Heterotypische Driedimensionale In Vitro Modellering van Stroma-epitheliale interacties tijdens eierstokkanker initiatie en progressie
28 augustus 2012
We beschrijven methoden voor het vaststellen In vitro Heterotypische driedimensionale modellen die ovarian fibroblasten en normale ovarium oppervlak of eierstokkanker epitheelcellen. We bespreken het gebruik van deze modellen stroma-epitheliale interacties die plaatsvinden tijdens eierstokkanker ontwikkeling te bestuderen.
Het algemene doel van het volgende experiment is om driedimensionale typische modellen van de vroege ontwikkeling van eierstokkanker te genereren. Eerst worden H turt geïmmortaliseerde cellijnen gegenereerd die zijn afgeleid van primaire, normale eierstokklier- en fibroblastweefsels. Vervolgens worden de in vivo architectuur en complexe cel-cel-interacties die aanwezig zijn in de eierstok gecocultiveerd, epitheel- en stromale cellijnen in driedimensionale S sferische modellen geplaatst om de expressie van specifieke markers te analyseren om moleculaire kenmerken van stromale epitheelinteracties te bestuderen.
De verkregen resultaten laten zien hoe veranderingen in het stromale celcompartiment van 3D typische modellen het fenotype van gecocultiveerde epitheliale cellen kunnen beïnvloeden. Driedimensionale typische modellen kunnen helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in het veld van eierstokkankeronderzoek, zoals het verkennen van de oorsprong van deze ziekte en het verduidelijken van de rol van de stromale micro-omgeving bij tumorinitiatie en ontwikkeling. Toepassingen van deze technieken strekken zich uit tot ziektediagnose en therapie in vergelijking met andere 3D-kweekmethoden.
Deze techniek kan worden toegepast op een breder scala aan celkweekvolumes en downstream-toepassingen. Bijvoorbeeld, 3D homo en typische culturen kunnen worden gebruikt voor in vitro geneesmiddeltesten. Deze aanpak kan ook worden toegepast op andere modelsystemen, zoals in de studie van andere soorten solide tumoren of bij goedaardige ziekten.
Breng het verse eierstokweefsel naar het celkweeklaboratorium in geïmmortaliseerd normaal eierstokkliergroeimedium dat is aangevuld met extra antibiotica en antiks. Was het monster drie keer met vijf milliliter PBS om eventueel losjes aan het weefsel gehechte epitheelcellen te verwijderen. Breng vervolgens het monster plus PBS over in een schone P 100 kweekschaal. Gebruik steriele instrumenten om het weefsel over te brengen naar een tweede droge P 100 schone kweekschaal.
Snijd het weefsel in stukken van 0,5 vierkante centimeter en breng elk stuk over in een afzonderlijke P 100-schaal. Blijf het weefsel snijden in stukken van minder dan één vierkante millimeter. Voeg vervolgens 20 milliliter INOF GM-medium toe en kweek. Monitor voor celgroei met behulp van fasecontrastmicroscopie.
Bevestig dat de cellen binnen 24 uur aan de schaal hechten. Monitor voor celgroei met behulp van fasecontrastmicroscopie Cellen hechten meestal binnen 24 uur. Na een week. Verwijder eventueel niet-aangevoerd weefsel door aspiratie, vul het medium aan en voer vervolgens de culturen twee keer per week gedurende één tot drie weken bij wanneer celkolonies ongeveer 500 micron groot zijn.
Isoleer de klonen met behulp van trips en gecoate kloneringschijven. Om te bevestigen dat 100% fibroblastische cellen aanwezig zijn. Plateer een monster van de cellijn op glazen dekglasjes en voer immunofluorescente kleuring uit voor een fibroblastische marker, een epitheelmarker en een endotheelcelmarker.
Een dag voorafgaand aan retrovirale transductie van H Turt passage, de normale eierstokkliercelisolaten van een enkele P 100 schaal in drie P 100 schalen. Vooraf gemaakte virale sup natan kan worden gekocht of in eigen beheer worden geproduceerd volgens standaardprotocollen voor cot transfectie van HEC 2 9 3 T cellen. Om de poly Hema-oplossing voor te bereiden, weeg 1,5 gram poly hema af en plaats in een steriele fles.
Voeg 95 milliliter moleculaire biologie, graad, absolute ethanol en vijf milliliter celkweekkwaliteit gedestilleerd water toe. Plaats de poly Hema-oplossing in een waterbad op 65 graden Celsius tot het volledig is opgelost. Bedek de weefselkweekschalen met vers gemaakte poly Hema-oplossing.
Laat de celkweekschalen binnen de laminare stroomkap drogen. Zacht wiegen op een wiegplatform kan worden gebruikt om een gelijkmatige coating van grotere schalen of flessen te garanderen. Als de polyus-oplossing te snel droogt, zal het oppervlak niet glad zijn.
Indien gewenst, kan voorafgaande behandeling van de fibroblasten vóór 3D-kweek worden uitgevoerd, bijvoorbeeld voor inductie van senescentie, voorafgaande behandeling van de cellen met sub-letale doses waterstofperoxide. Herstel en breid de INOF en epitheelcelculturen in vitro uit om voldoende cellen te bereiden voor het vaststellen van 3D heterotope steroïden. Na een vijf minuten durende PBS-was, voeg 15 milliliter medium toe aan de poly hema plaat.
Ondertussen, voeg trypsine toe aan de geïmmortaliseerde normale eierstokklierfibroblastcellen om ze los te maken van de kweekschaal. Neutraliseer na drie tot vijf minuten het trypsine met een gelijk volume kweekmedium en oogst de cellen door centrifugatie. Suspensieer het celpellet in vijf milliliter medium en meng goed door te pipetteren op en neer of voorzichtig te vortexen.
Gebruik vervolgens een 10 microliter monster om via trian blauw het aantal levensvatbare cellen te bepalen. Voeg nu 4 miljoen INOF-cellen toe aan het medium dat al is uitgedeeld in de poly hema-gecoate plaat. Breng het kweekmediumvolume op 20 milliliter en incubeer bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide.
Monitor de cellulaire aggregatie in multicellulaire steroïden door fasecontrastmicroscopie om de S sferische culturen elke twee tot drie dagen bij te vullen. Laat de platen op een hoek op een pipette rusten. Laat de sferen bezinken en verwijder voorzichtig ongeveer 16 milliliter van het uitgeputte medium met een vijf milliliter pipette.
Voeg 16 milliliter vers medium toe aan de cultuur en breng terug naar de incubator Op dag zeven. Maak heterotypische culturen door epitheliale cellen toe te voegen aan de fibroblasten phe. Bereid eerst suspensies van ovarieklierepitheliale cellen door trypsine zoals eerder beschreven na het tellen van cellen.
Was eenmaal in INOF GM-medium om te voorkomen dat groeifactoren worden overgedragen vanuit het epitheliale groeimedium. Voeg de epitheliale cellen toe met een verhouding van vier tot één fibroblasten naar epitheliale cellenkweek. De heterotope OIDs in INOF GM-voedingstypic culturen gedurende twee tot drie dagen gedurende een aanvullende 14 da
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie beschrijft methodologieën voor het creëren van in vitro heterotypische driedimensionale modellen die ovariële fibroblasten combineren met normale ovariële oppervlakte- of ovariële kanker-epitheelcellen. Deze modellen worden gebruikt om de stromale-epitheliale interacties te onderzoeken die een cruciale rol spelen bij de ontwikkeling van ovariële kanker.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Ovariële kankeronderzoek
- Celbiologie
- Driedimensionale celkweek
Achtergrond
- Het begrijpen van de interacties tussen stromale en epitheliale cellen is essentieel voor ovariële kankeronderzoek.
- Driedimensionale modellen bootsen de in vivo-omgeving beter na vergeleken met traditionele tweedimensionale culturen.
- Deze modellen kunnen inzichten bieden in tumorinitiatie en -progressie.
- De stromale micro-omgeving speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van kanker.
Doel van het onderzoek
- Om driedimensionale modellen van vroegstadium ovariële kanker te genereren.
- Om de effecten van stromale celveranderingen op epitheliale celfenotypen te bestuderen.
- Om de oorsprong van ovariële kanker en de rol van de stromale micro-omgeving te verkennen.
Gebruikte methoden
- Creatie van geïmmortaliseerde cellijnen uit primaire ovariële weefsels.
- Co-cultuur van epitheliale en stromale cellijnen in driedimensionale sferoïde modellen.
- Fixatie en kleuring van organoïdculturen.
- Analyse van specifieke markerexpressie om moleculaire kenmerken te bestuderen.
Belangrijkste resultaten
- Veranderingen in het stromale celcompartiment beïnvloeden het fenotype van mede-gecultiveerde epitheliale cellen.
- Driedimensionale modellen bieden waardevolle inzichten in de biologie van ovariële kanker.
- Deze technieken hebben potentiële toepassingen in ziektediagnose en -therapie.
- Resultaten benadrukken het belang van de stromale micro-omgeving in tumorontwikkeling.
Conclusies
- Driedimensionale typic modellen zijn effectief voor het bestuderen van ovariële kanker.
- Ze kunnen helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen over ziektemechanismen.
- Verder onderzoek met behulp van deze modellen kan therapeutische strategieën verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding stromal-epithelial interactions is critical for de-risking ovarian cancer target validation and improving predictive confidence in early discovery. Three-dimensional heterotypic models enable mechanistic interrogation of microenvironmental influences on epithelial transformation, supporting hypothesis-driven target identification. This approach addresses a key inflection point in oncology R&D where stromal-mediated resistance and initiation mechanisms remain poorly characterized.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogate therapeutic hypotheses by modeling how stromal senescence promotes neoplastic features in partially transformed epithelial cells.
- Operational Value: Establish reproducible co-culture systems that restore histological features undetectable in monolayer cultures, improving target validation fidelity.
- Predictive Value: Enable phenotypic screening of epithelial-stromal crosstalk to prioritize targets with microenvironment-dependent activity.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generate standardized 3D spheroid models for quantitative analysis of marker expression (e.g., MIM1, pan-cytokeratin) to support compound screening.
- Scalability: Adapt heterotypic culture workflows to multi-well formats for dose-response testing of stromal-modulating agents.
- Reproducibility: Use defined epithelial-to-stromal ratios (4:1) and standardized refeeding schedules to minimize variability across screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Model early-stage ovarian cancer initiation by co-culturing CMYC-overexpressed IOSE cells with INOF fibroblasts to study stromal-driven progression.
- Translational Continuity: Link discovery-phase stromal modulation observations to preclinical validation through histopathological readouts restored in 3D but absent in 2D.
- Mechanistic De-risking: Clarify bidirectional signaling pathways in 3D core culture microenvironments to reduce ambiguity in target mechanism of action.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a disease-relevant system for stromal-target hypothesis testing prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of stromal microenvironment effects on epithelial transformation and invasion phenotypes.
- Screening: Enables assay development for compounds targeting stromal-epithelial interactions using quantifiable marker expression as a primary readout.
- Analytics: Facilitates comparative analysis of epithelial phenotypes under normal versus senescent stromal conditions to inform target selection.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical work by restoring in vivo-like histological features critical for validating stromal-targeted mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a adaptable platform for studying stromal-epithelial dynamics across solid tumor types beyond ovarian cancer.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in ovarian cancer target validation by modeling stromal influences on epithelial neoplasia.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible 3D culture systems compatible with downstream immunofluorescence and flow cytometry workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying targets whose efficacy depends on stromal context, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of stromal-modulating agents based on phenotypic outcomes in heterotypic models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation, immortalization via hTERT transduction, and 3D spheroid culture techniques.
- Depends on access to poly-HEMA coating equipment, low-attachment surfaces, and standardized media formulations (INOF GM).
- Necessitates cross-team standardization of cell ratio preparation, refeeding schedules, and fixation protocols for consistent results.
- Involves adaptation considerations when extending to other tumor types due to tissue-specific stromal-epithelial signaling requirements.
- Limited by the need for specialized microscopy and staining protocols to detect restored histological features absent in monolayer controls.
