Name: Het bestuderen van Proteolyse van cycline B op de enkele cel niveau in Hele celpopulaties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Leer hoe cycline B-proteolyse anafase-aanvang reguleert met behulp van fluorescentielabeling en levende celmicroscopie. Deze methode maakt real-time monitoring van eiwitafbraak tijdens mitose mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We zijn dankbaar voor S. Taylor voor het verstrekken van de pLPCX-histon H2-GFP plasmide. Wij danken R. Mertelsmann voor continue ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft.

1. Zaaien van U2OS gebaseerde Cycline B-SNAP Reporter cellen (kloon 11 Cellen 6) op Microscoop Chamber Slides <ol><li> Trypsinize subconfluente SNAP reporter cellen mochten groeien asynchroon in logfase ten minste 48 uur. </li><li> Werken met 8 goed microscoop kamers (constante verdeling van cellen). </li></ol> Voor het zaaien van cellen op 8 goed microscoop kamers met een constante verdeling over het gehele oppervlak van de microscoop kamer centrifuge 10.000 cellen en resuspendeer in 350 ul fenol rood-vrij normale groei medium (aangevuld met 10% foetaal runderserum, penicilline / streptomycine en natriumpyruvaat). Breng de celsuspensie microscoop kamer (figuur 2). Werken met 8 goed microscoop kamers (maximaal celdichtheid in het midden). Voor het zaaien van cellen op een hogere dichtheid in het centrum van de microscoop chambeh, laadt u de kamer met 300 ul fenol rood-vrij normale groei medium. Voorzichtig 5.000 cellen naar het centrum van de microscoop kamer (figuur 2). Werken met 96 wells speciale optiek platen (constante verdeling van cellen). Voor het zaaien van cellen op platen met 96 putjes bij een constante verdeling over het gehele oppervlak van de put, centrifugeer 5.000 cellen en resuspendeer in 300 ul fenol rood-vrij normaal kweekmedium. Breng de celsuspensie op een 96-well plaat. Afhankelijk van het totale aantal benodigde cellen bevattende wells, passen de cel aantal en het totale volume van de suspensie medium (figuur 2). Werken met 96 putjes platen speciale optica (maximum celdichtheid in het midden). Voor het zaaien van cellen op platen met 96 putjes, voorzichtig 1.500 cellen in 15 ul fenol rood-vrij normaal kweekmedium in een small druppel naar het midden van elk putje om beperking bereiken van celgroei in het midden van de put (figuur 2). <ol start="3"><li> Toestaan ​​gezaaide cellen gedurende ten minste 18 uur groeien onder standaard celkweekomstandigheden (37 ° C, 100% luchtvochtigheid, 5% CO2). </li></ol> 2. Kleuring van Reporter Cellen met SNAP ondergrond <ol><li> 30 min voor het begin van de kleuring mogelijk aliquots van fenolrood-vrij normaal kweekmedium op te warmen tot 37 ° C. </li><li> Voor de hantering van de SNAP substraat (in ons geval TMR ster) los TMR Star in DMSO tot een concentratie die in de stockoplossing van 400 uM, die kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C. </li><li> Voorafgaand aan kleuring verdunnen 0,5 pi TMR Star voorraadoplossing in 200 ul fenol rood-vrij normaal kweekmedium (37 ° C) tot een uiteindelijke concentratie van 1 labeling urn. </li><li> Bij normale groeimedium van asynchroon groeiende cellen en incubeer in lAbeling medium gedurende 25 min onder standaard kweekomstandigheden. </li><li> Verwijder etikettering medium en wassen cellen vier keer met fenol rood-vrij normaal kweekmedium (37 ° C). Incubeer cellen in 300 ul fenol rood-vrij normaal kweekmedium (37 ° C) gedurende 30 minuten. Voorafgaand aan transport naar de microscoop vervangen met vers medium zonder fenolrood normaal kweekmedium (37 ° C) om de resterende ongebonden SNAP substraat te verwijderen. </li><li> Transportcellen de microscoop in een piepschuim doos op een voorverwarmde (37 ° C) warmteblok temperatuurvariatie te minimaliseren. </li></ol> 3. Meting van fluorescentie-intensiteit <ol><li> Twee uur voor de analyse stel de temperatuur van de klimaatruimte bij 37 ° C in droge modus om het gehele microscoop met alle componenten te brengen op de gewenste temperatuur. Voorverwarmen voordat de luchtvochtigheid belangrijk te voorkomen condensatie en schade aan de microscoop. </li><li> Stel luchtvochtigheid to 60% en CO 2 tot 5% voor de start van de analyse. </li><li> Start de scan ^ R Acquisition software en definiëren standaard instellingen (zie tabel 1). </li><li> Definieer de posities van de putjes te analyseren. </li><li> Definieer de At (verwerving cyclustijd) en het absolute aantal van de overname cycli. </li><li> Als een analyse van een groter aantal putten gewenst is, selecteer hardware autofocus, anders is het voldoende om alleen software autofocus gebruiken. </li><li> Start de overname en toezicht voor de eerste twee acquisitie cycli. De microscoop richt zich op de histone H2-GFP signaal met daaropvolgende acquisitie van een eerste beeld in dat kanaal voordat het filter wordt vervangen en de overeenkomstige TMR ster wordt verkregen (Figuur 3). Dit wordt herhaald voor alle posities in een goed en voor elk van de putjes te onderzoeken, voordat men weer de volgende cyclus. </li></ol> 4. Analyse van proteolytische profielen uzingen Scan ^ R <ol><li> Start de Scan ^ R Analysis software en analyseren van de afbeeldingen met de celkernen, zoals die door histon H2-GFP, beschouwd als de belangrijkste object, met een drempel gebaseerd op signaalsterkte en waterscheiding algoritme te helpen bij het scheiden van naburige cellen. Een subobject bestaande uit een kern met cytoplasma wordt aangemaakt TMRstar analyse. (Belangrijke eigenschappen van het hoofddoel zijn X en Y-posities, de tijd, en de maximale en de gemiddelde intensiteit van GFP voor de belangrijkste object en de totale intensiteit gedeeld door gebied voor de TMRstar subobject.) Deze analyse proces kan enkele uren duren als gevolg van grote hoeveelheden gegevens hoeveelheden. </li><li> Naar de modus te traceren naar de subobject gemiddelde TMR Star fluorescentie-intensiteit in de tijd (cel sporen), toegewezen aan de geanalyseerde belangrijkste objecten (figuur 4) te visualiseren. Het aantal cellen te onderzoeken kunnen worden verkleind door gating op de metingen van ten minste 140 cycli met een hoge maximale intensiteit van H2-GFP. Op zoekbij grotere aantallen cellen kan een eerste representatieve en objectief beeld (figuur 4). </li><li> Selecteer een cel spoor van belang histone H2-GFP en TMR Star fluorescentie gelijktijdig te visualiseren op enkele cel (Figuur 5A). </li><li> Met behulp van de rechter muisknop op een cel van de rente en het genereren van een exporteerbaar fotogalerij ter illustratie van histon H2-GFP en cycline B-SNAP TMR-ster voor elke keer punt. </li><li> Ga naar de bevolking modus van de Scan ^ R Analyse software en de poort van de regio waar de cel van belang is vertegenwoordigd op de X vs Y dot plot (Figuur 5B). </li><li> Breng een nieuwe dot plot venster om de gated regio en visualiseren betekenen TMR Star fluorescentie-intensiteit in de tijd (Figuur 5C). </li><li> Gegevens exporteren (tijd en fluorescentie-intensiteit) naar Microsoft Excel voor verdere berekening. </li></ol> 5. Representatieve resultaten Vijgure 5D en 5E tonen cycline B kinetiek, vertegenwoordigd door een TMR Star fluorescentie-intensiteit curve, van een cel die verloopt via een regelmatige mitose zonder tekenen van chromosomale afwijking (Figuur 5E). Bij verdichting van het cytoplasma na nucleaire envelop verdeling (NEBD, zoals aangegeven door de rode driehoek), TMR Star fluorescentie intensiteit laat een abrupte stijging tot isomorf venster (helder gedeelte van het diagram) wordt bereikt wanneer de cel binnenkomt prometafase 6. Fluorescentie-intensiteit blijft op een stabiel niveau zolang de cel verloopt door profase metafase en begint snel na vallen alle chromosomen hebben een stabiele metafase plaat (figuur 5D en 5E). Deze daling gaat vooraf aan chromosoom scheiding bij anafase (blauwe stip op de curve). In het najaar van mitose het chromatine begint decondense aan (blauwe balken) en de cel neemt interfase morfologie, terwijl de fluorescentie-intensiteit curve benadert eenplateau die lager is dan het plateau voor mitose (figuur 5D en 5E). <table border="1"><tbody><tr><td> Autofocus instellingen </td><td> Histon H2-GFP (hoofddoel overname-instellingen) </td><td> Cycline B-SNAP gelabeld met TMR Star (Verwerving instellingen) </td><td> Acquisitie cyclustijd Herhalingen </td></tr><tr><td> Grof autofocus + / -39 micrometer 24 Lagen Fijn autofocus + / -5,4 Micrometer 14 Lagen </td><td> GFP filter in te stellen: Sluitertijd: 100 ms Lichtintensiteit: 25% </td><td> TRITC filter in te stellen: Sluitertijd: 150 msec Lichtintensiteit: 33,3% </td><td> 2 tot 5 min. </td></tr><tr><td> GFP filter in te stellen: Sluitertijd: 12 msec Lichtintensiteit: 12,5% </td><td></td><td></td><td> Tot 48 uur van verdere analyse (beperkt door verminderde vochtigheid van 60%) </td></tr></tbody&gt; </table> Tabel 1. Standaardinstellingen zoals gebruikt voor de analyse van cycline B proteolyse. Histone H2-GFP werd gebruikt als referentie structuur om de focus vlak definiëren voor het meten van cycline B-SNAP fluorescentie-intensiteit. Lichtintensiteiten gedurende de focus procedure lager zijn in vergelijking met beeldacquisitie instellingen om cumulatieve fototoxiciteit te voorkomen. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig1.jpg" /> Figuur 1. Schematische weergave van de meting van cycline B proteolyse door expressie van een chimeer cycline B derivaat met afbraak soortgelijke kenmerken als de endogene eiwit. De afname in fluorescentie-intensiteit na pulse-chase labeling is een maat APC / C-activiteit. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig2.jpg" /> Figuur 2. Analyse van cellen op 8 en slides of 96 well platen. Verdeling van hetcellen over het oppervlak van de put bereikt door hersuspensie in een eindvolume van 300 pi en wordt aanbevolen, wanneer slechts een of een paar posities handmatig gedefinieerd voor analyse. Verrijking van cellen in het middengebied wordt bereikt door toevoeging van cellen naar het centrum van voorgevulde of lege putjes. Deze techniek wordt aanbevolen in geval van geautomatiseerde beeldacquisitie in verschillende putten. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig3.jpg" /> Figuur 3. Volgorde van de data-acquisitie. A) Detectie van histon H2-GFP wordt gebruikt voor focus vliegtuig definitie en monitoring van chromosomale uitlijning tijdens de mitose. B) fluorescentie-intensiteit van de fluorescentie-intensiteit Star TMR is een maat voor de absolute hoeveelheid pulse-chase gelabeld cycline B-SNAP. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig4.jpg" /> Figuur 4. Vertegenwoordiger Scan ^ R Analyse software-gebaseerde weergave van de gemiddelde TMR Starfluorescentie-intensiteiten (totaal TMRstar intensiteit gedeeld door gebied) tijd. selectie van een representatieve cel trace (blauw). De bijbehorende afbeeldingen (rechts afgebeeld) kan de gelijktijdige visualisatie van histon H2-GFP (groen) en cycline B-SNAP (rood). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4239/4239fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig5.jpg" /> Figuur 5. A + B) Voorbeeld voor gating van punten die een cel van de rente op de XY-dot plot. C) Visualisatie van de gemiddelde TMRstar fluorescentie-intensiteit (totaal TMRstar intensiteit gedeeld door gebied) na verloop van tijd met behulp van de dot plot. D + E) Vertegenwoordiger fluorescentie-intensiteit curve van cycline B-SNAP met isomorfe venster (brigher veld op het schema) tussen NEBD (nucleaire envelop afbraak) en chromatine decondensatie (blauwe balk) zoals gegenereerd in Microsoft Excel. Anafase aangegeven met thij blauwe stip op de curve. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4239/4239fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . Film 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4239/4239movie1.avi" target="_blank">Klik hier om aanvullende film te bekijken</a> .

<ol><li>Musacchio, A., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spindle-assembly+checkpoint+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The spindle-assembly checkpoint in space and time.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 379-393 (2007).</li>
<li>Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregating+sister+genomes%3A+the+molecular+biology+of+chromosome+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Segregating sister genomes: the molecular biology of chromosome separation.</a> Science. 297, 559-565 (2002).</li>
<li>Cahill, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+of+mitotic+checkpoint+genes+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers.</a> Nature. 392, 300-303 (1998).</li>
<li>Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+instabilities+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic instabilities in human cancers.</a> Nature. 396, 643-649 (1998).</li>
<li>Fletcher, D. A., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mechanics+and+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell mechanics and the cytoskeleton.</a> Nature. 463, 485-4892 (2010).</li>
<li>Schnerch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+APC%2FC+activity+in+the+presence+of+chromosomal+misalignment+in+unperturbed+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Monitoring APC/C activity in the presence of chromosomal misalignment in unperturbed cell populations.</a> Cell Cycle. 11, (2012).</li>
<li>Keppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nat. Biotechnol. 21, 86-869 (2003).</li>
<li>Jansen, L. E., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+centromeric+chromatin+requires+exit+from+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis.</a> J. Cell. Biol. 176, 795-805 (2007).</li>
<li>Malureanu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc20+hypomorphic+mice+fail+to+counteract+de+novo+synthesis+of+cyclin+B1+in+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cdc20 hypomorphic mice fail to counteract de novo synthesis of cyclin B1 in mitosis.</a> J. Cell Biol. 191, 313-329 (2010).</li>
<li>Mena, A. L., Lam, E. W., Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+spindle-assembly+checkpoint+response+requires+de+novo+transcription+and+translation+of+cyclin+B1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sustained spindle-assembly checkpoint response requires de novo transcription and translation of cyclin B1.</a> PLoS One. 5, (2010).</li>
<li>Wolthuis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc20+and+Cks+direct+the+spindle+checkpoint-independent+destruction+of+cyclin%5BTitle%5D)+AND+%22A.+Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Cdc20 and Cks direct the spindle checkpoint-independent destruction of cyclin.</a> A. Mol. Cell. 30, 290-302 (2008).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

We presenteren hier een live-cell imaging benadering het vergemakkelijken van de gelijktijdige bewaking van cycline B proteolyse en chromosoom uitlijning. Deze aanpak maakt het mogelijk de studie van de mitotische controle in celpopulaties onverstoorbaar op de enkele cel niveau. Cycline B afbraakcurven vergemakkelijken direct inzicht in de activiteit van de APC / C en daarmee indirect geven de status van de SAC 6. Deze benadering, hoewel vastgesteld op basis van de Scan ^ R softwa...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het product </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> Reporter cellijn </td><td> gegenereerd in-house zoals beschreven 6 </td><td> klonen 11 verslaggever cellen (U2Os gebaseerde cycline B-SNAP expressie brengende cellen) </td><td></td></tr><tr><td> Retrovirale cycline B-SNAP expressievector </td><td> gegenereerd in-house zoals beschreven 6 </td><td> pLNCX2-cycline B mut5-SNAP </td><td></td></tr><tr><td> Fenolrood-vrij DMEM </td><td> Gibco </td><td> 21063-029 </td><td> Suppletie met FCS, natriumpyruvaat, penicilline / strepto-mycin vereist </td></tr><tr><td> SNAP-Cell TMR-Star </td><td> New England Biolabs </td><td> S9105S </td><td> Voorraadoplossing in DMSO 400 uM </td></tr><tr><td> Speciale Opstics Plate, 96 en </td><td> Costar </td&gt; <td> 3720 </td><td></td></tr><tr><td> μ-Slide 8 goed, ibiTreat </td><td> Ibidi </td><td> 80826 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopie eenheid </td><td> Olympus </td><td> IX-81 inverse microscoop met klimaatkamer </td><td></td></tr><tr><td> Objectief </td><td> Olympus </td><td> UPLSAPO 20x objectief (NA 0,75) </td><td></td></tr><tr><td> Acquisitie software </td><td> Olympus </td><td> Scan ^ R Acquisition software (v.2.2.09) </td><td></td></tr><tr><td> Analysis software </td><td> Olympus </td><td> Scan ^ R Analyse software (v.1.2.0.6) </td><td></td></tr></tbody></table>

het bestuderen van proteolyse van cycline b op de enkele cel niveau in hele celpopulaties

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Gelijke verdeling van de chromosomen tussen de twee dochtercellen tijdens de celdeling is een voorwaarde voor het waarborgen van de genetische stabiliteit 1. Onjuistheden in de loop van chromosoom scheiding zijn een kenmerk van maligniteit en geassocieerd met progressieve ziekte 2-4. De assemblage van de spoel checkpoint (SAC) is een mitotische surveillance mechanisme dat tegenhoudt cellen in metafase tot elk chromosoom heeft een stabiele bipolaire gehechtheid aan de mitotische spindel 1. De SAC oefent zijn functie door interferentie met de activerende APC / C subunit Cdc20 voor proteolyse van securin en cycline B en dus chromosoom scheiding en mitotische uitgang blokkeren. Onjuiste bevestiging van chromosomen voorkomt silencing van SAC signalering en veroorzaakt voortgezet remming van APC / C Cdc20 totdat het probleem is opgelost op chromosoom missegregation, aneuploïdie en kwaadaardige gezwellen te voorkomen 1. De meeste studies die de i aangepaktnfluence van onjuiste chromosomale beslag op APC / C-afhankelijke proteolyse maakte gebruik van as verstoring met depolymeriseren of microtubuli-stabiliserende medicijnen te bemoeien met chromosomale gehechtheid aan microtubuli. Omdat interferentie met microtubule kinetiek kan het transport en lokalisatie van kritische regulators beïnvloeden deze procedures voorzien van een risico op het induceren kunstmatige effecten 5. Om te onderzoeken hoe de SAC interfereert met APC / C-afhankelijke proteolyse van cycline B tijdens de mitose in onverstoorbaar celpopulaties, hebben we een histon H2-GFP-gebaseerd systeem waardoor de gelijktijdige monitoring van metafase afstemming van mitotische chromosomen en proteolyse van cycline B 6 . Proteolytische profielen tonen, maakten wij een chimeer cycline B reporter molecuul met een C-terminale deel SNAP 6 (figuur 1). In een zelf-labelingsreactie, de SNAP-groep kan covalente bindingen vormen metalkylguanine-dragers (SNAP substraat) 7,8 (figuur 1). SNAP substraatmoleculen zijn gemakkelijk verkrijgbaar en hebben een breed spectrum van verschillende fluorochromen. Chimere cycline B-SNAP moleculen worden gelabeld na toevoeging van het membraan doorlatend substraat SNAP het kweekmedium 7 (figuur 1). Na de labelingsreactie, de cycline B-SNAP fluorescentie-intensiteit druppels in een pulse-chase reactie-achtige wijze en fluorescentie-intensiteiten tijdens niveaus van cycline B afbraak 6 (figuur 1). Ons systeem vergemakkelijkt de controle op mitotische APC / C-afhankelijke Proteolyse in grote aantallen cellen (of meerdere celpopulaties) in parallel. Daardoor kan het systeem een ​​waardevol instrument om agenten / kleine moleculen die in staat zijn met proteolytische activiteit interfereren bij de metafase anafase om de overgang te identificeren. Bovendien is de synthese van cycline B tijdens mitose Onlangs werd een belangrijk mechanistischm in het bevorderen van een mitotische blok in muizen en mensen door het houden van cycline B expressie niveaus stabiel 9,10, dit systeem ons in staat om cycline B proteolyse te analyseren als een element van een evenwichtige balans 6.

Metafase naar anafase transitie wordt geactiveerd door middel van anafase-bevorderende complex (APC / C)-afhankelijke ubiquitinering en de daarop volgende vernietiging van cycline B. Hier hebben we een systeem dat, na pulse-chase etikettering, maakt het monitoren cycline B proteolyse in hele cel populaties en vergemakkelijkt de detectie van inmenging van de mitotische checkpoint.

Het bestuderen van Proteolyse van cycline B op de enkele cel niveau in Hele celpopulaties

Een gelijke verdeling van chromosomen tussen de twee dochtercellen tijdens de celdeling is een vereiste voor het waarborgen van de genetische stabiliteit 1. Onnauwkeurigheden ...

Het doel van deze procedure is om te monitoren hoe proteolyse van cycling B het begin van de anafase en het einde van de mitose reguleert. Dit wordt bereikt door eerst cycling B snap reporter cellen uit te zaaien op microscopie-objectglazen. De tweede stap is het labelen van het chimere Cyclin B snap reporter molecuul met het fluorescerende substraat TMR star.Vervolgens worden de beeldreeksen vastgelegd bij een microscopiestation. De laatste stap is het analyseren van de cellen en het berekenen van de fluorescentie-intensiteit van TMR-ster over de tijd, wat de proteolyse van cycling B weerspiegelt. Uiteindelijk onthult immunofluorescentiemicroscopie van levende reportercellen de kinetiek van de proteolyse van cycling B die plaatsvindt tijdens de mitose.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals het monitoren van cyclone BGFP, is dat cyclone B SNAP het mogelijk maakt om de degradatie van cyclone B te monitoren in plaats van de expressie van het volledige eiwit. De snap-reportercellen voor dit experiment mogen in eerste instantie gedurende ten minste 48 uur asynchroon groeien in de logaritmische fase. Om te beginnen is de procedure voor he

studying-proteolysis-cyclin-b-at-single-cell-level-whole-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

FRET-gebaseerde reporters steeds vaker gebruikt voor het kinase en fosfatase activiteiten in levende cellen te volgen. Hier beschrijven we een methode voor het FRET-gebaseerde verslaggevers gebruiken om celcyclus-afhankelijke veranderingen te beoordelen in doel fosforylering.

Monitoring Kinase en fosfatase activiteiten door middel van de celcyclus door Ratiometrische FRET

Het bepalen van de celcyclus positie van een populatie van cellen, of begrijpen hoe signalen proliferatie van invloed zijn, gemakkelijk kan worden gemeten door middel van flowcytometrie gebruik van dit protocol. We brengen verslag uit een eenvoudige experimentele benadering voor vlekken cellen en kwantificeren van hun positie in de cel cyclus.

Analyse van celcyclus Positie in zoogdiercellen

Om de relatie tussen eiwithomeostase, stress en veroudering te bestuderen, hebben we veranderingen in eiwitvouwing gemonitord door eiwitdisfunctie, eiwitlocalisatie in de cel en eiwitstabiliteit op organismisch, cellulair en eiwitniveau te volgen, met behulp van de genetisch hanteerbare metazoa Caenorhabditis elegans als modelsysteem.

Gebruik Caenorhabditis elegans Als een modelsysteem voor de Protein Homeostase studeren in een meercellige

Wij rapporteren een inrichting en een nieuwe werkwijze om cellen en embryo bestuderen. Enkele cellen worden nauwkeurig gerangschikt in microcavity arrays. Hun 3D opsluiting is een stap in de richting 3D-omgevingen aangetroffen in fysiologische omstandigheden en maakt het organel oriëntatie. Door het regelen van celvorm, deze opstelling minimaliseert variatie gerapporteerd in standaardtesten.

Het bestellen van enkele cellen en Single Embryo&#39;s in 3D Opsluiting: een nieuw apparaat voor High Content Screening

Hier schetsen we hoe we de mitochondriale lokalisatie van een (celcyclus) kinase kunnen bestuderen, en hoe we de sub-mitochondriale locatie evenals potentiële mitochondriale substraten/doelen kunnen bepalen. Gedwongen expressie van eiwitten in de mitochondriën biedt een nuttige tool voor het bestuderen van de functionele consequenties van de mitochondriale lokalisatie van een eiwit van belang.

Experimentele benaderingen om te studeren mitochondriale lokalisatie en functie van een nucleair celcyclus Kinase, Cdk1

Het aanbod van eiwitten weerspiegelt de snelheden van zowel eiwitsynthese als eiwitafbraak. Dit artikel beschrijft het gebruik van cycloheximide-chase gevolgd door western blotting om eiwitafbraak te analyseren in het model eencellige eukaryoot, Saccharomyces cerevisiae (knopgist).

Cycloheximide Chase Analyse van de afbraak van eiwitten in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

We rapporteren twee celsynchronisatieprotocollen die een context bieden voor het bestuderen van gebeurtenissen die verband houden met specifieke fasen van de celcyclus. We tonen aan dat deze aanpak nuttig is voor het analyseren van de regulering van specifieke genen in een ongeblokkeerde celcyclus of bij blootstelling aan agens die de celcyclus beïnvloeden.

Het bestuderen van celcyclusreguleerde genuitdrukking door twee complementaire celsynchronisatieprotocollen

Cycline-afhankelijk kinase 1 (Cdk1) wordt geactiveerd in de G2-fase van de celcyclus en regelt veel cellulaire routes. Hier presenteren we een protocol voor een kinase in vitro assay met Cdk1, dat voorziet in de identificatie van Cdk1-specifieke fosforylatie sites vaststelling van cellulaire doelen van deze belangrijke kinase.

Identificatie van cycline-afhankelijk Kinase 1 specifieke fosforylatie Sites door een Kinase In Vitro Assay

Door encapsulating ei extracten van Xenopus laevis in water-in-olie micro presenteren we een methode voor het genereren van in vitro zichzelf onderhoudende mitotische oscillaties op het niveau van eencellige.

Reconstructie van de celcyclus oscillaties in Micro van cel-vrije Xenopus ei extracten

Hierin beschrijven we twee benaderingen om celpolarisatie gebeurtenissen in B-lymfocyten te karakteriseren tijdens de vorming van een IS. De eerste, omvat de kwantificering van organel recruitment en cytoskelet herschikkingen op het synaptische membraan. De tweede is een biochemische benadering, om veranderingen in de samenstelling van het zwaartepunt te karakteriseren, die polarisatie ondergaat op het immuunsysteem Synapse.

Het bestuderen van organelle dynamica in B-cellen tijdens immuun Synapse vorming

Dit protocol beschrijft twee methoden voor het stoppen van de gistcelcyclus en optionele afgifte, en gaat dieper in op het gebruik van fluorescentiemicroscopie om celcyclusafhankelijke processen in S. cerevisiae te bestuderen.

Manipulatie en analyse van celcyclusafhankelijke processen in ontluikende gist

Leer hoe cycline B-proteolyse anafase-aanvang reguleert met behulp van fluorescentielabeling en levende celmicroscopie. Deze methode maakt real-time monitoring van eiwitafbraak tijdens mitose mogelijk.

Het bestuderen van Proteolyse van cycline B op de enkele cel niveau in Hele celpopulaties

Meer video's verkennen