Onderscheidende functionele rol van genexpressie van immune als niet-immune cellen in de muis Colitis door beenmergtransplantatie
1 oktober 2012
Beenmergtransplantatie geeft een manier om het genotype van het beenmerg afgeleide cellen. Als het gen van interesse tot expressie wordt gebracht in zowel van beenmerg afgeleide cellen en niet-beenmerg afgeleide cellen kan beenmergtransplantatie wijzigen beenmerg afgeleide cellen een ander genotype zonder de niet-beenmerg cellen genotype.
Het algemene doel van het experiment dat in deze video wordt gedemonstreerd, is om te beoordelen of het antimicrobiële peptide lyin een rol speelt bij de verbetering van door dextransulfaat geïnduceerde colitis bij muizen. Dit wordt bereikt door beenmerg van wildtype-muizen te injecteren in bestraalde licit- en knockout-muizen en beenmerg van knockout-muizen in bestraalde wildtype-muizen. Het getransplanteerde beenmerg zal nieuwe bloedcellen genereren bij de ontvanger van het donorgenotype.
De ontvangende muizen worden vervolgens na vier weken blootgesteld aan dextransulfaat om colitis te induceren. Succesvolle transplantatie wordt gevalideerd door middel van flowcytometrie en schade aan het darmslijmvlies wordt beoordeeld door middel van histologie. Resultaten worden verkregen die laten zien dat colitis wordt verbeterd wanneer wildtype-beenmerg wordt getransplanteerd in knockout-muizen.
Omgekeerd wordt colitis verergerd wanneer knockout-beenmerg wordt getransplanteerd in wildtype-muizen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen bij het bepalen van de genexpressie van beenmergafgeleide cellen of niet-beenmergafgeleide cellen bij ontsteking of infectie. C 57, black six, wild type en C geïnduceerde knockout-muizen worden aanbevolen voor dit experiment om het mogelijk te maken de wildtype-muizen en knockout-muizen te volgen.
Donorcellen na beenmergtransplantatie. Gebruik CD 45.1-muizen om wildtype-muizen voor te stellen en CD 45.2 voor de knockout-muizen. De hier getoonde grafiek beschrijft de experimentele opzet waarbij vijf donormuizen en 10 ontvangermuizen voor elke groep worden toegewezen.
Voor groepen A en B zal beenmerg worden getransplanteerd van de wildtype-muizen naar de knockout-muizen. Colitis zal worden geïnduceerd in groep A, maar niet in groep B. Voor groep C en D. Beenmerg zal worden getransplanteerd van de knockout-muizen naar de wildtype en colitis zal worden geïnduceerd in groep C alleen voor E en F. De transplantatie zal zijn van wildtype naar wildtype en voor groepen G en H zal de transplantatie zijn van knockout naar knockout. Om donorbeenmerg voor overdracht naar bestraalde muizen voor te bereiden, begint u met het extraheren van beenmerg uit de botten van geslachte muizen in een bioveiligheidskast.
Gebruik steriele dissectie-instrumenten om het opperarmbeen, dijbeen, scheenbeen en kuitbeen bloot te leggen, vrij van aangehechte spieren en ligamenten, en breng ze over naar een petrischaal. Snijd beide uiteinden van de botten open om het rode beenmerg te laten zien. Grijp vervolgens een van de botten met een pincet.
Spoel het rode beenmerg uit met koud PBS met een drie milliliterspuit en 25 gauge naalden naar een andere petrischaal. Spoel vervolgens het bot vanuit het andere uiteinde om meer beenmergcellen te verkrijgen. Herhaal dit proces met elk van de botten.
Verzamel het beenmerg van wildtype en knockout-muizen afzonderlijk. Gebruik een zes milliliterspuit met een 18 gauge halve inch naald om rode beenmergplukken te breken door herhaald afzuiging en uitdrijving. Gebruik vervolgens een serologische pipette om het verzamelde beenmerg over te brengen naar een 50 milliliter conische buis.
Zodra al het beenmerg is overgebracht, centrifugeer het beenmerg gedurende vijf minuten bij 740 G bij vier graden Celsius. Gooi na het centrifugeren de supernatant weg en resuspendeer de pellet door vijf tot 10 seconden te vortexen. Voeg aan de pellet vijf milliliter van een XRBC-lysebuffer per donormuis toe en vortex opnieuw gedurende vijf seconden en incubeer gedurende exact drie minuten bij kamertemperatuur.
Na drie minuten voegt u 20 milliliter koud PBS toe aan elke buis en mengt u door middel van inversie om de lyse te stoppen. Giet vervolgens de inhoud door een 40 micron celsifter in een nieuwe 50 milliliter conische buis. Spoel de originele buis af met vijf milliliter PBS en breng de oplossing over naar de celsifter.
Ga door met het verzamelen van de doorstroming in de conische buis. Breng vervolgens het volume op 50 milliliter aan met PBS en meng door middel van inversie. Bepaal vervolgens het aantal levensvatbare cellen door middel van trian blauwe exclusie met behulp van een hemo cytometer.
Zodra het celtelling is bepaald, centrifugeer de beenmergcellen gedurende vijf minuten bij 913 maal G bij vier graden Celsius. Gooi na het centrifugeren de supernatant weg op basis van het totale aantal cellen. Resuspendeer de pellet in PBS bij eenmaal 10 tot de achtste cellen per milliliter.
De beenmergcellen zijn nu klaar voor overdracht naar bestraalde ontvangermuizen. De ontvangende wildtype en knockout-muizen voor dit experiment zijn bestraald met 1000 rad zoals beschreven in het bijgevoegde document. De muizen worden gefokt en gehuisvest in een ziekteverwekkervrije faciliteit vier tot 24 uur na bestraling. Verwarm de ontvangende muizen op een verwarmingskussen onder een verwarmingslamp om het donorbeenmerg te injecteren. Plaats een ontvangermuis in een beperker, veeg de staart af met 70% ethanol om de injectieplaats te steriliseren en om lokale vasodilatatie te bevorderen voor gemakkelijke injectie.
Gebruik een insulinespuit met een 28 en een halve gauge naald om eenmaal 10 tot de zevende cellen in een tot 200 microliters in de staarvene van elke muis te injecteren na injectie. Plaats de muis in een kooi met maximaal drie andere geïnjecteerde muizen gedurende de eerste vier weken na injectie. Houd de geïnjecteerde ontvangermuizen in autoclaafkooien met water dat het antibioticum sulfa trim bevat.
Dit geeft de dieren de tijd om hun immuniteit terug te winnen, de kooien te vervangen, antibiotica behandeld water en voedsel om de hygiëne te behouden. Vier weken na bestraling en beenmergtransplantatie, schakelen naar normaal water zonder antibiotica en houd de muizen nog twee weken om hun normale darmflora terug te winnen. Zes weken na beenmerginjectie, meet het initiële lichaamsgewicht om colitis te induceren.
Geef de muizen in de colitis experimentele groep 5% dextransulfaat in drinkwater. Vijf dagen later, pool het perifere bloed van vier muizen in een vacutainer heparine gecoate buisjes en plaats deze op ijs. Combineer vervolgens in een 1,5 milliliter micro centrifugeerbuisje 300 microliters bloed met 300 microliters celkleuring, buffer en verde
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt de rol van het antimicrobiële peptide lyin bij het verminderen van dextransulfaat-geïnduceerde colitis bij muizen door beenmergtransplantatie. Door het transplanteren van beenmerg van wildtype- en knockout-muizen, beoordeelt het experiment de invloed op de ernst van colitis.
Belangrijkste onderdeel van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Immunologie
- Transplantatiebiologie
Achtergrond
- Beenmergtransplantatie kan het genotype van beenmergafgeleide cellen veranderen.
- Colitis is een model voor het bestuderen van inflammatoire darmziekte.
- Antimicrobiële peptiden kunnen therapeutische effecten hebben op ontstekingen.
- Flowcytometrie en histologie zijn belangrijke technieken voor validatie en beoordeling.
Doel van het onderzoek
- Om te bepalen of lyin colitissymptomen kan verminderen.
- Om de effecten van het beenmerggenotype op de ernst van colitis te evalueren.
- Om succesvolle beenmergtransplantatie te valideren.
Gebruikte methoden
- Injectie van beenmerg van wildtype- en knockout-muizen in bestraalde ontvangers.
- Inductie van colitis met behulp van dextransulfaat na vier weken.
- Validatie van transplantaatsucces via flowcytometrie.
- Beoordeling van colonweefselschade door middel van histologische analyse.
Belangrijkste resultaten
- Colitissymptomen waren verminderd wanneer wildtype-beenmerg werd getransplanteerd in knockout-muizen.
- Succesvolle beenmergtransplantatie werd bevestigd door flowcytometrie.
- Histologische analyse wees op minder colonweefselschade bij behandelde muizen.
- De studie ondersteunt de mogelijke therapeutische rol van lyin bij colitis.
Conclusies
- Beenmergtransplantatie kan de immuunrespons bij colitis effectief veranderen.
- Lyin kan een veelbelovende kandidaat zijn voor therapeutische interventie bij inflammatoire darmziekte.
- Verdere studies zijn nodig om de mechanismen achter deze effecten te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This approach enables biopharma R&D to dissect cell-type-specific gene functions in inflammatory disease models, supporting target validation by isolating contributions from immune versus non-immune compartments. By using bone marrow transplantation with congenic markers, researchers can de-risk mechanistic hypotheses before investing in therapeutic modalities. The method provides predictive confidence in target selection by clarifying whether a gene of interest exerts its effect through hematopoietic or stromal pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypothesis by determining if a gene's role in colitis stems from bone marrow-derived cells.
- Operational Value: Enables functional target validation through genotype swapping between donor and recipient mice.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by clarifying cellular origin of gene expression in disease phenotypes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems with known chimeric genotypes for downstream immune or epithelial screening assays.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility by tracking donor engraftment via CD45.1/CD45.2 flow cytometry.
- Scientific Value: Enables reliable compound evaluation in colitis models where immune cell contribution is isolated.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by modeling colitis in a system where gene expression can be compartmentalized to hematopoietic or non-hematopoietic cells.
- Operational Value: Supports translational biomarker alignment by correlating chimerism levels with histological colitis scores.
- Scientific Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by distinguishing whether target modulation requires immune cell targeting.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation, particularly when immune-mediated mechanisms are under investigation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating gene function to bone marrow-derived versus stromal compartments.
- Screening: Describes assay readiness through validated chimerism and reproducible colitis induction via DSS.
- Analytics: Highlights quantitative flow cytometry readouts of CD45.1/CD45.2 ratios to measure engraftment and enable group stratification.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by linking chimerism validation to histological outcomes in colitis.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying any gene of interest in immune cell-dependent disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through cellular resolution of gene function in inflammation.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via congenic marker tracking and flow cytometry validation.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by identifying whether therapeutic targeting should focus on immune or non-immune cells.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on mechanistic clarity of target mechanism of action.
Implementation Considerations
- Required expertise in bone marrow harvest, irradiation, and hematopoietic cell transplantation.
- Instrumentation for flow cytometry to detect CD45.1 and CD45.2 chimerism in blood and bone marrow.
- Standardization across laboratories for irradiation dosing and engraftment validation thresholds.
- Adaptation considerations for different genetic backgrounds beyond C57BL/6.
- Practical limitation: incomplete engraftment necessitates chimerism tracking to confirm experimental validity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:26
Experimental Setup
2:39
Donor Bone Marrow Extraction
5:49
Infusion to Recipient Mice
7:19
Induction of Colitis and Evaluation of Colitis
8:55
Quality Inspection of Bone Marrow Transplantation by Flow Cytometry
11:59
Transplantation Results
14:21
Conclusion
