Visualisatie en genetische manipulatie van dendrieten en stekels in de muis Cerebral cortex en de hippocampus met behulp van In utero Elektroporatie
26 juli 2012
Dit artikel beschrijft in detail een protocol bij electroporate in utero de cerebrale cortex en de hippocampus bij E14.5 bij muizen. We tonen ook aan dat dit een waardevolle methode om dendrieten en stekels te bestuderen in deze twee cerebrale regio's.
Het doel van deze procedure is om in utero elektroporatie te gebruiken om dendrieten en stekels in de hersenschors en hippocampus van muizen te visualiseren en genetisch te manipuleren. Dit wordt bereikt door eerst de gewenste plasmide, DNA-oplossing in het laterale ventrikel van embryo's in utero te injecteren. Vervolgens worden verschillende posities van de Palo-elektroden gebruikt.
Volgens de DNA-injectie wordt de hersenschors of de hippocampus geëlektroporeerd, vervolgens in een gewenst postnataal of volwassen stadium. Muizen worden geperfundeerd en hersenen worden verzameld. Ten slotte worden de hersenen gesneden met een vibram.
Uiteindelijk kunnen dendrieten en stekels worden gevisualiseerd met behulp van confocale microscopie. De techniek van unitaire elektroporatie biedt verschillende voordelen in vergelijking met de methoden om niet-recht en stekel te bestuderen. Inderdaad, deze techniek maakt het mogelijk om dit aspect direct in vivo te bestuderen.
Bovendien is in vergelijking met het genereren van knockout-muizen in elektro-operatie een snelle benadering om het effect van genonderdrukking of genregulatie en don-schrijven en stekel te bestuderen, niet alleen in specifieke celstructuren, maar ook op een specifiek punt van ontwikkeling. Het gebruik van een induceerbaar systeem in inter-elektro-operatie is ook een nuttig hulpmiddel om functionele interacties tussen genen te identificeren die betrokken zijn bij het don-schrijven en stekelontwikkeling. Inderdaad, in tegenstelling tot virussen, is het voor ons moeilijk om meerdere HNA of meerdere tons-genen in dezelfde populatie cellen te combineren. Om te beginnen verdun DNA tot de gewenste concentratie in water en voeg fast green-kleurstof toe tot een eindconcentratie van 0,05%. Gebruik een micro perpetu puller om glazen naalden voor injectie te trekken.
Plaats een zwangere muis in een anesthesie-inductiekamer met behulp van isofluorine en open de zuurstof tot twee liter per minuut. Wanneer het dier zijn schrijfreflex verliest, breng het over naar een pre-operatiemasker. Plaats een druppel IGEL op elk oog en gebruik een elektrische scheermachine om het haar van de buik te scheren.
Reiniging van het geschoren gebied eenmaal met chloorhexidine om vliegend haar te verzamelen. Breng het dier over naar een tweede masker in het chirurgische gebied met zijn rug op het verwarmingskussen. Begin met de operatie wanneer de petalreflex verloren is gegaan.
Draag een masker en steriele handschoenen en bedek het dier met een steriele doek. Reinig het geschoren gebied minstens drie keer met chloorhexidine. Gebruik een scalpel om een verticale incisie te maken langs de middenlijn door de huid.
Gebruik scharen. Maak een soortgelijke incisie in de buikspier langs de lineaire elleboog. Kies de meest toegankelijke embryo's.
Plaats ringtang tussen twee embryo's en trek voorzichtig de embryonische keten uit de buikholte. Vanaf dit punt houden de embryo's gehydrateerd met steriele voorverwarmde PBS. Gebruik ringtang.
Manipuleer voorzichtig de positie van het embryo in de vruchtzak en stabiliseer het hoofd tussen de ringen. Knijp zachtjes om het embryo dichter bij de baarmoederwand te duwen. Met de andere hand neemt u de capillaire houder en steekt u voorzichtig de naald in het midden van de hemisfeer om het laterale ventrikel te targeten.
Zorg ervoor dat de beweging van de naald op het oppervlak van de baarmoederwand wordt geminimaliseerd en vermijd het doorboren van bloedvaten, druk op de pedale om ongeveer 0,5 microliters groene DNA-oplossing te injecteren. Plaats de elektroden aan de zijkanten van het hoofd van het embryo met de positieve pedale aan dezelfde kant als het geïnjecteerde ventrikel voor cortex-elektroporatie, of aan de tegenovergestelde kant van het geïnjecteerde ventrikel, de hippocampus-elektroporatie. Breng vervolgens vijf elektrische pulsen van 30 volt van 50 milliseconden bij een secondeninterval aan.
Vermijd het toepassen van stroom over de placenta, omdat dit zal resulteren in embryo-dood. Om de overlevingskansen te vergroten, injecteer en elektro-bewerk alle embryo's in minder dan 30 minuten wanneer ze klaar zijn bij PBS, de buikholte en gebruik de ringtang om het baarmoederoorn in zijn oorspronkelijke locatie te plaatsen. Gebruik Vicryl absorbeerbare hechtingen om de buikwand en de huid te sluiten. Plaats het dier in een herstelkamer totdat het wakker wordt.
Breng het vervolgens over naar een kooi op een verwarmingskussen 24 en 48 uur na de operatie. Controleer het gedrag van de muis om pijn, lijden of stress te beoordelen en weeg het dier om hersenen te analyseren. In postnatale stadia, gebruik een vibrator om eerder geperfundeerde en postfixed hersenen te snijden en monteer de secties in aqua poly-mount om dendrieten en stekels af te beelden.
Deze figuur toont voorbeelden van geëlektroporeerd cellen in de hersenschors, de ca een en dentate gyrus van de hippocampus terwijl type muizen werden geëlektroporeerd bij E 14.5, waar de GFP-constructie en hersenen werden geoogst op postnataal dag 14. Door een kleine hoeveelheid DNA-oplossing te injecteren, worden een paar cellen gelabeld, wat de visualisatie van de dendritische arborisatie van geïsoleerde GFP-positieve cellen mogelijk maakt, evenals hun stekels bij hogere vergroting. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om een kleine hoeveelheid DNA te injecteren om slechts enkele cellen te targeten, en om de schrijf- of neuro-spin te visualiseren en te kwantificeren.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol voor in utero elektroporatie van de hersenschors en hippocampus bij muizen op E14.5. Deze methode is waardevol voor het bestuderen van dendrieten en stekels in deze hersengebieden.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Ontwikkelingsbiologie
- Genetische manipulatie
Achtergrond
- Elektroporatie maakt visualisatie en genetische manipulatie van neuronen mogelijk.
- De techniek richt zich op specifieke hersengebieden tijdens de embryonale ontwikkeling.
- Het biedt voordelen boven traditionele knockout-muismodellen.
- In vivo-studies kunnen geninteracties onthullen die de ontwikkeling van dendrieten en stekels beïnvloeden.
Doel van het onderzoek
- Om dendrieten en stekels in de muizenhersenen te visualiseren en te manipuleren.
- Om de effecten van genexpressie en -onderdrukking te beoordelen.
- Om een snelle benadering te ontwikkelen voor het bestuderen van neuronale structuren.
Gebruikte methoden
- Injectie van plasmide-DNA in de laterale ventrikel van embryo's.
- Elektroporatie met behulp van elektroden om elektrische pulsen te leveren.
- Postnatale beoordeling van hersenstructuur en -functie.
- Visualisatie van dendrieten en stekels met behulp van confocale microscopie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle elektroporatie van de hersenschors en hippocampus.
- Visualisatie van dendritische arborisatie en stekels in GFP-positieve cellen.
- Demonstratie van de effectiviteit van de techniek voor in vivo-studies.
- Identificatie van geninteracties betrokken bij neuronale ontwikkeling.
Conclusies
- In utero elektroporatie is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van neuronale structuren.
- De methode maakt gerichte genetische manipulatie mogelijk in specifieke hersengebieden.
- Het biedt een snel alternatief voor traditionele genetische modificatietechnieken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
In utero electroporation (IUE) enables rapid, in vivo genetic manipulation and visualization of neuronal structures in the developing mouse brain, directly addressing the need for physiologically relevant models in early CNS drug discovery. This approach supports mechanistic de-risking and target validation by allowing precise temporal and spatial gene modulation in the cerebral cortex and hippocampus. IUE's flexibility accelerates hypothesis testing and portfolio triage for neurodevelopmental and synaptic function targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of gene function in neuronal development within native tissue environments.
- Supports functional target validation by permitting gain- and loss-of-function studies in specific brain regions and developmental windows.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing combinatorial gene manipulation in vivo.
- Accelerates predictive confidence for CNS target selection and triage.
Screening & Assay Development
- Prepares physiologically relevant neuronal systems for downstream phenotypic screening and quantitative imaging.
- Enables reproducible labeling of sparse neuronal populations for high-resolution dendrite and spine analysis.
- Supports assay standardization by providing consistent genetic delivery and expression in targeted brain regions.
- Improves screening readiness for compounds affecting synaptic structure or function.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with disease-relevant neuronal architecture and gene expression patterns.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting inducible gene modulation at defined developmental stages.
- Provides a platform for evaluating translational biomarkers of dendritic and synaptic integrity.
- Reduces risk of late-stage attrition by modeling gene function in vivo.
Pipeline & Workflow Integration
IUE integrates at the interface of early discovery and preclinical research, bridging in vitro findings with in vivo validation for CNS targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for genes regulating dendrite and spine development.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for comparative analysis of genetic or pharmacological interventions.
- Analytics: Enables high-content measurement of dendritic arborization and spine density in genetically defined neuronal populations.
- Translational Research: Facilitates alignment of preclinical models with human disease mechanisms by enabling precise temporal gene modulation.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable platform for rapid evaluation of multiple gene targets or combinations in the same experimental system.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Offers rapid, scalable, and standardized genetic manipulation compared to traditional knockout models.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling early in vivo functional assessment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of CNS programs based on robust in vivo data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic surgery, genetic construct design, and confocal imaging.
- Demands access to specialized instrumentation for microinjection, electroporation, and high-resolution microscopy.
- Necessitates cross-team standardization of DNA delivery, electroporation parameters, and imaging protocols.
- Adaptation may be needed for different mouse strains or developmental stages.
- Limited to accessible brain regions and developmental windows as supported by the protocol.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:49
Preparation: DNA Solution and Needles
2:10
Preparation: Surgery Before DNA Injection and Electroporation
3:25
Surgery: DNA Injection and Electroporation
5:01
Surgery: Post-surgical Evaluation and Tissue Processing
5:28
Representative Results
6:06
Conclusion
