Heterotypische Driedimensionale In Vitro Modellering van Stroma-epitheliale interacties tijdens eierstokkanker initiatie en progressie
28 augustus 2012
We beschrijven methoden voor het vaststellen In vitro Heterotypische driedimensionale modellen die ovarian fibroblasten en normale ovarium oppervlak of eierstokkanker epitheelcellen. We bespreken het gebruik van deze modellen stroma-epitheliale interacties die plaatsvinden tijdens eierstokkanker ontwikkeling te bestuderen.
Het algemene doel van het volgende experiment is om driedimensionale typische modellen van de vroege ontwikkeling van eierstokkanker te genereren. Eerst worden H turt geïmmortaliseerde cellijnen gegenereerd die zijn afgeleid van primaire, normale eierstokklier- en fibroblastweefsels. Vervolgens worden de in vivo architectuur en complexe cel-cel-interacties die aanwezig zijn in de eierstok gecocultiveerd, epitheel- en stromale cellijnen in driedimensionale S sferische modellen geplaatst om de expressie van specifieke markers te analyseren om moleculaire kenmerken van stromale epitheelinteracties te bestuderen.
De verkregen resultaten laten zien hoe veranderingen in het stromale celcompartiment van 3D typische modellen het fenotype van gecocultiveerde epitheliale cellen kunnen beïnvloeden. Driedimensionale typische modellen kunnen helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in het veld van eierstokkankeronderzoek, zoals het verkennen van de oorsprong van deze ziekte en het verduidelijken van de rol van de stromale micro-omgeving bij tumorinitiatie en ontwikkeling. Toepassingen van deze technieken strekken zich uit tot ziektediagnose en therapie in vergelijking met andere 3D-kweekmethoden.
Deze techniek kan worden toegepast op een breder scala aan celkweekvolumes en downstream-toepassingen. Bijvoorbeeld, 3D homo en typische culturen kunnen worden gebruikt voor in vitro geneesmiddeltesten. Deze aanpak kan ook worden toegepast op andere modelsystemen, zoals in de studie van andere soorten solide tumoren of bij goedaardige ziekten.
Breng het verse eierstokweefsel naar het celkweeklaboratorium in geïmmortaliseerd normaal eierstokkliergroeimedium dat is aangevuld met extra antibiotica en antiks. Was het monster drie keer met vijf milliliter PBS om eventueel losjes aan het weefsel gehechte epitheelcellen te verwijderen. Breng vervolgens het monster plus PBS over in een schone P 100 kweekschaal. Gebruik steriele instrumenten om het weefsel over te brengen naar een tweede droge P 100 schone kweekschaal.
Snijd het weefsel in stukken van 0,5 vierkante centimeter en breng elk stuk over in een afzonderlijke P 100-schaal. Blijf het weefsel snijden in stukken van minder dan één vierkante millimeter. Voeg vervolgens 20 milliliter INOF GM-medium toe en kweek. Monitor voor celgroei met behulp van fasecontrastmicroscopie.
Bevestig dat de cellen binnen 24 uur aan de schaal hechten. Monitor voor celgroei met behulp van fasecontrastmicroscopie Cellen hechten meestal binnen 24 uur. Na een week. Verwijder eventueel niet-aangevoerd weefsel door aspiratie, vul het medium aan en voer vervolgens de culturen twee keer per week gedurende één tot drie weken bij wanneer celkolonies ongeveer 500 micron groot zijn.
Isoleer de klonen met behulp van trips en gecoate kloneringschijven. Om te bevestigen dat 100% fibroblastische cellen aanwezig zijn. Plateer een monster van de cellijn op glazen dekglasjes en voer immunofluorescente kleuring uit voor een fibroblastische marker, een epitheelmarker en een endotheelcelmarker.
Een dag voorafgaand aan retrovirale transductie van H Turt passage, de normale eierstokkliercelisolaten van een enkele P 100 schaal in drie P 100 schalen. Vooraf gemaakte virale sup natan kan worden gekocht of in eigen beheer worden geproduceerd volgens standaardprotocollen voor cot transfectie van HEC 2 9 3 T cellen. Om de poly Hema-oplossing voor te bereiden, weeg 1,5 gram poly hema af en plaats in een steriele fles.
Voeg 95 milliliter moleculaire biologie, graad, absolute ethanol en vijf milliliter celkweekkwaliteit gedestilleerd water toe. Plaats de poly Hema-oplossing in een waterbad op 65 graden Celsius tot het volledig is opgelost. Bedek de weefselkweekschalen met vers gemaakte poly Hema-oplossing.
Laat de celkweekschalen binnen de laminare stroomkap drogen. Zacht wiegen op een wiegplatform kan worden gebruikt om een gelijkmatige coating van grotere schalen of flessen te garanderen. Als de polyus-oplossing te snel droogt, zal het oppervlak niet glad zijn.
Indien gewenst, kan voorafgaande behandeling van de fibroblasten vóór 3D-kweek worden uitgevoerd, bijvoorbeeld voor inductie van senescentie, voorafgaande behandeling van de cellen met sub-letale doses waterstofperoxide. Herstel en breid de INOF en epitheelcelculturen in vitro uit om voldoende cellen te bereiden voor het vaststellen van 3D heterotope steroïden. Na een vijf minuten durende PBS-was, voeg 15 milliliter medium toe aan de poly hema plaat.
Ondertussen, voeg trypsine toe aan de geïmmortaliseerde normale eierstokklierfibroblastcellen om ze los te maken van de kweekschaal. Neutraliseer na drie tot vijf minuten het trypsine met een gelijk volume kweekmedium en oogst de cellen door centrifugatie. Suspensieer het celpellet in vijf milliliter medium en meng goed door te pipetteren op en neer of voorzichtig te vortexen.
Gebruik vervolgens een 10 microliter monster om via trian blauw het aantal levensvatbare cellen te bepalen. Voeg nu 4 miljoen INOF-cellen toe aan het medium dat al is uitgedeeld in de poly hema-gecoate plaat. Breng het kweekmediumvolume op 20 milliliter en incubeer bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide.
Monitor de cellulaire aggregatie in multicellulaire steroïden door fasecontrastmicroscopie om de S sferische culturen elke twee tot drie dagen bij te vullen. Laat de platen op een hoek op een pipette rusten. Laat de sferen bezinken en verwijder voorzichtig ongeveer 16 milliliter van het uitgeputte medium met een vijf milliliter pipette.
Voeg 16 milliliter vers medium toe aan de cultuur en breng terug naar de incubator Op dag zeven. Maak heterotypische culturen door epitheliale cellen toe te voegen aan de fibroblasten phe. Bereid eerst suspensies van ovarieklierepitheliale cellen door trypsine zoals eerder beschreven na het tellen van cellen.
Was eenmaal in INOF GM-medium om te voorkomen dat groeifactoren worden overgedragen vanuit het epitheliale groeimedium. Voeg de epitheliale cellen toe met een verhouding van vier tot één fibroblasten naar epitheliale cellenkweek. De heterotope OIDs in INOF GM-voedingstypic culturen gedurende twee tot drie dagen gedurende een aanvullende 14 da
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie beschrijft methodologieën voor het creëren van in vitro heterotypische driedimensionale modellen waarin ovariumfibroblasten worden opgenomen naast normale epitheelcellen van het ovariumoppervlak of ovariumkankerepitheelcellen. Deze modellen worden gebruikt om de stromale-epitheliale interacties te onderzoeken die een kritische rol spelen bij de ontwikkeling van ovariumkanker.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Ovariumkankeronderzoek
- Celbiologie
- Driedimensionale celkweek
Achtergrond
- Het begrijpen van de interacties tussen stromale en epitheliale cellen is essentieel voor onderzoek naar eierstokkanker.
- Driedimensionale modellen bootsen de in vivo-omgeving beter na dan traditionele tweedimensionale culturen.
- Deze modellen kunnen inzicht bieden in het ontstaan en de progressie van tumoren.
- De stromale micro-omgeving speelt een belangrijke rol bij de ontwikkeling van kanker.
Doel van de studie
- Om driedimensionale modellen van eierstokkanker in een vroeg stadium te genereren.
- Om de effecten van veranderingen in stromale cellen op epitheelcel-fenotypes te bestuderen.
- Om de oorsprong van eierstokkanker en de rol van de stromale micro-omgeving te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Creatie van geïmmortaliseerde cellijnen uit primaire eierstofweefsels.
- Co-cultuur van epitheliale en stromale cellijnen in driedimensionale sferoïde-modellen.
- Fixatie en kleuring van organoïde-culturen.
- Analyse van specifieke marker-expressie om moleculaire kenmerken te bestuderen.
Belangrijkste resultaten
- Wijzigingen in het stromale celcompartiment beïnvloeden het fenotype van geco-cultureerde epitheelcellen.
- Driedimensionale modellen bieden waardevolle inzichten in de biologie van eierstokkanker.
- Deze technieken hebben potentiële toepassingen in de diagnose en therapie van ziekten.
- De resultaten benadrukken het belang van de stromale micro-omgeving bij tumorontwikkeling.
Conclusies
- Driedimensionale typische modellen zijn effectief voor het bestuderen van eierstokkanker.
- Ze kunnen helpen bij het beantwoorden van kritische vragen over ziektemechanismen.
- Verder onderzoek met gebruik van deze modellen kan therapeutische strategieën verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Het begrijpen van stromaal-epitheliale interacties is cruciaal voor het verminderen van risico's bij de validatie van targets voor eierstokkanker en het verbeteren van het voorspellend vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase. Driedimensionale heterotypische modellen maken mechanische analyse mogelijk van micro-omgevingsinvloeden op epitheliale transformatie, wat hypothese-gestuurde targetidentificatie ondersteunt. Deze benadering pakt een cruciaal omslagpunt aan in oncologisch R&D, waar stromaal-gemedieerde resistentie- en initiatiemechanismen nog onvoldoende gekarakteriseerd zijn.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoek therapeutische hypothesen door te modelleren hoe stromale senescentie neoplastische kenmerken bevordert in gedeeltelijk getransformeerde epitheliale cellen.
- Operationele waarde: Vestig reproduceerbare co-cultuursystemen die histologische kenmerken herstellen die ondetecteerbaar zijn in monoculturen, waardoor de getrouwheid van targetvalidatie wordt verbeterd.
- Voorspellende waarde: Maak fenotypische screening van epitheliale-stromale crosstalk mogelijk om targets met micro-omgevingsafhankelijke activiteit te prioriteren.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereer gestandaardiseerde 3D-sferoïde-modellen voor kwantitatieve analyse van markerexpressie (bijv. MIM1, pan-cytokeratine) ter ondersteuning van compound-screening.
- Schaalbaarheid: Pas heterotypische cultuurworkflows aan naar multi-well-formaten voor dosis-respons-testen van stroomaal-modulerende agentia.
- Reproduceerbaarheid: Gebruik gedefinieerde epitheliale-tot-stromale ratio's (4:1) en gestandaardiseerde voedingsschema's om variabiliteit tussen screeningcampagnes te minimaliseren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor de ziekte: Modelleer de initiatie van eierstokkanker in een vroeg stadium door CMYC-overexpresserend IOSE-cellen samen te kweken met INOF-fibroblasten om stroma-gestuurde progressie te bestuderen.
- Translationele continuïteit: Koppel observaties van stromale modulatie uit de ontdekkingsfase aan preklinische validatie via histopathologische read-outs die in 3D zijn hersteld maar in 2D ontbreken.
- Mechanische risicoreductie: Verduidelijk bidirectionele signaleringspaden in 3D-kerncultuurmicro-omgevingen om ambiguïteit over het doelmechanisme van actie te verminderen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode kan worden geïntegreerd in vroege discovery-workflows door een ziekterelevant systeem te bieden voor het testen van hypothesen over stromale targets vóór de identificatie van lead-verbindingen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing van de effecten van de stromale micro-omgeving op epitheliale transformatie en invasie-fenotypes.
- Screening: Maakt assay-ontwikkeling mogelijk voor verbindingen die gericht zijn op stromale-epitheliale interacties, met kwantificeerbare merker-expressie als primaire readout.
- Analytiek: Faciliteert vergelijkende analyse van epitheliale fenotypes onder normale versus senescente stromale condities om doelwitselectie te informeren.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen ontdekkingsfase en preklinisch werk door in vivo-achtige histologische kenmerken te herstellen, wat essentieel is voor het valideren van stromaal-gerichte mechanismen.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Vestigt een aanpasbaar platform voor het bestuderen van stromale-epitheliale dynamiek in diverse solide tumortypen buiten eierstokkanker.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van targets voor eierstokkanker door stroma-invloeden op epitheliale neoplasie te modelleren.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare 3D-culturesystemen die compatibel zijn met downstream-workflows voor immunofluorescentie en flowcytometrie.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door targets te identificeren waarvan de effectiviteit afhankelijk is van de stromale context, waardoor het risico op falen in een laat stadium wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van stroma-modulerende middelen mogelijk op basis van fenotypische resultaten in heterotypische modellen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in primaire celisolatie, immortalisatie via hTERT-transductie en 3D-sferoïdkweektechnieken.
- Is afhankelijk van toegang tot poly-HEMA-coatingsapparatuur, oppervlakken met lage adhesie en gestandaardiseerde mediumformuleringen (INOF GM).
- Maakt cross-team standaardisatie van celratio-voorbereiding, voedingsschema's en fixatieprotocollen noodzakelijk voor consistente resultaten.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij uitbreiding naar andere tumortypen vanwege weefselspecifieke stromale-epitheliale signaleringsvereisten.
- Wordt beperkt door de noodzaak van gespecialiseerde microscopie en kleuringsprotocollen om herstelde histologische kenmerken te detecteren die afwezig zijn in monolayer-controles.
