Name: Onderscheidende functionele rol van genexpressie van immune als niet-immune cellen in de muis Colitis door beenmergtransplantatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 43 s
Description: Leer beenmergtransplantatie bij muizen om colitis te bestuderen via lyin-expressie in immuun- en niet-immuuncellen. Deze methode valideert stamceltransplantatie door flowcytometrie en histologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door Pilot en haalbaarheidsstudie subsidie ​​van UCLA-CURE Center, de ziekte van Crohn en Colitis Foundation of America Career Development Award (# 2691) en National Institute of Health NIDDK K01 (DK084256) financiering van Hon Wai Koon. Beenmerg bestraling operatie werd bijgestaan ​​door Bernard Levin en Scott Keuken van UCLA Center for AIDS Research muis / humaan Chimera Core faciliteit. Flowcytometrie operatie werd bijgestaan ​​door UCLA Vector Core faciliteit.

1. Before-you-start Technische overwegingen <ol><li> Wij raden u aan zowel C57/BL6 wild-type muizen en knock-out muizen voor experiment, omdat muizen met bijbehorende cd-moleculen kunnen worden gekocht bij de grote muis leveranciers. </li><li> Aangezien het moeilijk op te sporen het wild-type muizen en knockout muizen afgeleide donorcellen na beenmergtransplantatie, moet CD45.1 muizen gebruiken om wild-type muizen vertegenwoordigen. (CD45.1 C57/SJL WT muizen Jackson Laboratories voorraad # 002014). </li><li> De meeste muizen kolonies zijn CD45.2. Onze knockout muizen behoren tot CD45.2 genotype (als alternatief een CD45.2 WT muizen bron: Jackson Laboratories voorraad # 000664). De bepaling van CD45.1 of CD45.2 genotype kan worden uitgevoerd met behulp van flowcytometrie van beenmerg en perifeer bloed als bedoeld in hoofdstuk 7 van dit protocol. </li><li> Muizen na bestraling hebben stoornissen van het immuunsysteem. Houd muizen in pathogeenvrije faciliteit. </li><li> Werking van bestraler vereist speciale beveiliging clearance en training. Om tijd te besparen in de opleiding en goedkeuringsprocessen, is het het beste om samen te werken met een laboratorium met gekwalificeerde technicus die in staat is om de bestraler bedienen. </li><li> Veel instellingen hebben flowcytometrie laboratoria met ervaren technici. Het minimaliseren van problemen met flowcytometrie werking, is het beter om uw flowcytometrie experiment plannen te bespreken met de ervaren technicus voordat u begint. </li><li> Muizen kregen op deze wijze (10 muizen per groep): </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Groep </td><td></td><td> Beenmerg donor tot ontvanger </td><td> Behandeling </td></tr><tr><td> Een </td><td> BM-uitwisseling </td><td> CD45.1 WT te CD45.2 KO </td><td> DSS colitis </td></tr><tr><td> B </td><td></td><td></td><td> Water normale controle </td></tr><tr><td> C </td><td> BM-uitwisseling </td><td> CD45.2 KO te CD45.1 WT </td><td> DSS colitis </td></tr><tr><td> D </td><td></td><td></td><td> Water normale controle </td></tr><tr><td> E </td><td> Schijn </td><td> CD45.1 WT te CD45.1 WT </td><td> DSS colitis </td></tr><tr><td> F </td><td></td><td></td><td> Water normale controle </td></tr><tr><td> G </td><td> Schijn </td><td> CD45.2 KO te CD45.2 KO </td><td> DSS colitis </td></tr><tr><td> H </td><td></td><td></td><td> Water normale controle </td></tr></tbody></table> * Een korte illustratie van experimentele protocol wordt weergegeven in figuur 1. 2. Ontvangende muizen Bestraling <ol><li> Muizen gefokt en gehouden in pathogeenvrije faciliteit. Plaats muizen in geautoclaveerd bestraling taart met filter. Plaats een muis in elke sleuf van bestraling taart. Plaats de taart in de bestraler en zorg ervoor dat de draaitafel en taart draaien. </li><li> Zet de luchtpompvoor ventilatie. Sluit de bestraler deur en vergrendel deze. </li><li> Bestralen de muizen met 1000 rad (wat overeenkomt met 10 Gy) ongeveer 10 min (afhankelijk van stralingsbron en halfwaardetijd). Vanaf dit tijdstip werd de bestraalde muizen immuno-gecompromitteerde en zwak immuniteit tegen infectie. Na bestraling, neemt u de taart buiten en plaats in een steriele container voor het transport van de bioveiligheid kast in dierlijke faciliteit. Vermijd blootstelling van de muizen om externe omgeving om de kans op besmetting te minimaliseren. </li><li> In bioveiligheid kabinet, de overdracht van de muizen in de autoclaaf muizen kooien met geautoclaveerd beddengoed (4 muizen per kooi nieuw steriel water toevoegen met sulfatrim vering -. 3,12 ml per 100 ml water). </li><li> Wikkel de waterfles met aluminiumfolie als de antibiotica zijn lichtgevoelig. Schud de sulfatrim flesje goed te mengen voordat u het aan de kooi. </li></ol> 3. Donor beenmerg Extractie <ol><li> Offeren muizen met kooldioxide of isoflurAnce en dan onderdompelen in 1:200 Lysol oplossing. Spuit de muizen met 70% ethanol om de huid vochtig en open botten ontleden. </li><li> Week de dissectie-instrumenten in 70% ethanol voor sterilisatie. </li><li> Voer de dissectie in een bioveiligheid kast. Gebruik de steriele dissectie-instrumenten aan de humerus, dijbeen, scheenbeen en kuitbeen botten, vrij van hechten spieren en ligamenten bloot te leggen. </li><li> Knip de beide uiteinden van de botten van de rode beenmerg te tonen. Houd de botten met een pincet. Spoel de rode beenmerg uit met koude PBS met 3 ml spuit en 25G naalden om een ​​petrischaal. Spoelen van beide uiteinden van botten meer beenmergcellen leveren. </li><li> Gebruik 6 ml spuiten en 18G1 / 2 naalden in rood beenmerg stekkers te doorbreken door herhaalde aspiratie en uitwerpen. Overdracht beenmerg met 50 ml Falcon buizen. </li><li> Draai het beenmerg van 1800 rpm gedurende 5 min bij 4 ° C. Gooi supernatant, resuspendeer pellet door vortexen gedurende 5-10 sec. </li><li> Verdun 10X RBC lysis-buffer met steriel water. Advertentied 1X RBC lysis buffer (5 ml per donor muis), vortex opnieuw 5 sec en houdt exact 3 min bij kamertemperatuur. </li><li> Na 3 min, vul de buizen met 20 ml koude PBS tot de lysis en meng stoppen. Giet de inhoud door middel van een 40 um cel zeef direct in een nieuwe 50 ml Falcon buis. </li><li> Spoel de originele verpakking met 5 ml PBS en transfer naar celzeef ook. Vul tot 50 ml met PBS en meng. </li></ol> 4. Tellen Bone Marrow Donor cellen <ol><li> Voeg 100 ul van Trypan blauwe een Eppendorf buis en 100 ui beenmerg suspensie aan een Eppendorf buis en meng. Pipetteer de gekleurde cel mengsel in een hemocytometer. </li><li> De hoeveelheid cellen wordt berekend door de totale levende beenmerg cellen in de Falcon tubes = unstained celaantal in 16 vierkanten x 2 (door Trypan blauwe verdunning) x 10.000 x 50 ml </li><li> Spin down beenmergcellen in 50 ml Falcon buizen bij 2.000 rpm gedurende 5 min bij 4 ° C. </li><li> Verwijder het supernatant. Op basisop het totale celtellingen, resuspendeer de pellet met PBS tot 1 x 10 8 cellen per ml </li></ol> 5. Infusie om ontvangende muizen <ol><li> Verwarm de ontvangende muizen op een warmte-pad en onder een warming lamp. Zet de ontvangende muizen in restrainer. Injecteer 1 x 10 7 cellen per muis in 100-200 pi intraveneus. </li><li> Injectie van donor beenmerg gedaan moet worden tussen 4 tot 24 uur na de bestraling. </li><li> Blijf op de 4 geïnjecteerde muizen per kooi. Handhaving van de geïnjecteerde ontvangende muizen in geautoclaveerd kooien met antibiotica behandeld water voor de eerste 4 weken in pathogeenvrije dieren faciliteit en laat de muizen weer immuniteit. Change kooien, antibiotica behandeld water en voedsel om de 4 dagen aan hygiëne. </li></ol> 6. Inductie van Colitis en evaluatie van colitis <ol><li> 4 weken na bestraling en beenmergtransplantatie, naar normaal water zonder antibiotica en handhaven de muizen gedurende 2 weken te hun normale herwinnengut microflora. </li><li> 6 weken na beenmerg injectie meten oorspronkelijke lichaamsgewicht. Sommige muizen worden gegeven 5% dextransulfaat in drinkwater ad libitum aan colitis veroorzaken. Sommige muizen worden gegeven regelmatig drinken alleen water als normaal controlegroepen. </li><li> 5 dagen later, terug te trekken uit perifeer bloed, over te dragen aan heparine gecoate buizen (Vacutainer) en houd in ijs. Zwembad het bloed van 4 muizen tot 1 tube. Combineer 300 ul bloed met 300 ui buffer cel kleuring = 600 pi. Verdeel het bloed 5 Eppendorf buizen, elk met 100 pl. </li><li> Offeren muizen met kooldioxide of isofluraan. Evalueer macroscopische schade scores (zie andere JOVE video publicatie voor details 1). Meet lichaamsgewicht verandering. Meet darm lengte en dikte met digitale schuifmaat. Let op kruk textuur (hard, zacht of bloederig). Bepaal occult bloed in de ontlasting met Hemooccult. Ontleden colon weefsels en vast te stellen in formaline voor H &amp; E kleuring. </li><li> Prepareer een dijbeen bone per muis, uitpakken beenmerg en spoel het beenmerg met koude PBS via 25G naald en 1 ml spuit. Pool 4 beenmerg stekkers aan 1 tube en houdt in ijs. </li><li> Giet het beenmerg om petrischaal, afschuiving het beenmerg stekker met 18G naald en 5 ml spuit meerdere keren tot er geen beenmerg stekker aanwezig is. </li><li> Spin down met 1500 rpm gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder supernatant en resuspendeer met 600 ul cel verkleuring buffer. Verdeel de geresuspendeerde beenmerg 5 Eppendorf buizen, elk met 100 pl. </li></ol> 7. Kwaliteitscontrole van beenmergtransplantatie door flowcytometrie <ol><li> Label elk monster buisjes bloed of beenmerg # 1-5: </li><li> Bereid het antilichaam mengsel elke respectieve buis in het donker. </li></ol> # 1 Geen antilichaam # 2 30 ul FITC isotype controle + 30 pi PE isotype controle + 15 pl CD16/32 blokkeren # 3 30 ul FITC Ab CD45.1 + 15 pl CD16/32 blokkeren # 4 30 pi PECD45.2 Ab + 15 pi CD16/32 blokkeren # 5 30 ul FITC Ab CD45.1 + 30 pi PE CD45.2 Ab + 15 pl CD16/32 blokkeren <table border="1"><tbody><tr><td> Voeg niets aan bloed of beenmerg monster # 1 </td></tr><tr><td> Voeg 5 ul antilichaam mengsel # 2 voor elk bloed of beenmerg monster # 2 </td></tr><tr><td> Voeg 3 pl antilichaam mengsel # 3 bij elk bloed of beenmerg monster nr.3 </td></tr><tr><td> Voeg 3 pl antilichaam mengsel # 4 voor de bloed of beenmerg monster nr.4 </td></tr><tr><td> Voeg 5 ul antilichaam mengsel nr.5 elk bloed of beenmerg monster # 5 </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> Houd donker ijs gedurende 30 minuten. </li><li> Voeg 2 ml 1X RBC lysis buffer aan elke buis. Houd in donkere op ijs gedurende 15 minuten. </li><li> Draai de cellen bij 1500 rpm, 5 min bij 4 ° C. (GH 3,8 rotor, 1.500 tpm = 350 xg) Verwijder supernatant. Resuspendeer de pellet met 500 ul cel verkleuring buffer in het donker, dan vortex kort. </li&gt; <li> Controleer de CD45.1 (die WT) en CD45.2 (vertegenwoordiger van KO) in de immuun-gekleurd bloed en het beenmerg monsters door flowcytometrie. FITC selecteren om WT CD45.1 en PE vormen voor KO CD45.2 vertegenwoordigen. </li><li> Analyseer de resultaten van flowcytometrie FlowJo software. Bereken de verhouding van FITC: PE ratio of PE: FITC verhouding te bepalen of donor genotype dominant genotype in bloed en beenmerg. </li></ol>

<ol><li>Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+Intestinal+Inflammation+in+DSS-induced+Model+of+IBD%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD.</a> J. Vis. Exp. (60), e3678(2012).</li>
<li>Ungaro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Toll-like+receptor+4+antagonist+antibody+ameliorates+inflammation+but+impairs+mucosal+healing+in+murine+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">A novel Toll-like receptor 4 antagonist antibody ameliorates inflammation but impairs mucosal healing in murine colitis.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, 1167-1179 (2009).</li>
<li>Castagliuolo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+neurokinin-1+receptor+during+colitis+in+mice%3A+role+of+the+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Protective effects of neurokinin-1 receptor during colitis in mice: role of the epidermal growth factor receptor.</a> Br. J. Pharmacol. 136, 271-279 (2002).</li>
<li>Koon, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cathelicidin+signaling+via+the+Toll-like+receptor+protects+against+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Cathelicidin signaling via the Toll-like receptor protects against colitis in mice.</a> Gastroenterology. 141, 1852-1863 (2011).</li>
<li>Lee, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow+cells+in+murine+colitis%3A+multi-signal+analysis+confirms+pericryptal+myofibroblast+engraftment+without+epithelial+involvement%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">marrow cells in murine colitis: multi-signal analysis confirms pericryptal myofibroblast engraftment without epithelial involvement.</a> PLoS One. 6, e11(2011).</li>
<li>Deng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+cell+therapy+using+bone+marrow-derived+stem+cells%2Fendothelial+progenitor+cells+to+accelerate+neovascularization+in+healing+of+experimental+ulcerative+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Des%22%5BJournal%5D)">New cell therapy using bone marrow-derived stem cells/endothelial progenitor cells to accelerate neovascularization in healing of experimental ulcerative colitis.</a> Curr. Pharm. Des. 17, 1643-1651 (2011).</li>
<li>Valcz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid+aggregates+may+contribute+to+the+migration+and+epithelial+commitment+of+bone+marrow-derived+cells+in+colonic+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Lymphoid aggregates may contribute to the migration and epithelial commitment of bone marrow-derived cells in colonic mucosa.</a> J. Clin. Pathol. 64, 771-775 (2011).</li>
<li>Takaba, J., Mishima, Y., Hatake, K., Kasahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+bone+marrow-derived+monocytes%2Fmacrophages+in+the+repair+of+mucosal+damage+caused+by+irradiation+and%2For+anticancer+drugs+in+colitis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+Inflamm%22%5BJournal%5D)">Role of bone marrow-derived monocytes/macrophages in the repair of mucosal damage caused by irradiation and/or anticancer drugs in colitis model.</a> Mediators Inflamm. 2010, 634145(2010).</li>
<li>Bakhautdin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+role+of+macrophage-derived+ceruloplasmin+in+inflammatory+bowel+disease.+%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Protective role of macrophage-derived ceruloplasmin in inflammatory bowel disease. </a> Gut. , (2012).</li>
<li>Seta, N., Kuwana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+multipotent+progenitors+from+human+circulating+CD14%2B+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Derivation of multipotent progenitors from human circulating CD14+ monocytes.</a> Exp. Hematol. 38, 557-563 (2010).</li>
<li>Crain, B. J., Tran, S. D., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplanted+human+bone+marrow+cells+generate+new+brain+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Transplanted human bone marrow cells generate new brain cells.</a> J. Neurol. Sci. 233, 121-123 (2005).</li>
<li>Finnberg, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+imaging+and+antitumor+effects+of+GFP%28%2B%29+bone+marrow-derived+cells+homing+to+syngeneic+mouse+colon+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">High-resolution imaging and antitumor effects of GFP(+) bone marrow-derived cells homing to syngeneic mouse colon tumors.</a> Am. J. Pathol. 179, 2169-2176 (2011).</li>
<li>Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+bone+marrow+transplantation+%28BMT%29%3A+providing+optimal+veterinary+and+husbandry+care+to+irradiated+mice+in+BMT+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Assoc.+Lab+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies.</a> J. Am. Assoc. Lab Anim. Sci. 48, 11-22 (2009).</li>
<li>Chen, B. J., Cui, X., Sempowski, G. D., Domen, J., Chao, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+dose+correlates+with+the+speed+of+immune+reconstitution+after+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell dose correlates with the speed of immune reconstitution after stem cell transplantation.</a> Blood. 103, 4344-4352 (2004).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Deze beenmergtransplantatie aanpak is geschikt voor immunologie van colitis, infecties, kanker, obesitas en andere aandoeningen. Dit experiment beenmergtransplantatie nodig wanneer het gen-van-belang wordt uitgedrukt in beide afgeleid beenmerg en niet-beenmerg afgeleide cellen en het gen-van-belang vermoedelijk ziekte bemiddelen door cellen van beide populatie. Bijvoorbeeld, antimicrobiële peptide cathelicidine aangetoond moduleren acute colitis. Maar wordt uitgedrukt in zowel epitheelcellen en immuuncellen (zoals macro...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> Cel vlekken buffer </td><td> Biolegend </td><td> # 420201 </td></tr><tr><td> 10X RBC lysis buffer </td><td> Biolegend </td><td> # 420301 </td></tr><tr><td> FITC muis isotype control </td><td> Biolegend </td><td> # 400207 </td></tr><tr><td> PE muis isotype control </td><td> Biolegend </td><td> # 400211 </td></tr><tr><td> PE anti-muis CD45.2 </td><td> Biolegend </td><td> # 109807 </td></tr><tr><td> FITC anti-muis CD45.1 </td><td> Biolegend </td><td> # 110705 </td></tr><tr><td> Anti-muis CD16/32 blokkerende </td><td> Biolegend </td><td> # 101301 </td></tr><tr><td> 40 urn celzeef </td><td> Fisherbrand </td><td> # 22363547 </td></tr><tr><td> PBS 1X </td><td&gt; MP Biomedicals </td><td> # 1860454 </td></tr><tr><td> Heparine </td><td> Fisherbrand </td><td> # BP2425 </td></tr><tr><td> Sulfatrim (SMZ) </td><td> Qualitest </td><td> NC9242720 (fisher) </td></tr><tr><td> Lysol IC </td><td> Andwin Wetenschappelijke </td><td> NC9745686 (fisher) </td></tr><tr><td> Vaccutainer </td><td> BD </td><td> # 8000813 </td></tr><tr><td> Muis weerhouder </td><td> Braintree Scientific </td><td> # TV-150 </td></tr><tr><td> Bestraler </td><td> JL Shepherd and Associates </td><td> Mark I 68A </td></tr><tr><td> Flowcytometer </td><td> BD </td><td> BD FACSCanto II </td></tr><tr><td> Flowcytometer reageerbuis </td><td> Valk </td><td> # 352052 </td></tr><tr><td> Digitale schuifmaat </td><td> Fisherbrand </td><td> 14-648-17 </td></tr><tr><td> Hemoccult ICT </td><td> Beckman Coulter </td><td> G0328QW </td></tr&gt; </tbody></table>

onderscheidende functionele rol van genexpressie van immune als niet-immune cellen in de muis colitis door beenmergtransplantatie

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Om de rol van een gen in de ontwikkeling van colitis begrijpen, vergeleken we de reactie van wild-type muizen en gen-van-belang deficiënte knockout muizen colitis. Als het gen-van-belang wordt uitgedrukt in zowel van beenmerg afgeleide cellen en niet-beenmerg afgeleide cellen van de gastheer, maar is het mogelijk om de rol van een gen van belang onderscheid in van beenmerg afgeleide cellen en niet-beenmerg afgeleide cellen door beenmergtransplantatie techniek. Het beenmerg afgeleide cellen genotype muizen veranderen, werden de oorspronkelijke beenmerg van ontvangende muizen vernietigd door bestraling en vervangen door nieuwe donor beenmerg van verschillende genotype. Wanneer wild-type muizen donor beenmerg getransplanteerd knockout muizen, kunnen we genereren knockout muizen met wild-type genexpressie in van beenmerg afgeleide cellen. Als alternatief werd toen knockout muizen donor beenmerg getransplanteerd naar wild-type ontvangende muizen, wild-type muizen zonder gen-van-een blijk van belangstellingvan beenmerg afgeleide cellen geproduceerd. Kan echter beenmergtransplantatie niet 100% volledig zijn. Daarom gebruikten we cluster van differentiatie (CD) moleculen (CD45.1 en CD45.2) als markers van donor en ontvangende cellen het percentage van donor beenmerg afgeleide cellen in de ontvangende muizen en succesvolle beenmergtransplantatie volgen. Wild-type muizen met CD45.1 genotype en knockout muizen met CD45.2 genotype werden gebruikt. Na bestraling van ontvangende muizen werden de donor beenmergcellen van verschillende genotypen ingebracht in de ontvangende muizen. Wanneer de nieuwe beenmerg geregenereerde over te nemen immuniteit, werden de muizen uitgedaagd door chemisch middel (dextran natriumsulfaat, DSS 5%) colitis te induceren. Hier bleek ook de methode colitis te induceren in muizen en evalueren van de rol van het gen van interesse tot expressie gebracht uit beenmerg afgeleide cellen. Als het gen-van-belang van het bot afgeleide cellen speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van de ziekte (zoals colitis), kan het fenotype van de ontvangende muizen met beenmergtransplantatie aanzienlijk worden gewijzigd. Eind colitis experimenten, het beenmerg afgeleide cellen in bloed en beenmerg werden gemerkt met antilichamen tegen CD45.1 en CD45.2 en de kwantitatieve verhouding bestaan ​​kunnen worden gebruikt om het succes van beenmergtransplantatie door flowcytometrie evalueren. Succesvolle beenmergtransplantatie moeten tonen een grote meerderheid van de donor genotype (in termen van CD molecule marker) over de ontvanger genotype in zowel het beenmerg en het bloed van de ontvanger muizen.

Als het gen-van-belang speelt een belangrijke rol in het immuunsysteem cellen tijdens de ontwikkeling van colitis, de muizen die beenmerg van verschillende genotype door beenmergtransplantatie (WT KO KO of om WT) moet een veranderde reactie op DSS colitis. Een van de belangrijkste parameters voor het bepalen van de ernst van colitis is de H &amp; E kleuring van de colon weefsel. Colonic weefselstructuur veranderingen en tekenen van ontsteking kan kwantitatief worden geëvalueerd door H &amp; E histologie scoresysteem. Cr...

Beenmergtransplantatie geeft een manier om het genotype van het beenmerg afgeleide cellen. Als het gen van interesse tot expressie wordt gebracht in zowel van beenmerg afgeleide cellen en niet-beenmerg afgeleide cellen kan beenmergtransplantatie wijzigen beenmerg afgeleide cellen een ander genotype zonder de niet-beenmerg cellen genotype.

Onderscheidende functionele rol van genexpressie van immune als niet-immune cellen in de muis Colitis door beenmergtransplantatie

Om de rol van een gen bij de ontwikkeling van colitis te begrijpen, hebben we de responsen van wild-type muizen en knockout-muizen die deficiënt zijn voor het gen van interesse vergeleken ...

Het algemene doel van het in deze video gedemonstreerde experiment is om vast te stellen of het antimicrobiële peptide lyine een rol speelt bij de verlichting van dextransulfaat-geïnduceerde colitis bij muizen. Dit wordt bereikt door beenmerg van wildtype muizen te injecteren in bestraalde wildtype en knockout-muizen, en beenmerg van knockout-muizen in bestraalde wildtype muizen. Het getransplanteerde beenmerg zal nieuwe bloedcellen genereren in de ontvanger met het genotype van de donor.De ontvangende muizen worden vervolgens na vier weken blootgesteld aan dextraansulfaat om colitis op te wekken. Een succesvolle transplantatie wordt gevalideerd via flowcytometrie en beschadiging van het colonweefsel wordt beoordeeld via histologie. De resultaten laten zien dat colitis wordt verlicht wanneer wildtype beenmerg wordt getransplanteerd in knockout-muizen.Omgekeerd wordt colitis verergerd wanneer knockout-beenmerg wordt getransplanteerd in wild-type muizen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen om vast te stellen of genexpressies afkomstig zijn uit cellen afgeleid van het beenmerg of uit cellen die niet uit het beenmerg afkomstig zijn bij ontsteking of infectie. C 57, black six, wild-type en C-eliciteerde knockout-muizen worden aanbevolen voor dit experiment om het mogelijk te maken de wild-type muizen en de knockout-muizen te volgen.Donorencellen na beenmergtransplantatie. Gebruik CD 45.1 muizen om wildtype muizen te representeren en CD 45.2 voor de knockout-muizen. Het hier getoonde schema beschrijft de experimentele opzet waarbij vijf donor-muizen en 10 ontvanger-muizen per groep zijn toegewezen.Voor groepen A en B wordt beenmerg getransplanteerd van wildtype muizen naar knockout-muizen. Colitis wordt geïnduceerd in groep A, maar niet in groep B. Voor groep C en D wordt beenmerg getransplanteerd van de knockout-muizen naar de wildtype-muizen, waarbij colitis alleen in groep C wordt geïnduceerd. Voor E en F vindt de transplantatie plaats van wildtype naar wildtype en voor groepen G en H vindt de transplantatie plaats van knockout naar knockout. Om donorbeenmerg voor te bereiden voor overdracht naar bestraalde muizen, begint u met het extraheren van beenmerg uit de botten van geofferde muizen in een veiligheidskast.Gebruik steriele dissectie-instrumenten om de humerus, femur, tibia en fibula vrij te maken van aanhechtende spieren en ligamenten en breng deze over naar een Petrischaal. Snijd beide uiteinden van de botten open om het rode beenmerg zichtbaar te maken. Pak vervolgens een van de botten vast met een pincet.Spoel het rode beenmerg uit met koud PBS met een spuit van drie milliliter en naalden van 25 gauge in een andere petrischaal. Spoel vervolgens het bot vanaf de andere kant om meer beenmergcellen te verkrijgen. Herhaal dit proces voor elk van de botten.Combine het beenmerg van wild-type en knock-out muizen afzonderlijk. Gebruik een spuit van zes milliliter met een naald van 18 gauge en een halve inch om de rode beenmergpluggen te breken door herhaaldelijk aspireren en uitstoten. Gebruik vervolgens een serologische pipette om het verzamelde beenmerg over te brengen naar een conische buis van 50 milliliter.Zodra al het beenmerg is overgebracht, wordt het beenmerg gecentrifugeerd bij 740 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Gooi na het centrifugeren het supernatant weg en resuspendeer het pellet door vijf tot 10 seconden te vortexen. Voeg vijf milliliter van een XRBC-lysebuffer per donormuis toe aan het pellet, vortex opnieuw gedurende vijf seconden en incubeer precies drie minuten bij kamertemperatuur.Voeg na drie minuten 20 milliliters koude PBS toe aan elke buis en meng door omkeren om de lysis te stoppen. Giet vervolgens de inhoud door een 40 micron cell strainer in een nieuwe 50 milliliter conische buis. Spoel de oorspronkelijke buis met vijf milliliters PBS en breng de oplossing over naar de cell strainer.Ga door met het opvangen van de doorstroom in de conische buis. Vul het volume vervolgens aan tot 50 milliliters met PBS en meng door inversie. Bepaal daarna het aantal levensvatbare cellen via trypan-blauw-uitsluiting met behulp van een hemocytometer.Zodra het celgetal is bepaald, worden de beenmergcellen vijf minuten gecentrifugeerd bij 913 ×g bij 4 °C. Verwijder na het centrifugeren het supernatant op basis van het totale celgetal. Resuspendeer de pellet in PBS tot een concentratie van 1 × 10⁸ cellen/mL.De beenmergcellen zijn nu klaar voor overdracht naar bestraalde ontvanger-muizen. De wildtype en knockout ontvanger-muizen voor dit experiment zijn bestraald met 1000 rad zoals beschreven in het bijbehorende document; de muizen zijn gefokt en gehuisvest in een pathogenvrije faciliteit. Vier tot 24 uur na de bestraling werden de ontvanger-muizen opgewarmd op een warmtemat onder een warmtelamp om het donorbeenmerg te kunnen injecteren. Plaats een ontvanger-muis in een fixatieapparaat en veeg de staart af met 70% ethanol om de injectieplaats te steriliseren en lokale vasodilatatie te bevorderen voor een gemakkelijke injectie.Inject met een insulinespuit met een naald van 28,5 gauge 1 × 10⁷ cellen in 1 tot 200 µL in de staartvene van elke muis na injectie. Plaats de muis gedurende de eerste vier weken na injectie in een kooi met maximaal drie andere geïnjecteerde muizen. Huisvest de geïnjecteerde recipientmuizen in geautoclaveerde kooien met water dat het antibioticum sulfa trim bevat.Dit geeft de dieren de tijd om hun immuniteit te herstellen; vervang de kooien, het met antibiotica behandelde water en het voer elke vier dagen om de hygiëne te waarborgen. Schakel vier weken na de bestraling en beenmergtransplantatie over op gewoon water zonder antibiotica en houd de muizen nog twee weken vast om hun normale darmmicroflora te herstellen. Meet zes weken na de beenmerginjectie het initiële lichaamsgewicht om colitis te induceren.Geef de muizen in de colitis-experimentele groep 5% dextraansulfaat in het drinkwater. Vijf dagen later wordt het perifere bloed van vier muizen verzameld in vacutainer-buisjes met een heparinecoating en op ijs geplaatst. Combineer vervolgens in een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter 300 microliter bloed met 300 microliter celkleuringsbuffer en verdeel het bloed op ijs in vijf flowcytometrie-testbuisjes, genummerd één tot vijf, met elk 100 microliter.Meet na het opofferen van de muizen opnieuw het lichaamsgewicht en bereken het verschil. Dissekeer het colonweefsel en plaats dit in formaline voor H&E-kleuring. Win vervolgens het beenmergcellen op zoals eerder beschreven.Verdeel het resuspendeerde beenmerg over vijf microcentrifugebuisjes, gelabeld één tot vijf, met elk 100 milliliters. Ter voorbereiding op de analyse via flowcytometrie wordt het antilichaammengsel voor elk respectievelijk buisje in het donker bereid zoals beschreven in het bijbehorende document; bloed- en beenmergmonsters gelabeld met nummer één dienen als controles en worden niet gekleurd. Bloed- en beenmergmonsters gelabeld met nummer twee worden gekleurd met fitzy isotype controle PE isotype controle en CD 16/32 blockeringsoplossing.Deze isotype-controles worden gebruikt om de specificiteit van de binding van het primaire antilichaam aan de monsters te bevestigen. Het monster met nummer drie wordt gekleurd met FZ CD 45.1 en CD 16/32. De monsters met blokkeeroplossing die zijn gemarkeerd met nummer vier worden gekleurd met CD 45.2 en CD 16/32.Blokkeeroplossing. Labeling met een enkele kleur kan de aanwezigheid van donor- of recipiëntcellen in het bloed of beenmerg onthullen. Duidelijk gemarkeerde monsters nummer vijf worden gekleurd voor CD 45.1, CD 45.2 en CD 16/32.Blokkering hier van de dubbele kleurmarkering toont de relatieve ratio van donor- en recipiëntcellen in het bloed of het beenmerg. Voeg vijf µL van antilichaammengsel twee en vijf toe aan hun respectieve monsterbuisjes. Voeg vervolgens drie µL van antilichaammengsel drie en vier toe aan hun respectieve monsterbuisjes.Incubeer alle buisjes gedurende 30 minuten op ijs. Voeg na de incubatie twee milliliter XRBC-lysisbuffer toe aan elke buis. Incubeer de monsters vervolgens nogmaals 15 minuten op ijs in het donker.Centrifugeer de cellen bij 350 ×g gedurende vijf minuten bij 4 °C. Verwijder na het centrifugeren het supernatant en resuspendeer het pellet in het donker met 500 µL celkleuringsbuffer. Vortex vervolgens kort.Voer vervolgens flowcytometrie uit op de immunogekleurde bloed- en beenmergmonsters. Selecteer FZ om wildtype CD 45.1 weer te geven en PE om knockout CD 45.2 weer te geven. Analyseer de resultaten van de flowcytometrie met de software van FloJoe.Bereken de ratio van fit E ten opzichte van de PE-ratio of de PE-ratio ten opzichte van de fit e-ratio om te bepalen of het donorgenotype het dominante genotype is in bloed en beenmerg. Deze afbeelding toont representatieve H&amp;E-beelden van colons met een normale histologie en DSS-colitis. Histologiebeelden worden gescoord op basis van mucosale weefselschade en neutrofieleninfiltratie in het mucosale en submucosale weefsel.Zo wijst een hogere histologiescore op een ernstigere colitis om te testen of lyin een rol speelt bij de preventie van colitis. Beenmerg werd uitgewisseld tussen wild-type en knockout-muizen zoals beschreven in deze video. De histologie werd vervolgens geëvalueerd en gescoord zoals hier getoond.De histologiescores waren significant verhoogd wanneer knockout-muizenbeenmerg werd geïntroduceerd in bestraalde wild-type muizen. Omgekeerd waren de scores significant verlaagd wanneer wild-type beenmerg werd geïntroduceerd in knockout-muizen. Deze gegevens geven aan dat endogeen C uit beenmerg-afgeleide cellen ontstekingsremmende effecten heeft en colitis verbetert om te verifiëren dat de transplantatie in deze muizen succesvol was.Flowcytometrie werd ook uitgevoerd op het beenmerg en bloed van de muizen na transplantatie. Wild-type beenmerg kleurt sterk voor Fitz CD 45.1 maar niet voor PE CD 45.2 zoals hier getoond; knockout beenmerg kleurt sterk voor PE maar niet voor Fitz zoals hier getoond. Na transplantatie kleurden echter zowel het beenmerg als het bloed van wild-type muizen die knockout beenmerg hadden ontvangen sterk voor PE maar niet voor Fitz, wat aangeeft dat de dominante populatie gekleurde cellen afkomstig was van de donor.Hetzelfde gold voor het beenmerg en bloed van knockout-muizen die wildtype beenmerg ontvingen; deze vertoonden een sterke kleuring voor fitzy maar niet voor pe, wat opnieuw bevestigde dat de overheersende gekleurde populaties van donorherkomst waren. Na het bekijken van deze video zou u in staat moeten zijn om een beenmergtransplantatie-experiment uit te voeren en colitis kunnen modificeren via beenmergafgeleide cellen.

differentiating-functional-roles-gene-expression-from-immune-non

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Murine beenmergtransplantatie is een veel gebruikte techniek om immunologische mechanismen voor graft-versus-host ziekte bij mensen bestuderen. De mogelijkheid om T-cel mensenhandel patronen te...

Inductie van Graft-versus-host ziekte en<em&gt; In Vivo</em&gt; T-cel monitoren door gebruik van een MHC-matched muizenmodel

Het bepalen van donorcel innesteling vormt een uitdaging in de muis beenmerg transplantatie modellen die goed gedefinieerde fenotypische merkers missen. We beschreven een methode om mannelijke donor cel innesteling te kwantificeren in vrouwelijke transplantatie ontvangende muizen. Deze methode kan worden gebruikt in alle muizenstammen voor de studie van HSC functies.

Met behulp van kwantitatieve real-time PCR voor donorcel Engraftment bepalen in een concurrerende Murine beenmergtransplantatie Model

Hier presenteren we een protocol om colonontsteking bij muizen te induceren door adoptieve overdracht van syngeneïsche CD4+CD45RBhigh T-cellen naar ontvangers zonder T- en B-cellen. Klinische en histopathologische kenmerken bootsen inflammatoire darmziekten bij mensen na. Deze methode maakt de studie van de initiatie van colonontsteking en de progressie van de ziekte mogelijk.

Inductie van Muriene darmontsteking door adoptieve overdracht van effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoog</sup&gt; T cellen in immunodeficiënte muizen

Intravital fluorescentie microscopie (IVFM) van de calvarium wordt toegepast in combinatie met genetische diermodellen om de homing en engraftment van hematopoietische cellen in het beenmerg (BM) niches te studeren.

Intravital Fluorescent microscopie (IVFM) te combineren met genetische modellen om te studeren van Engraftment dynamiek van hematopoietische cellen aan het beenmerg Niches

Hier presenteren we een protocol voor het onderzoek naar het effect van de ongeldigheidsverklaring van gustation-gerelateerde genen op immuunresponsen bij een dextran sulfaat natrium (DSS)-geïnduceerde muismodel van inflammatory bowel disease (IBD).

Effecten van smaak signalering eiwitten afschaffing op ontsteking van de darm in een muismodel van Inflammatory Bowel Disease

Het doel van dit protocol is het isoleren van mononucleaire cellen die zich in de lamina propria van de dikke darm bevinden door enzymatische vertering van het weefsel met collagenase. Dit protocol maakt een efficiënte isolatie van mononucleaire cellen mogelijk, wat resulteert in een enkelvoudige celsuspensie die op zijn beurt kan worden gebruikt voor robuuste immunophenotypering.

Isolatie van lamina propria mononucleaire cellen van Murine Colon met behulp van Collagenase E

Graft-versus-host ziekte is een belangrijke complicatie na allogene beenmergtransplantatie. Dendritische cellen spelen een cruciale rol in de pathogenese van graft-versus-host ziekte. Het huidige artikel beschrijft een nieuw beenmergtransplantatieplatform om de rol van dendritische cellen te onderzoeken bij de ontwikkeling van graft-versus-host ziekte en het graft-versus-leukemie-effect.

Beenmergtransplantatie Platform om de rol van dendritische cellen in graft-versus-host ziekte te onderzoeken

We beschrijven drie methoden van beenmergtransplantatie (BMT): BMT met total-body bestraling, BMT met afgeschermde bestraling en BMT-methode zonder pre-conditionering (adoptieve BMT) voor de studie van klonale hematopoiese in muismodellen.

Beenmergtransplantatieprocedures bij muizen om clonal hematopoiese te bestuderen

In dit protocol wordt een darmmicrobiota-antigeenspecifiek T-cel adoptief transfer colitismodel beschreven. CD4+ T-cellen worden geïsoleerd uit CBir1 TCR transgene muizen. Deze zijn specifiek voor een immunodominant darmmicrobiota-antigeen CBir1 flagellin, dat wordt overgedragen in ontvangende Rag1-/- muizen, wat leidt tot darmontsteking.

Inductie van darmontsteking door adoptieve overdracht van CBir1 TCR transgene CD4 + T-cellen naar immunodeficiënte muizen

Dit artikel zal detail het protocol voor het meten van calpaïne activiteit in de vaste en levende cellen met behulp van flow cytometrie.

Het meten van calpaïne Activiteit in vaste en levende cellen door flowcytometrie

Leer beenmergtransplantatie bij muizen om colitis te bestuderen via lyin-expressie in immuun- en niet-immuuncellen. Deze methode valideert stamceltransplantatie door flowcytometrie en histologie.

Onderscheidende functionele rol van genexpressie van immune als niet-immune cellen in de muis Colitis door beenmergtransplantatie (Video) | JoVE Journal

Onderscheidende functionele rol van genexpressie van immune als niet-immune cellen in de muis Colitis door beenmergtransplantatie

Meer video's verkennen