Name: Visualisatie en genetische manipulatie van dendrieten en stekels in de muis Cerebral cortex en de hippocampus met behulp van In utero Elektroporatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Leer in utero elektroporatie voor visualisatie en genetische manipulatie van dendrieten en stekels in de cerebrale cortex en hippocampus van muizen. Deze methode biedt een snelle aanpak voor in vivo neuronaal onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen graag Dr Kathleen Mathers, Dr Jean-Philippe Mocho en dr. Yolanda Saavedra Torres bedanken voor hun hulp aan in de baarmoeder elektroporatie presteren onder aseptische procedures, en Hayley Wood voor haar hulp om de tekeningen te bereiden. EP werd ondersteund door een lange termijn Federatie van Europese Biochemische Verenigingen (FEBS) gemeenschap en een Medical Research Council (MRC) loopbaanontwikkeling gemeenschap, MAH door een Wellcome Trust subsidie ​​aan Elizabeth Fisher en Victor Tybulewicz (080174/B/06/Z) , HW door een EMBO op lange termijn gemeenschap en RA door een MRC studententijd. Dit werk werd ondersteund door een project subsidie ​​van de Wellcome Trust (086947/Z/08/Z) en door een Grant-in-de steun van de Medical Research Council (U117570528) aan FG

In het Verenigd Koninkrijk, worden muizen gehuisvest, gefokt, en behandeld volgens de richtlijnen goedgekeurd door het ministerie van Binnenlandse Zaken onder het dier (Scientific Procedures) Act 1986. 1. Voorbereiding: DNA-oplossing en naalden <ol><li> Zuiver plasmide DNA met een endotoxine gratis Maxi-prep-kit. Bereid plasmide DNA oplossing voor injectie gewenste concentraties in water en voeg Fast Green (eindconcentratie van 0,05%) injecties visualiseren. De efficiëntie van elektroporatie is sterk afhankelijk van de DNA-concentratie. Een concentratie van 1 pg / pl algemeen gebruikt. Deze concentratie is voldoende om geëlektroporeerde neuronen visualiseren zonder dat de ontwikkeling. Volgens de promoter in de plasmide vector (lage expressieniveau van cytomegalovirus promotor / enhancer sterke expressie van de cytomegalovirus immediate early enhancer en kip β-actine-promoter fusie (CAG) promoter) en de grootte en de<html> stabiliteit van het eiwit uitgedrukt kan deze concentratie worden aangepast (0,25 ug / ul 5 pg / pl). </li><li> Trek glas naalden met behulp van een micropipet trekker. </li></ol> 2. Voorbereiding van de Chirurgie <ol><li> Autoclaaf chirurgische instrumenten en fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS). </li><li> Bereid analgeticum in PBS (buprenorfine Vetergesic, eindconcentratie van 30 ng / ml). Weeg de zwangere muis en het injecteren subcutaan 0,1 mg / kg Vetergesic ten minste 30 minuten voor de operatie. Gedurende deze tijd, de voorbereiding van de chirurgische gebied. Zet de verwarming pads en het herstel kamer. Leg steriele PBS in warm water bad en alle steriele instrumenten en materialen op steriele doeken. Plaats de platina-elektroden in een PBS gevulde beker en maak verbinding met de electroporator. Vul de naald met de DNA-oplossing met behulp van een microloader tip, sluit u de naald op de capillaire houder en knijp uit de punt van de naald met een tang. </li></ol>e_title &quot;&gt; 3. chirurgie Voordat DNA-injectie en elektroporatie <ol><li> Verdoof een zwangere muis (E14.5-E15.5) met isofluraan in zuurstof drager (zuurstof 2 l / min) met behulp van een verdovingsmiddel inductie kamer. Wacht tot het dier verliest oprichten van reflex. </li><li> Breng het dier een &quot;pre-chirurgie&quot; masker. Breng een druppel ooggel op elk oog om ulceratie van de cornea van de ogen te voorkomen, terwijl de moeder is onder algemene verdoving. Gebruik een elektrisch scheerapparaat om het haar van de buik scheren. Maak een keer het geschoren gebied met clorhexidine voor het vliegtuig haren te verzamelen. </li><li> Breng het dier een tweede masker in het operatiegebied. Plaats de muis met de rug op de mat. Start de operatie als het pedaal reflex is verloren gegaan. </li><li> Doe masker en steriele handschoenen. Bedek het dier met een steriel laken (met een klein gaatje in de buik) naar de weefsels en instrumenten te voorkomen dat besmet door de gebieden van de huid die niet zijn geschoren en gedesinfecteerd. Reinig het geschoren gebied eent minstens 3 keer met clorhexidine. Gebruik een andere steriele wattenstaafje per keer. Gebruik een scalpel om een ​​verticale insnijding over de middellijn (~ 1 cm lang) maken door de huid. Met behulp van een schaar, een soortgelijke incisie van de spier van de buik langs de linea alba (witte lijn die hoofdzakelijk bestaat uit collageen bindweefsel). </li><li> Kies de meest toegankelijke embryo&#39;s en plaats de ring tang tussen twee embryo&#39;s en embryonale zorgvuldig de keten te trekken uit de buikholte. Vanaf dit punt op, hou de embryo&#39;s gehydrateerd met een steriele voorverwarmde PBS. </li></ol> Geen microscoop nodig voor visualisatie. 4. Injectie van DNA en elektroporatie <ol><li> Beginnen met een van de laterale embryo, waardoor het gemakkelijker om waarvan embryo werden geëlektroporeerd houden. Niet te veel trekken aan de embryo&#39;s, omdat dit het risico van bloedingen verhogen. Manipuleer de positie van het embryo in de vruchtzak met behulp van de ring pincet enstabiliseren de kop van de embryo&#39;s tussen de ringen. Knijp voorzichtig bij het opdrijven van het embryo dichter bij de baarmoederwand. </li><li> Met de andere hand neemt u de capillaire houder en zorgvuldig steek de naald in het midden van het halfrond aan de laterale ventrikel richten. Op de pedaal om ongeveer 1 ul DNA oplossing gemengd met Fast Green (minder dan 1 pi aan dendrieten bestuderen) injecteren. U moet houden aan de groene kleurstof het vullen van de laterale ventrikel. Kritische stappen: - De scherpte van de naald is van cruciaal belang te doorboren goed de baarmoederwand. Het is belangrijk de beweging van de naald minimaliseren aan het oppervlak van de uteruswand, na het inbrengen in de hartkamer door een vergroting van het gat zal resulteren in het verlies van vruchtwater en embryo dood. Vermijd piercing bloedvaten in de baarmoederwand, omdat dit zal resulteren in een bloeding en embryo dood. - Het is belangrijk om geen te grote hoeveelheid DNA injecteren in de laterale ventrikel, omdat het kan veroorzaken, zullenhydrocephalus (geen 2 ui niet meer bedragen dan E14.5). De hoeveelheid DNA is aangepast aan het doel van het experiment. Als 1 pi wordt algemeen gebruikt voor de meeste experimenten wordt een geringere hoeveelheid DNA (ongeveer 0,5 pi) nodig dendrieten en rug analyse. Inderdaad een paar geïsoleerde cellen dienen te worden gericht om te visualiseren en meten van de dendritische prieel van geëlektroporeerde neuronen. </li><li> Plaats de elektroden op de zijkanten van het embryo kop met de positieve (+) paddle aan dezelfde zijde als de geïnjecteerde ventrikel voor cortex elektroporatie of aan de andere kant van de geïnjecteerde ventrikel voor hippocampus elektroporatie (figuur 2). Breng vijf 30V elektrische pulsen (50 msec duur) op 1 sec intervallen. Kritische stap: Vermijd toepassing van de huidige door de placenta, omdat dit zal resulteren in embryonale sterfte. Alle embryo&#39;s in een zwangere muis kan worden geëlektroporeerd, meestal met dezelfde DNA-construct om verwarring te voorkomen. Echter, een lange operatie daling<html> is er aan de overleving van embryo&#39;s. De buikholte niet langer dan 30 min geopend. </li></ol> 5. Chirurgie Post-elektroporatie <ol><li> Na electroporating de embryo&#39;s, toe te voegen PBS in de buikholte en gebruik de ring tang om de baarmoeder hoorn weer op zijn oorspronkelijke locatie. Hecht de buik muur en de huid met Vicryl absorbeerbare hechtingen. </li><li> Plaats het dier in een herstel van kamer tot hij wakker wordt (meestal 5-10 min) en vervolgens over in een kooi geplaatst op een verwarmingselement. </li></ol> 6. Post-operatie Controleer het gedrag van de muizen om pijn, lijden of angst te beoordelen en de dieren 24 uur en 48 uur af te wegen na de operatie. Indien nodig, kunnen pijnstillers worden toegediend om de pijn en ongemak te minimaliseren. 7. Weefsel bewerken Verzamel de geëlektroporeerde embryo&#39;s of pups op het embryo of de postnatale fase die nodig is voor het experiment. ove_content &quot;&gt; - Voor analyse op embryonale stadia (bijvoorbeeld om celproliferatie of migratie te bestuderen): Euthanaseren moeder via cervicale dislocatie en het verzamelen van de embryo&#39;s. Na onthoofding de hersenen, die goed zijn geëlektroporeerd kiezen, zoals aangegeven door de hoeveelheid en de plaats van het fluorescentiesignaal, zichtbaar in de schedel met een fluorescerende binoculaire. Ontleden de hersenen uit de schedel en lossen &#39;s nachts in 4% PFA en breng vervolgens in een 20% sucrose / PBS gedurende de nacht. Insluiten in OCT verbinding invriezen bij -80 ° C en deel met een cryostaat. - Voor de analyse op postnatale fase (bijvoorbeeld om dendrieten en stekels studie): Verdoven pups of volwassen muizen met intraperitoneale injectie van pentobarbitone (40-60 mg / kg) en voer transcardial perfusie met PBS, gevolgd door 4% PFA in PBS. Ontleden de hersenen uit de schedel en post-fix in 4% PFA &#39;s nachts. Na het wassen in PBS, onderdeel van de hersenen met behulp van een vibratome (100 micrometer secties voor dendrite analyse). Monteer de secties in Aqua Poly / mount met behulp van 0.16-0.19 mm dik dekglaasjes om beeld dendrieten en stekels. 8. Representatieve resultaten Figuur 3 toont voorbeelden van geëlektroporeerde cellen in de cerebrale cortex (Figuren 3A, B) in de CA1 (figuren 3C, D) en de dentate gyrus de hippocampus (figuren 3E, F). Wild-type muizen werden geëlektroporeerd in E14.5 een GFP-construct (PCA-b-EGFPm5 demper 3) en geoogst op hersenen dagen na de geboorte (P) 14. Door injectie van een kleine hoeveelheid DNA-oplossing (0,5 ul of minder van een oplossing van 1 pg / pl), worden enkele cellen gelabeld, waardoor de visualisatie van de dendritische arborization geïsoleerde GFP + cellen (figuur 3) en de ruggen bij een grotere vergroting (figuur 4). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig1.jpg" /> &lt;strong&gt; Figuur 1. Schematische weergave van elektroporatie protocollen kunnen worden gebruikt om dendrieten en ruggen bestuderen. (A) elektroporatie van een GFP-construct te dendrieten en ruggen vergelijken wild-type en mutante muizen. (B) elektroporatie van GFP-shRNA (GFP tot expressie komen vanaf hetzelfde construct) om dendrieten en ruggen bij muizen werden geëlektroporeerd met een shRNA vergelijken construeren specifiek voor een gen van interesse (X) of een controle shRNA. (C) IUE kan worden gebruikt samen met een Cre induceerbare systeem om expressie van het shRNA beperken tot de gewenste tijdsperiode. In deze proef wordt een vector die een vorm van het Cre-recombinase dat geactiveerd kan worden door 4-hydroxytamoxifen (CAG-ER T2 creer T2, 1 pg / pl) 10 wordt geëlektroporeerd met een vector die een specifieke shRNA in Cre afhankelijke wijze (1 pg / pl en met een recombinatie indicator (CALNL-GFP-construct, GFP expressie geïnduceerd door Cre;. 1 pg / pl) 10 efficiencycy de knockdown kan worden verbeterd door de concentratie van de shRNA evenals meer CAG-ER T2 creer T2 concentratie. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig2.jpg" /> Figuur 2. Ruimtelijke controle van elektroporatie. Deze figuur toont waar het positioneren van de schoep elektrodes volgens de DNA injectie om de cerebrale cortex of hippocampus gericht. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig3.jpg" /> Figuur 3. Visualisatie van de dendritische prieel van in de baarmoeder geëlektroporeerd cellen in de cerebrale cortex en de hippocampus. (A, B) coronale secties met GFP + piramidale cellen in de hersenschors, (CD) piramidale cellen in CA1 van de hippocampus en (E, F), granule cellen in de dentate gyrus op P14. Een GFP construct (PCA-b-EGFPm5 geluiddemper 3) werd geëlektroporeerd op E14.5. Hogere vergroting foto&#39;s (B, D, F) blijkt dat de IUE is een efficiënte methode om dendrieten te visualiseren. Schaal staafjes 50 pm (B, D en F), 150 pm (A, C, E). <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig4.jpg" /> Figuur 4. Visualisatie van dendritische &#39;spines in P14 neuronen die werden in de baarmoeder geëlektroporeerd op E14.5 met een GFP expressie te construeren. (A, B) Hoge vergroting beelden van de stekels van basale dendrieten van de hippocampus piramidale neuronen. Schaal staafjes 5 pm (A) en 2 pm (B).

<ol><li>Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+Molecular+Approach+of+in+utero+Electroporation+to+Functionally+Decipher+Endophenotypes+in+Neurodevelopmental+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders.</a> Front Mol. Neurosci. 4, 37(2011).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).</li>
<li>Shimogori, T., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+application+with+in+utero+electroporation+in+mouse+embryonic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain.</a> Dev. Growth Differ. 50, 499-506 (2008).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+embryonic+mouse+central+nervous+system+cells+by+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation.</a> Dev. Growth Differ. 50, 507-511 (2008).</li>
<li>Castro, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+function+of+the+proneural+factor+Ascl1+in+progenitor+proliferation+identified+by+genome-wide+characterization+of+its+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A novel function of the proneural factor Ascl1 in progenitor proliferation identified by genome-wide characterization of its targets.</a> Genes Dev. 25, 930-945 (2011).</li>
<li>Pacary, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proneural+transcription+factors+regulate+different+steps+of+cortical+neuron+migration+through+Rnd-mediated+inhibition+of+RhoA+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Proneural transcription factors regulate different steps of cortical neuron migration through Rnd-mediated inhibition of RhoA signaling.</a> Neuron. 69, 1069-1084 (2011).</li>
<li>Marteau, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiopoietin-2+regulates+cortical+neurogenesis+in+the+developing+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Angiopoietin-2 regulates cortical neurogenesis in the developing telencephalon.</a> Cereb Cortex. 21, 1695-1702 (2011).</li>
<li>Ramon Moliner, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRamon+Moliner%2C+E+%22Comparative+Methods+in+Neuroanatomy%22">Comparative Methods in Neuroanatomy</a>. , Springer. New york. (1970).</li>
<li>Banks, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+and+other+phenotypes+in+a+cytoplasmic+Dynein+light+intermediate+chain+1+mutant+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Behavioral and other phenotypes in a cytoplasmic Dynein light intermediate chain 1 mutant mouse.</a> J. Neurosci. 31, 5483-5494 (2011).</li>
<li>Elias, G. M., Elias, L. A., Apostolides, P. F., Kriegstein, A. R., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+trafficking+of+AMPA+and+NMDA+receptors+by+SAP102+and+PSD-95+underlies+synapse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Differential trafficking of AMPA and NMDA receptors by SAP102 and PSD-95 underlies synapse development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20953-20958 (2008).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).</li>
<li>Navarro-Quiroga, I., Chittajallu, R., Gallo, V., Haydar, T. F. L. ong-term <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((selective+gene+expression+in+developing+and+adult+hippocampal+pyramidal+neurons+using+focal+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">selective gene expression in developing and adult hippocampal pyramidal neurons using focal in utero electroporation.</a> J. Neurosci. 27, 5007-5011 (2007).</li>
<li>Nakahira, E., Yuasa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+generation%2C+migration%2C+and+differentiation+in+the+mouse+hippocampal+primoridium+as+revealed+by+enhanced+green+fluorescent+protein+gene+transfer+by+means+of+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation.</a> J. Comp. Neurol. 483, 329-340 (2005).</li>
<li>Ramos, R. L., Bai, J., LoTurco, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopia+formation+in+rat+but+not+mouse+neocortex+after+RNA+interference+knockdown+of+DCX%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Heterotopia formation in rat but not mouse neocortex after RNA interference knockdown of DCX.</a> Cereb Cortex. 16, 1323-1331 (2006).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

IUE is een krachtig hulpmiddel om de genexpressie te manipuleren niet alleen in de ruimte, maar ook in de tijd. We laten hier zien dat deze techniek kan worden gebruikt voor het visualiseren en genetisch te manipuleren dendrieten en stekels in de cerebrale cortex en de hippocampus van muizen. Naast de eerder genoemde voordelen, zij opgemerkt dat IUE, in tegenstelling tot werkwijze Golgi kan worden gecombineerd met immunohistochemie of in situ hybridisatie, waardoor bijvoorbeeld fenotype geëlektroporeerde cellen. Het is ook belangrijk te vermelden dat deze procedure niet duidelijk hersenen misvormingen, ondanks de relatieve invasiviteit. Daarnaast, op cellulair niveau, is IUE geen wijziging in de elektrofysiologische eigenschappen van de neuronen geëlektroporeerde 13. Terwijl onze demonstratie richt zich op de visualisatie van dendrieten en spines morfologie, kon IUE van de corticale of hippocampale neuronen op E14.5 ook gebruikt worden om andere ontwikkelingsstoornissen evenementen zoals axon vorming en begeleiding te bestuderen. In toe te voegenbankwezen in, hetzelfde soort protocol kunnen worden uitgevoerd in andere stadia van de embryonale ontwikkeling bij verschillende populaties richten. Zo kan een ontwikkelingsgebied zeer laat corticale elektroporatie paradigma op E18.5 worden uitgevoerd om uitdrukking te rijden in astrocytaire voorlopercellen 1. Evenzo wordt een elektroporatie van de hippocampus op E14.5 toelaat CA1-CA3 piramidevormige neuron voorlopers en dentaatgroepen granule cellen progenitorcellen richten tegelijkertijd zou een late hippocampus elektroporatie (E18.5 of postnatale) kunnen verschillende getand granule richten voorlopers 14. In dit geval kan de geïnjecteerde hoeveelheid DNA ook worden verhoogd als de stroomsterkte. Transgenen geïntroduceerd door IUE lijken te blijven episomale en zijn dus verloren van de cellen na de opeenvolgende celdelingen. In postmitotische cellen zoals neuronen echter de episomale transgenen actief blijven maanden na elektroporatie waarbij langdurige studie 1315. In onze studie hebben we waargenomen heldere GFP + cellen tot 7 weken na de geboorte (het laatste tijdstip analyseerden we) dat aangeeft dat embryonale targeting van corticale of hippocampus neuronale precursoren met behulp van IUE resulteert in een blijvende expressie van het transgen van de vroege ontwikkeling tijdstippen up naar volwassenheid. Een stroom begrenzing van de techniek is dat het moeilijk is uit te oefenen een goede controle over het totale aantal geëlektroporeerde cellen. Echter, door vermindering van de geïnjecteerde hoeveelheid DNA oplossing, hebben we aangetoond dat het mogelijk is om een ​​aantal cellen labelen en de dendritische arborization geïsoleerde GFP + cellen alsmede de ruggen visualiseren. De afmeting van de getransfecteerde zou ook kunnen worden aangepast door aanpassen van de parameters van de elektroporatie zoals stroomsterkte en het aantal pulsen of de diameter van de schoepen elektroporatie. Al met al IUE is een methode die is eenvoudig te implementeren, snelle enefficiënt om dendrieten en stekels in vivo te bestuderen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="4"> Bereiding van naalden en DNA oplossing voor injectie </td></tr><tr><td> Endofree Plasmide Maxi Kit </td><td> Qiagen </td><td> 12362 </td><td></td></tr><tr><td> Fast Green </td><td> Sigma </td><td> F-7258 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilicaatglas haarvaten 1,0 mm OD x 0,58 mm ID </td><td> Harvard Apparatuur </td><td> 30-0016 </td><td></td></tr><tr><td> Microloader tips </td><td> Eppendorf </td><td> 5242956003 </td><td> Voor Eppendorf pipetten 0,5 pi-10 ul / 2 tot 20 ul </td></tr><tr><td></td><td></td><td> &amp; Nbsp; </td><td> Materiaal voor een operatie </td></tr><tr><td> Extra dunne Iris schaar </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> Gebogen tang </td><td> Fine Science Tools </td><td> 91197-00 </td><td></td></tr><tr><td> Ring tang </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11103-09 </td><td></td></tr><tr><td> Naaldhouder </td><td> Fine Science Tools </td><td> 12002-12 </td><td></td></tr><tr><td> Graefe tang </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11050-10 </td><td></td></tr><tr><td> Vicryl resorbeerbaar garen </td><td> Inc (Johnson &amp; Johnson) Ethicon </td><td> W9074 </td><td></td></tr><tr><td> Steriele doeken 30cm x 45 cm </td><td> Buster </td><td> 141765 </td><td></td></tr><tr><td> Steriele swabs </td><td> Shermond </td><td> Huby-340 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Wattenstaafjes </td><td> Schoon Cross Co, Ltd </td><td> 1860 </td><td></td></tr><tr><td> Buprenorfine (Vetergesic) </td><td> Alstoe Animal Health </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Clorhexidine </td><td> Vetasept </td><td> XHG007 </td><td></td></tr><tr><td> Ooggel Viscotears </td><td> Novartis </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Isofluraan </td><td> Abbott Laboratories </td><td> B506 </td><td></td></tr><tr><td> Pentoject, Pentobarbitone Natrium 20% </td><td> Animalcare </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="4"> Elektroporatie </td></tr><tr><td> Electroporator </td><td> BTX </td><td> ECM830 </td><td></td></tr><tr><td> Platinum Tweezertrode 5mm </td><td> BTX, Harvard Apparatus </td><td> 45-0489 </td><td></td></tr><tr><td> Femtojet microinjector </td><td> Eppendorf </td><td> 5247000030 </td><td></td></tr><tr><td> Voetschakelaar voor Femtojet Microinjector </td><td> Eppendorf </td><td> 5247623002 </td><td></td></tr><tr><td> Capillaire houder </td><td> Eppendorf </td><td> 5176190002 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tissue verwerking </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Sucrose </td><td> VWR (Prolabo) </td><td> 27480.294 </td><td></td></tr><tr><td> Objectglaasjes </td><td> ThermoScientific (Menzel-Glaser) </td><td> J1800AMNZ </td><td></td></tr><tr><td> Dekglaasjes </td><td> Menzel-Glaser </td><td></td><td> 22 x 50 mm # 1,5 </td></tr><tr><td> Aqua Poly / mount </td><td> Polysciences, Inc </td><td> 18606 </td><td></td></tr></tbody></table>

visualisatie en genetische manipulatie van dendrieten en stekels in de muis cerebral cortex en de hippocampus met behulp van<em&gt; in utero</em&gt; elektroporatie

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero elektroporatie (IUE) is uitgegroeid tot een krachtige techniek om de ontwikkeling van verschillende regio&#39;s in de embryonale zenuwstelsel System 1-5 te bestuderen. Tot op heden is deze tool is op grote schaal is gebruikt om de regulatie van cellulaire proliferatie, differentiatie en neuronale migratie, met name in de ontwikkelingslanden hersenschors 6-8 te bestuderen. Hier hebben we onze detail-protocol om electroporate in utero de cerebrale cortex en de hippocampus en het bewijs dat deze aanpak kan worden gebruikt om dendrieten en stekels in deze twee cerebrale regio&#39;s te bestuderen te bieden. Visualisatie en manipulatie van neuronen in de primaire culturen hebben bijgedragen tot een beter begrip van de processen die betrokken zijn bij dendriet, wervelkolom en synaps ontwikkeling. Maar neuronen groeien in vitro niet worden blootgesteld aan alle fysiologische prikkels die dendriet en / of ruggegraat vorming en instandhouding kan van invloed zijn tijdens de normale ontwikkeling. Onze kennis van dendrieten en spines structuren <em&gt; in vivo in wild-type of mutant muizen komt meestal uit waarnemingen met behulp van de Golgi-Cox methode 9. Echter Golgi kleuring als onvoorspelbaar zijn. Inderdaad, worden groepen van zenuwcellen en vezels traktaten willekeurig label, met bijzondere gebieden vaak in de vorm volledig gekleurd zijn, terwijl aangrenzende gebieden zijn verstoken van kleuring. Recente studies hebben aangetoond dat IUE TL constructen een aantrekkelijk alternatief methode dendrieten ruggen en synapses bestuderen mutant / wild-type muizen 10-11 (figuur 1A) vertegenwoordigt. Bovendien in vergelijking met de generatie van de muis uitsparingen, IUE is een snelle benadering winst en functieverlies studies uitgevoerd in bepaalde populatie van cellen gedurende een bepaalde tijdsperiode. Daarnaast is IUE met succes gebruikt bij induceerbare genexpressie of induceerbare RNAi benadert het verfijnen van de tijdelijke controle over de expressie van een gen of shRNA 12. Deze voordelen van de IUE hebben dus opened nieuwe dimensies aan het effect van genexpressie / onderdrukking van dendrieten en stekels niet alleen in bepaalde cerebrale structuren (Figuur 1B), maar ook op een bepaald tijdstip van ontwikkeling (figuur 1C) te bestuderen. Tot slot, IUE is een nuttig instrument om functionele interacties tussen genen die betrokken zijn bij dendriet, wervelkolom en / of synaps ontwikkeling te identificeren. Inderdaad, in tegenstelling tot andere genoverdracht methoden zoals virus, is het eenvoudig om meerdere RNAi of transgenen combineren in celpopulatie. Kortom, IUE is een krachtige methode die al heeft bijgedragen aan de karakterisering van moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de hersenfunctie en ziekte en het moet ook nuttig zijn bij de studie van dendrieten en stekels.

Dit artikel beschrijft in detail een protocol bij electroporate in utero de cerebrale cortex en de hippocampus bij E14.5 bij muizen. We tonen ook aan dat dit een waardevolle methode om dendrieten en stekels te bestuderen in deze twee cerebrale regio&#39;s.

Visualisatie en genetische manipulatie van dendrieten en stekels in de muis Cerebral cortex en de hippocampus met behulp van<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporatie

In utero electroporatie (IUE) is een krachtige techniek geworden om de ontwikkeling van verschillende regio's van het embryonale zenuwstelsel te bestuderen 1-5. Tot op heden ...

Het doel van deze procedure is om in utero electroporatie te gebruiken om dendrieten en spines in de cerebrale cortex en hippocampus van de muis te visualiseren en genetisch te manipuleren. Dit wordt bereikt door eerst de gewenste plasmide-DNA-oplossing in de laterale ventrikel van embryo's in utero te injecteren. Vervolgens worden electroporatie-elektroden in verschillende posities geplaatst.Na de DNA-injectie wordt de cerebrale cortex of de hippocampus geëlektroporeerd, gevolgd door de gewenste postnatale fase of volwassen stadia. De muizen worden geperfuseerd en de hersenen worden geoogst. Ten slotte worden de hersenen gesneden met een vibratoom.Uiteindelijk kunnen dendrieten en stekels worden gevisualiseerd met behulp van confocale microscopie. De techniek van unitaritye elektroporatie biedt verschillende voordelen ten opzichte van de methoden om dendrieten en stekels te bestuderen. Deze techniek maakt het namelijk mogelijk om dit aspect direct in vivo te bestuderen.Bovendien is elektroporatie, in vergelijking met het genereren van knockout-muizen, een snelle methode om het effect van genonderdrukking of genexpressie op dendrieten en stekels te bestuderen, niet alleen in specifieke celstructuren, maar ook op een specifiek moment in de ontwikkeling. Het gebruik van induceerbare systemen bij elektroporatie is ook een nuttig instrument om functionele interacties te identificeren tussen genen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van dendrieten en stekels. Inderdaad, in tegenstelling tot virussen is het voor ons eenvoudiger om meerdere DNA-sequenties of meerdere target-genen in dezelfde populatie cellen te combineren. Begin met het verdunnen van DNA tot de gewenste concentraties in water en voeg Fast Green-kleurstof toe tot een eindconcentratie van 0,05%. Gebruik een micropipet-puller om glazen naalden voor injectie te trekken.Plaats een drachtige muis in een anesthesie-inductiekamer met isofluraan en stel de zuurstofstroom in op twee liter per minuut. Wanneer het dier zijn knipperreflex verliest, breng het dan over naar een pre-operatief masker. Breng een druppel IGEL aan op elk oog en gebruik een elektrisch scheerapparaat om het haar op de buik weg te scheren.Reinig het geschoren gebied eenmaal met chloorhexidine om loszittende haren te verwijderen. Verplaats het dier naar een tweede masker in het operatiegebied, met de rug op het warmtekussen. Begin de operatie zodra de pedaalreflex is verdwenen.Zet een masker en steriele handschoenen op en dek het dier af met een steriel laken. Reinig het geschoren gebied ten minste drie keer met chloorhexidine. Gebruik een scalpel om een verticale incisie langs de middellijn door de huid te maken.Gebruik een schaar. Maak een soortgelijke incisie in de buikspieren langs de lineaire elleboog. Selecteer de meest toegankelijke embryo's.Plaats een ringklem tussen twee embryo's en trek de embryonale keten voorzichtig uit de buikholte. Houd de embryo's vanaf dit punt gehydrateerd met steriele, voorverwarmde PBS. Gebruik hiervoor de ringklem.Manipuleer voorzichtig de positie van het embryo in de vruchtzak en stabiliseer de kop tussen de ringen. Knijp zachtjes om het embryo omhoog te duwen, dichter bij de baarmoederwand. Neem met de andere hand de capillairhouder en voeg de naald voorzichtig in het midden van de hemisfeer in om de laterale ventrikel te targeten.Druk op het pedaal om ongeveer 0,5 µL groene DNA-oplossing te injecteren, terwijl u er zorg voor draagt de beweging van de naald aan het oppervlak van de uterine wand te minimaliseren en het doorprikken van bloedvaten vermijdt. Plaats de elektroden aan de zijkanten van de kop van het embryo, waarbij het positieve pedaal zich aan dezelfde zijde als de geïnjecteerde ventrikel bevindt voor cortex-elektroporatie, of aan de tegenovergestelde zijde van de geïnjecteerde ventrikel voor hippocampus-elektroporatie. Dien vervolgens vijf elektrische pulsen van 30 volt toe met een duur van 50 milliseconden in intervallen van één seconde.Vermijd het aanleggen van een elektrische stroom over de placenta, aangezien dit zal leiden tot de dood van het embryo. Om de overlevingskansen te vergroten, moeten alle embryo's binnen 30 minuten worden geïnjecteerd en geëlektroporeerd. Spoel na voltooiing met PBS, reinig de buikholte en gebruik de ringklem om de uterinehoorn terug te plaatsen op de oorspronkelijke positie. Gebruik absorbeerbare vicrylhechtningen om de buikwand en de huid te sluiten. Plaats het dier in een herstelkamer tot het is ontwaakt.Plaats de muis vervolgens 24 en 48 uur na de operatie in een kooi op een warmtemat. Controleer het gedrag van de muis om pijn, lijden of stress te beoordelen, en weeg het dier voor de analyse van de hersenen. Gebruik in de postnatale stadia een vibrator om eerder geperfuseerde en gepostfixeerde hersenen te snijden; monteer de secties in aqua poly mount om dendrieten en spines te imagen.Deze figuur toont voorbeelden van geëlektroporeerde cellen in de cerebrale cortex, de CA1 en de gyrus dentatus van de hippocampus terwijl wild-type muizen werden geëlektroporeerd op E 14.5, waarbij het GFP-construct werd gebruikt en de hersenen werden geoogst op postnatale dag 14. Door het injecteren van een klein volume DNA-oplossing worden slechts enkele cellen gelabeld, wat de visualisatie mogelijk maakt van de dendritische arborisatie van geïsoleerde GFP-positieve cellen, evenals hun spines bij een hogere vergroting. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om een klein volume DNA te injecteren om slechts enkele cellen te targeten, zodat men de dendritische arborisatie en de spines van de geëlektroporeerde neuronen kan visualiseren en kwantificeren.

visualization-genetic-manipulation-dendrites-spines-mouse-cerebral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In Utero Intraventriculaire injectie en elektroporatie van de E15 muizenembryo&#39;s

In utero elektroporatie zorgt voor een snelle genafgifte in een ruimtelijk-temporeel en gecontroleerde wijze in de zich ontwikkelende centrale zenuwstelsel (CZS). Hier beschrijven we een groot aanpassingsvermogen in utero electroporatie protocol dat gebruikt kan worden om expressie constructen te leveren in meerdere embryonale CNS domeinen, waaronder de telencephalon, diencephalon en netvlies.

Efficiënte gen delivery in meerdere CNS Gebieden Het gebruik van In Utero Elektroporatie

Een genoverdracht methode in de zich ontwikkelende hersenen van muizen wordt beschreven door middel van een unieke chirurgische methode en de speciale vorm van de elektroden. Deze unieke techniek maakt het mogelijk transfectie van plasmide DNA tijdelijk en ruimtelijk, die veel neurowetenschappers zullen helpen bij het bestuderen van ontwikkeling van de hersenen.

Muis In Utero Elektroporatie: Gecontroleerde spatiotemporele Gene Transfectie

Ondanks de functionele en medische belang van de...

Genetische Manipulatie van de muis Ontwikkelen Hypothalamus via<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporatie

Hier presenteren we een protocol dat een hulpmiddel biedt om regulerende mechanismen van specifieke genen tijdens de ontwikkeling van de hippocampus te onderzoeken. Het gebruik van ex utero elektroporatie en organotypische plakcultuur maakt de op- en neerregulatie van de expressie van genen van belang in enkele cellen mogelijk en volgt hun lot tijdens de ontwikkeling.

Ex Utero Electroporatie en Organotypische Slice Cultuur van de muis hippocampus Tissue

Dit protocol beschrijft in detail hoe specifiek te transfecteren verschillende regio's in het centrale zenuwstelsel van C57BL/6 via in utero elektroporatie. Inbegrepen in dit protocol zijn gedetailleerde instructies voor transfecties van regio's die zich ontwikkelen tot de cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, laterale septumkern en striatum.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Laterale Septal Nucleus- en Striatum-specifieke<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporatie in de C57BL / 6 muis

Dit manuscript biedt protocollen die gebruik maken van in de baarmoeder elektroporatie (IUE) om de structurele connectiviteit van neuronen te beschrijven op het single-cell niveau en de prikkelbaarheid van fluorescent gelabelde neuronen. Histologie wordt gebruikt dendritische en axonale uitsteeksels karakteriseren. Whole-cell opname in acute plakjes wordt gebruikt om prikkelbaarheid te onderzoeken.

In Utero Elektroporatie benaderingen om de prikkelbaarheid van neuronale subpopulaties en Single-cell Connectivity Studie

Cel-autonome functies van genen in de hersenen kunnen worden bestudeerd door het induceren van verlies of winst van functie in dunbevolkte van cellen. Hier beschrijven we in utero electroporation om te Cre recombinase leveren in dunbevolkte corticale neuronen met floxed genen te ontwikkelen om te leiden tot verlies van functie in vivo.

Cre-lox recombinatie bij muis hersenschors via In Utero Electroporation inducerende

Dubbel in utero elektroporatie maakt het richten van celpopulaties die ruimtelijk en tijdelijk gescheiden. Deze techniek is nuttig om interacties tussen die celpopulaties te visualiseren met behulp van fluorescerende eiwitten in normale omstandigheden, maar ook na functionele experimenten om genen van belang te verstoren.

Dubbel in utero-elektroporatie om tijdelijk en ruimtelijk gescheiden celpopulaties te targeten

Astrocyten betegelen de hersenschors uniform, waardoor de analyse van hun complexe morfologie uitdagend is op cellulair niveau. Het protocol dat hier wordt verstrekt, maakt gebruik van multicolor-etikettering op basis van in utero-elektroporatie om corticale astrocyten uit te schakelen en hun volume en morfologie te analyseren met een gebruiksvriendelijke pijplijn voor beeldanalyse.

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Markers om Cortical Mouse Astrocytes te individualiseren

Leer in utero elektroporatie voor visualisatie en genetische manipulatie van dendrieten en stekels in de cerebrale cortex en hippocampus van muizen. Deze methode biedt een snelle aanpak voor in vivo neuronaal onderzoek.

Visualisatie en genetische manipulatie van dendrieten en stekels in de muis Cerebral cortex en de hippocampus met behulp van In utero Elektroporatie (Video) | JoVE Journal

Visualisatie en genetische manipulatie van dendrieten en stekels in de muis Cerebral cortex en de hippocampus met behulp van

Meer video's verkennen