Met behulp van de BLT Gehumaniseerd Muis als een Stem Cell gebaseerde Gene Therapy tumormodel

Het algemene doel van het volgende experiment is om muizen te genereren die een geëngend humaan immuunsysteem dragen. Dit wordt bereikt door eerst de muis voor te bereiden op een operatie en vervolgens de trocar in de tweede stap te beladen met een stukje thymus. Matrigel wordt gemengd met CD 34 negatieve en CD 34 positieve getransduceerde cellen, en het mengsel wordt vervolgens toegevoegd aan de trocar.

Vervolgens worden de matrigelconstructies getransplanteerd onder de niercapsule. Uiteindelijk kan de afstoting van de doeltumoren door de genetisch gemodificeerde CD acht T-cellen worden gemonitord door live pet-beeldvorming en fysische tumormetingen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals volledig neuronmodellen, is dat deze methode de studie van genetisch gemodificeerde menselijke stamcelontwikkeling binnen het menselijke thymus en daaropvolgend in vivo-effectiviteitsonderzoek van afgeleide lijnen mogelijk maakt. Dit zal worden gedaan door drie technici uit onze laboratoria: Gregory Bristol, Bernard Levin en Sean Kim.

In dit schematische diagram is het gemodificeerde BLT-model uiteengezet dat in deze studies wordt gebruikt voor de generatie van chimere muizen die mart dragen, één specifieke T-cellen. De th-implantaat wordt gereconstrueerd uit getransduceerde en niet-getransduceerde CD 34-cellen geïsoleerd uit een autoloog foetaal lever. Een fractie van de getransduceerde cellen wordt vervolgens ingevroren en vier tot zes weken later in de bestraalde muizen geïnjecteerd.

In deze video wordt de implantatie van de th-levende constructie gedemonstreerd zodra de dieren slaperig zijn geworden door de anesthesie. Begin met het scheren van de linkerkant van elke muis van heup tot schouder tussen het midden van de rug en de buik. Na het opnemen van het gewicht van elk dier, prik hun oren voor nummering en injecteer subcutaan 0,3 milliliter carprofen in elk van hun schouders.

Leg de muizen vervolgens op hun rechterzij gericht naar links. Spoel nu de trocar van een 16 gauge kanker-implantaatnaald met een ronde vijltip met PBS. Gebruik een tang met een platte punt om een stukje thymus toe te voegen aan de schaal met PBS en houd de trocar vervolgens horizontaal met de staaf.

Aspiseer net binnen de punt het weefsel. Het verschuiven van de trocar onder de niercapsule en het injecteren van het weefsel is een van de meest uitdagende aspecten van deze procedure. Vraag vervolgens om hulp.

Gebruik een einde of een positieve verplaatsingspijp om vijf microliters koude matrigel te mengen in één buis met cellen met zacht roeren. Houd de trocar horizontaal. Trek langzaam terug op de staaf terwijl de hulp de matri gel pipet.

Meng in de trocar voor elke muis. Veeg eerst de kale huid van het dier af met Betadine en veeg het vervolgens af met een isopropanoldoek. Bepaal twee keer de donkerste plek onder de huid, die de locatie van de milt aangeeft.

De nier wordt ongeveer vijf millimeter dorsaal van de milt gevonden door met stompe pincetten de huid over de nier op te pakken. Maak een snede van ongeveer 15 millimeter lang in de huid parallel aan de milt. Maak een vergelijkbare snede in de peritoneum spierlaag eronder.

Bij mannetjes zou de nier direct zichtbaar moeten zijn. Knijp eenvoudig in de buik om het eruit te laten vallen. Houd bij vrouwtjes met de linkerhand druk op de buik om de nier bloot te houden en gebruik eerst een hemostaat om de eierstok op te pakken en trek vervolgens de nier eruit om het orgaan buiten het lichaam te houden.

Pluk een klein gaatje in het achterste uiteinde van de niercapsule en schuif vervolgens de trocar in dit gaatje en langs de nier tot het mondstuk van de trocar volledig bedekt is door de niercapsule. Injecteer vervolgens met de pink van de rechterhand het weefsel. Gebruik nu de gesloten hemostaat om voorzichtig de nier terug op zijn plaats te duwen.

Bind een steek in het peritoneum met een dubbele strik, knijp de huid als een zak op en plaats het vervolgens in twee wondclips. Plaats ten slotte een druppel PBS op elk oog en leg de muis op zijn zij in een kooi boven een beetje beddengoed. Nadat alle muizen op dezelfde manier zijn geïmplanteerd, bevestig dat de dieren weer op hun buik liggen voordat u ze verlaat.

Deze eerste figuur toont een representatieve afbeelding van de THI-levende implantaat in gehumaniseerde muizen. In deze figuur wordt de normale ontwikkeling van het thymische weefsel en de fysiologische weefselverdeling van de humane CD vier en CD acht positieve T gedemonstreerd. Na reconstititutie dragen de dieren een humaan immuunsysteem met een normale verdeling van CD vier en CD acht positieve T-cellen.

Hier wordt een representatieve afbeelding van een muis die een melanoomtumor draagt, getoond. De grijze gebieden geven de CT-scanafbeelding aan. De gekleurde gebieden geven de metabolische activiteit van de tumor aan zoals gedetecteerd door de PET-scan.

De CT-scan alleen in dit experiment gaf een grote tumormassa aan in het gebied dat wordt aangegeven door de witte cirkel. Echter, zoals de in vivo PET-beeldvorming illustreert, bestaat dit gebied voornamelijk uit necrotisch en littekenweefsel, wat de nuttigheid van PET-beeldvorming als een gevoeligere en nauwkeuriger manier om tumorregressie en clearantie te beoordelen, onderstreept. Na deze procedure kunnen andere assays zoals T-cel, fenotypering en ex vivo activering worden uitgevoerd om vragen relevant voor T-celfunctie te beantwoorden.