Visualisatie en genetische manipulatie van dendrieten en stekels in de muis Cerebral cortex en de hippocampus met behulp van

Het doel van deze procedure is om in utero electroporatie te gebruiken om dendrieten en spines in de cerebrale cortex en hippocampus van de muis te visualiseren en genetisch te manipuleren. Dit wordt bereikt door eerst de gewenste plasmide-DNA-oplossing in de laterale ventrikel van embryo's in utero te injecteren. Vervolgens worden electroporatie-elektroden in verschillende posities geplaatst.

Na de DNA-injectie wordt de cerebrale cortex of de hippocampus geëlektroporeerd, gevolgd door de gewenste postnatale fase of volwassen stadia. De muizen worden geperfuseerd en de hersenen worden geoogst. Ten slotte worden de hersenen gesneden met een vibratoom.

Uiteindelijk kunnen dendrieten en stekels worden gevisualiseerd met behulp van confocale microscopie. De techniek van unitaritye elektroporatie biedt verschillende voordelen ten opzichte van de methoden om dendrieten en stekels te bestuderen. Deze techniek maakt het namelijk mogelijk om dit aspect direct in vivo te bestuderen.

Bovendien is elektroporatie, in vergelijking met het genereren van knockout-muizen, een snelle methode om het effect van genonderdrukking of genexpressie op dendrieten en stekels te bestuderen, niet alleen in specifieke celstructuren, maar ook op een specifiek moment in de ontwikkeling. Het gebruik van induceerbare systemen bij elektroporatie is ook een nuttig instrument om functionele interacties te identificeren tussen genen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van dendrieten en stekels. Inderdaad, in tegenstelling tot virussen is het voor ons eenvoudiger om meerdere DNA-sequenties of meerdere target-genen in dezelfde populatie cellen te combineren. Begin met het verdunnen van DNA tot de gewenste concentraties in water en voeg Fast Green-kleurstof toe tot een eindconcentratie van 0,05%. Gebruik een micropipet-puller om glazen naalden voor injectie te trekken.

Plaats een drachtige muis in een anesthesie-inductiekamer met isofluraan en stel de zuurstofstroom in op twee liter per minuut. Wanneer het dier zijn knipperreflex verliest, breng het dan over naar een pre-operatief masker. Breng een druppel IGEL aan op elk oog en gebruik een elektrisch scheerapparaat om het haar op de buik weg te scheren.

Reinig het geschoren gebied eenmaal met chloorhexidine om loszittende haren te verwijderen. Verplaats het dier naar een tweede masker in het operatiegebied, met de rug op het warmtekussen. Begin de operatie zodra de pedaalreflex is verdwenen.

Zet een masker en steriele handschoenen op en dek het dier af met een steriel laken. Reinig het geschoren gebied ten minste drie keer met chloorhexidine. Gebruik een scalpel om een verticale incisie langs de middellijn door de huid te maken.

Gebruik een schaar. Maak een soortgelijke incisie in de buikspieren langs de lineaire elleboog. Selecteer de meest toegankelijke embryo's.

Plaats een ringklem tussen twee embryo's en trek de embryonale keten voorzichtig uit de buikholte. Houd de embryo's vanaf dit punt gehydrateerd met steriele, voorverwarmde PBS. Gebruik hiervoor de ringklem.

Manipuleer voorzichtig de positie van het embryo in de vruchtzak en stabiliseer de kop tussen de ringen. Knijp zachtjes om het embryo omhoog te duwen, dichter bij de baarmoederwand. Neem met de andere hand de capillairhouder en voeg de naald voorzichtig in het midden van de hemisfeer in om de laterale ventrikel te targeten.

Druk op het pedaal om ongeveer 0,5 µL groene DNA-oplossing te injecteren, terwijl u er zorg voor draagt de beweging van de naald aan het oppervlak van de uterine wand te minimaliseren en het doorprikken van bloedvaten vermijdt. Plaats de elektroden aan de zijkanten van de kop van het embryo, waarbij het positieve pedaal zich aan dezelfde zijde als de geïnjecteerde ventrikel bevindt voor cortex-elektroporatie, of aan de tegenovergestelde zijde van de geïnjecteerde ventrikel voor hippocampus-elektroporatie. Dien vervolgens vijf elektrische pulsen van 30 volt toe met een duur van 50 milliseconden in intervallen van één seconde.

Vermijd het aanleggen van een elektrische stroom over de placenta, aangezien dit zal leiden tot de dood van het embryo. Om de overlevingskansen te vergroten, moeten alle embryo's binnen 30 minuten worden geïnjecteerd en geëlektroporeerd. Spoel na voltooiing met PBS, reinig de buikholte en gebruik de ringklem om de uterinehoorn terug te plaatsen op de oorspronkelijke positie. Gebruik absorbeerbare vicrylhechtningen om de buikwand en de huid te sluiten. Plaats het dier in een herstelkamer tot het is ontwaakt.

Plaats de muis vervolgens 24 en 48 uur na de operatie in een kooi op een warmtemat. Controleer het gedrag van de muis om pijn, lijden of stress te beoordelen, en weeg het dier voor de analyse van de hersenen. Gebruik in de postnatale stadia een vibrator om eerder geperfuseerde en gepostfixeerde hersenen te snijden; monteer de secties in aqua poly mount om dendrieten en spines te imagen.

Deze figuur toont voorbeelden van geëlektroporeerde cellen in de cerebrale cortex, de CA1 en de gyrus dentatus van de hippocampus terwijl wild-type muizen werden geëlektroporeerd op E 14.5, waarbij het GFP-construct werd gebruikt en de hersenen werden geoogst op postnatale dag 14. Door het injecteren van een klein volume DNA-oplossing worden slechts enkele cellen gelabeld, wat de visualisatie mogelijk maakt van de dendritische arborisatie van geïsoleerde GFP-positieve cellen, evenals hun spines bij een hogere vergroting. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om een klein volume DNA te injecteren om slechts enkele cellen te targeten, zodat men de dendritische arborisatie en de spines van de geëlektroporeerde neuronen kan visualiseren en kwantificeren.