoppelde ademhaling maximaal moeten zijn.

Bereken de respiratoire controleverhouding door de zuurstofverbruikssnelheid tijdens toestand drie te delen. Ademhaling door de zuurstofverbruikssnelheid tijdens toestand vier, ademhaling een do