Een kwantitatieve evaluatie van celmigratie door de Phagokinetic Track Motiliteit Assay
4 december 2012
De phagokinetic motiliteit spoor assay is een methode om de beweging van cellen te beoordelen. Met name de test meet chemokinesis (random celmotiliteit) in de tijd op een kwantitatieve wijze. De assay maakt gebruik van het vermogen van cellen om een meetbare spoor van de beweging van colloïdaal goud gecoate dekglaasjes maken.
Het algemene doel van deze procedure is om cellulaire mobiliteit kwantitatief te kunnen meten in de loop van de tijd met behulp van een op goudnanodeeltje gebaseerde celmobiliteitstest. Dit wordt bereikt door eerst glazen deksels voor te bereiden voor een coating van goudnanodeeltjes. Specifiek endotoxinevrije deksels worden bedekt met gelatine en vervolgens gebakken.
De tweede stap is het reduceren van chloro oric zuur, wat goudnanodeeltjes zal creëren en om de gelatinedekte deksels gelijkmatig te bedekken met de oplossing. Vervolgens worden de cellen geplaatst op de goudnanodeeltjecoatingdeksels voor de gewenste tijdsduur van de experimentcellen. Gaandeweg zal de gelatine goudnanodeeltjes verplaatsen en sporen creëren.
De laatste stap is het monitoren en kwantificeren van celmobiliteit met behulp van microscopie om de sporen gecreëerd door de bewegende cellen te beelden. Uiteindelijke oppervlaktemetingen van de sporen worden uitgevoerd met behulp van vrije beschikbare software. Een van de belangrijkste voordelen van deze techniek boven bestaande methoden, zoals time-lapse beeldvorming, is dat deze test alleen een standaard lichtmicroscoop, standaardcamera en vrije beschikbare beeldvormingssoftware vereist.
Bovendien staat de test ook eenvoudig de analyse en vergelijking van meerdere monsters toe met behulp van een methodist die geschikt is voor high-throughput screening. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de invloed van verschillende fysiologische factoren en celbeweging, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals studies naar de effecten van pathogenen op de mobiliteit van geïnfecteerde cellen. Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat de methode vereist dat men strikt de volumes en temperaturen volgt die in het protocol staan aangegeven.
In dit protocol wordt de nadruk gelegd op het beoordelen van de kleur van de uiteindelijke oplossing van geprecipiteerde goudnanodeeltjes om succes te garanderen. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang. Aangezien de stappen van de FGO kinetische spoormobiliteitstest moeilijk te leren zijn.
Ze bevatten verschillende procedures die niet vaak worden gebruikt in cellulaire en moleculaire biologielaboratoria. Om gelatinedekte deksels voor te bereiden, moet je eerst gelatine en gedeïoniseerd water opnieuw opschorten om de oplossing te maken met een uiteindelijke concentratie van 0,5 gram per 300 milliliter en vervolgens het mengsel gedurende 15 tot 30 minuten autoclaveren. Het is belangrijk om dit binnen twee uur na de toevoeging van de gelatine in een weefselcultuurkap te doen.
Bereid de deksels voor op coating door eerst acht tot negen met zuur gewassen deksels over te brengen naar een 100 millimeter plastic schaal. Zorg ervoor dat de deksels elkaar niet raken of de zijkanten van de schaal. Pipet voorzichtig twee tot drie druppels gelatine op elke deksel en vermijd overloop op de plaat.
Plaats vervolgens de schaal met de gelatinedekte deksels in een oven en bak gedurende 10 minuten op 90 graden Celsius. Verwijder na 10 minuten de schaal uit de oven en plaats deze terug in de weefselcultuurkap.
Pipet voorzichtig eventueel overtollig gelatine weg. Plaats de schaal terug in de oven en droog de deksels gedurende 45 minuten op 70 graden Celsius. Zodra de deksels droog zijn, verwijder de schaal uit de oven en plaats deze terug in de weefselcultuurkap.
Gebruik een steriele naald om voorzichtig een zijde van het deksel op te tillen. Gebruik vervolgens steriele pincetten om de gelatinedekte deksels uit de schaal te verwijderen en plaats ze in afzonderlijke putjes van een 24-putjesplaat. De volgende stap is het voorbereiden van colloïdaal goudbedekte deksels.
Begin met het voorbereiden van 10 milliliter 0,5% natriumcitraatoplossing werkend in een weefselcultuurkap, combineer 1,5 milliliter van de 14,5 millimolair chloro ORIC zuuroplossing en 13,5 milliliter autoclaaf gedeïoniseerd water in een steriele endotoxinevrije erlenmeyerkolf. Voor elke acht tot negen deksels zou het resultaat een lichtgele oplossing moeten opleveren. Chloro ORIC zuur is giftig en moet voorzichtig worden behandeld. Het is ook lichtgevoelig, dus de kookstap moet worden uitgevoerd in een omgeving met weinig licht.
Wanneer de oplossing zijn kookpunt heeft bereikt, haalt u de kolf van de hotplate en brengt u deze over naar een roerplaat. Om de colloïdale gouddeeltjes in oplossing te vormen, voegt u 0,7 milliliter van de 0,5% natriumcitraatoplossing per 15 milliliter van de chloro ORIC zuuroplossing toe terwijl u roert, blijf roeren gedurende ongeveer twee minuten. Gedurende deze tijd zal de oplossing veranderen van lichtgeel naar helder naar grijs naar paars naar diep paars.
Voordat het uiteindelijk een kleur rode wijn of bij voorkeur roest krijgt, trekt u de colloïdale goudoplossing in een 10 milliliterpipet en laat u de oplossing een tot twee minuten afkoelen in de pipet tot het kamertemperatuur bereikt. Voeg vervolgens 0,5 tot een milliliter toe bovenop de gelatinedekte deksels in de 24-putjesplaat. Plaats de 24-putjesplaat met de colloïdaal goudbedekte deksels in een incubator bij 37 graden Celsius en incubeer gedurende 30 minuten. Nadat de deeltjes de tijd hebben gehad om zich te settelen op de gelatinedekte deksels, controleert u hun dichtheid onder een lichtmicroscoop.
De juiste verdeling van goudnanodeeltjes helpt om de randen van zonnewagens eenvoudig en efficiënt te onderscheiden. De optimale dichtheid varieert met de celgrootte. Een concentratie van gouddeeltjes die te hoog is, belemmert het vermogen van cellen om te bewegen, terwijl een concentratie van goud, gouddeeltjes die te laag is, het vermogen beperkt om een nauwkeurig spoor van mobiliteit te bepalen.
Om deze reden moeten alleen deksels die in dezelfde batch zijn gemaakt of die zijn gekarakteriseerd om dezelfde dichtheid te hebben, samen worden gebruikt in individuele experimenten
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
De fagokinetische motiliteit-trackassay meet kwantitatief de beweging van cellen over een bepaalde tijd. Deze methode maakt gebruik van met goudnanodeeltjes gecoate dekglasjes om celmotiliteit te visualiseren via de vorming van tracks.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Cellulaire motiliteit
- Assay-ontwikkeling
- Nanodeeltjes-toepassingen
Achtergrond
- De assay beoordeelt chemokinese, oftewel willekeurige celbeweging.
- Goudnanodeeltjes maken de cellulaire beweging visueel traceerbaar.
- Endotoxine-vrije dekglasjes zijn essentieel voor nauwkeurige resultaten.
- Een gelatinecoating helpt bij de adhesie van goudnanodeeltjes.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor het kwantitatief meten van cellulaire motiliteit.
- Om goudnanodeeltjes te gebruiken voor het visualiseren van celbeweging.
- Om het begrip van celgedrag onder verschillende condities te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van glazen dekglasjes gecoat met gelatine.
- Creatie van goudnanodeeltjes door reductie van chlooraurinezuur.
- Coating van dekglasjes met een goudnanodeeltjesoplossing.
- Plaatsing van cellen op gecoate dekglasjes om beweging te observeren.
Belangrijkste resultaten
- Cellen creëren meetbare sporen op met goud gecoate oppervlakken.
- De assay maakt de observatie van willekeurige celmotiliteit mogelijk.
- Kwantitatieve gegevens kunnen in de loop van de tijd worden verzameld.
- Goudnanodeeltjes visualiseren cellulaire beweging effectief.
Conclusies
- De fagokinetische motiliteitsspoormethode is een betrouwbare methode voor het bestuderen van celmotiliteit.
- Goudnanodeeltjes verbeteren de visualisatie van cellulaire sporen.
- Deze assay kan worden toegepast op diverse onderzoeksgebieden die betrekking hebben op celbeweging.
Veelgestelde Vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
De fagokinetische track-motiliteitsassay biedt een kosteneffectieve, kwantitatieve methode voor het evalueren van cellulaire motiliteit met behulp van standaard laboratoriumapparatuur, waardoor een belangrijke flessenhals in vroege discovery-workflows wordt weggenomen. Door high-throughput analyse van celbewegingen mogelijk te maken zonder dure imagingsystemen, ondersteunt het de snelle screening van verbindingen of genetische perturbaties die de motiliteit beïnvloeden. Deze mogelijkheid vergroot het voorspellende vertrouwen in de fasen van targetvalidatie en lead-identificatie door reproduceerbare, mechanistisch relevante fenotypische gegevens te leveren.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken met betrekking tot celmigratiepaden bij kankermetastasering, immuunceltransport en wondgenezingsmodellen.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie door motiliteitsveranderingen na gene knockdown of farmacologische inhibitie te kwantificeren, waardoor mechanistische ambiguïteit wordt verminderd.
- Voorspellende waarde: Genereert kwantitatieve, statistisch robuuste motiliteitsmetrieken die helpen bij portfolio-triage en go/no-go-beslissingen op basis van fenotypische risicoreductie.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare metingen van het spooroppervlak die dienen als kwantitatieve uitdraaien voor assayontwikkeling en screeningcampagnes voor verbindingen.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van vrij beschikbare software voor beeldanalyse en standaard lichtmicroscopie, wat een schaalbare, kosteneffectieve implementatie binnen discoveryteams mogelijk maakt.
- Assay-gereedheid: Compatibel met diverse celtypen, waaronder kankercellen, fibroblasten, neutrofielen en monocyten, waardoor de toepasbaarheid in verschillende therapeutische gebieden wordt vergroot.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen motiliteitsobservaties in de ontdekkingsfase en preklinische validatie door het leveren van ziekterelateerde, kwantitatieve fenotypische gegevens.
- Mechanistische risicovermindering: Verheldert de rol van cytoskeletregulatoren en receptorsignalering bij celbeweging, wat bijdraagt aan de selectie van targets en de afstemming van biomarkers.
- Voorspellend vertrouwen: Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk door in vitro motiliteitsfenotypes te koppelen aan pathofysiologische processen, zoals tumorinvasie of infiltratie van immuuncellen.
Pipeline- & workflowintegratie
De assay past binnen het ontdekkingscontinuüm van vroege targetvalidatie via lead-identificatie tot preklinische evaluatie en biedt een herbruikbaar fenotypisch platform voor motiliteitsafhankelijke processen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van pathways door cellulaire motiliteit te kwantificeren als een functionele readout van genetische of farmacologische perturbaties.
- Screening: Maakt assay-standaardisatie en high-throughput compatibiliteit mogelijk via kwantificeerbare track-analyse en minimale apparatuureisen.
- Analytics: Levert kwantitatieve oppervlaktemetingen via freeware-tools, wat statistische vergelijking tussen condities en replica's faciliteert.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij preklinische continuïteit door motiliteitsgegevens te verschaffen die relevant zijn voor weefselontwikkeling, immuunbewaking en metastatisch potentieel.
- Bedrijfsmatige herbruikbaarheid: Functioneert als een schaalbare, projectoverschrijdende capaciteit in plaats van een eenmalige techniek, waardoor de ROI op investeringen in reagentia en training wordt gemaximaliseerd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit in celmigratiepaden te verminderen.
- Operationele waarde: Garandeert standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid door eenvoudige chemie, gestandaardiseerde protocollen en toegankelijke beeldanalyse.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming en kapitaalefficiëntie, en vermindert biologische risico's in een laat stadium door motiliteitsgerelateerde tekortkomingen vroegtijdig te identificeren.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering en voortgangsbeslissingen mogelijk op basis van kwantitatieve, fenotype-gestuurde motiliteitsprofielen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de bereiding van colloïdale nanodeeltjes en steriele weefselkweektechnieken om een consistente coating met goudnanodeeltjes te waarborgen.
- Is afhankelijk van toegang tot standaard lichtmicroscopie, incubatoren en freely available software voor beeldanalyse (bijv. ImageJ) voor de kwantificering van de tracks.
- Vereist cross-team standaardisatie van de bereiding van dekglasjes, de celdichtheid bij uitzaaien en de incubatietijden om de reproduceerbaarheid tussen laboratoria te garanderen.
- Vereist aanpassing van de dichtheid van de goudnanodeeltjes en de incubatieduur op basis van de celgrootte en motiliteitskenmerken om verstorende effecten door over- of ondercoating te voorkomen.
- Beperkt tot het beoordelen van chemokinese (willekeurige motiliteit); assays voor gerichte migratie kunnen aanvullende methoden vereisen, zoals microfluïdische of gradiëntgebaseerde systemen.
