Het bestuderen van Proteolyse van cycline B op de enkele cel niveau in Hele celpopulaties

Het doel van deze procedure is om te monitoren hoe de proteolyse van cycline B het begin van de anafase en het einde van de mitose reguleert. Dit wordt bereikt door eerst cycline B snap-reportercellen op microscopiepreparaten uit te zaaien. De tweede stap is het labelen van het chimerische cycline B snap-reportermolecuul met het fluorescerende substraat TMR star.

Vervolgens worden de beeldseries opgenomen bij een microscopiestation. De laatste stap is het analyseren van de cellen en het berekenen van de fluorescentie-intensiteit van TMR-star over de tijd, wat de proteolyse van cycling B weerspiegelt. Uiteindelijk onthult immunofluorescentiemicroscopie van levende reportercellen de kinetiek van de proteolyse van cycling B die plaatsvindt tijdens de mitose.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals het monitoren van cyclone BGFP, is dat cyclone B SNAP het mogelijk maakt om de degradatie van cyclone B te monitoren in plaats van de expressie van het volledige eiwit. De snap-reportercellen voor dit experiment mogen aanvankelijk gedurende ten minste 48 uur asynchroon groeien in de logfase. Om te beginnen is de procedure voor het zaaien met trypsine dat de subconfluente snap-reportercellen worden gezaaid in microscopiekamers met acht putjes, met een constante verdeling over het gehele oppervlak van de kamercentrifuge.

Resuspendeer 10 000 cellen in 350 µL van een normaal groeimedium zonder fenolrood. Breng de celsuspensie over naar de microscoopkamer om de cellen te zaaien in microscoopkamers met acht putjes, met een maximale celdichtheid in het centrum van de kamer. Vul de kamer eerst met 300 µL van het normale groeimedium zonder fenolrood.

Voeg vervolgens voorzichtig 5, 000 cellen toe aan het midden van de microscopiekamer om de cellen op 96-well speciale optische platen uit te zaaien met een constante distributie over het gehele oppervlak van de well. Centrifugeer 5, 000 cellen en resuspendeer deze in 300 µL fenolroodvrij normaal groeimedium, afhankelijk van het totale aantal benodigde wells met cellen. Pas het aantal cellen en het totale volume van het suspensiemedium aan.

Breng vervolgens de cel-suspensie over naar een 96-wellplaat om de cellen uit te zaaien op 96-well speciale optica-platen met de maximale celdichtheid in het centrum van de well. Voeg voorzichtig 1 500 cellen in 15 µL fenolroodvrij normaal groeimedium als een kleine druppel toe aan het centrum van elke well.

Dit zal de celgroei beperken tot het centrum van het putje. Laat alle gezaaide cellen minstens 18 uur groeien onder standaard celkweekcondities vóórdat de kleuringsprocedure begint (30 minuten voorafgaand aan de start). Verwarm aliquots van normaal groeimedium zonder fenolrood op tot 37 °C.

Het snap-substraat in deze demonstratie is TMR star voor een eenvoudige hantering van de TMR star; los TMR star op in DMSO om een stamoplossing met een concentratie van 400 micromolar te verkrijgen. Verdun 0,5 microliters van de TMR star-stamoplossing in 200 microliters warm, fenolrood-vrij normaal groeimedium om een uiteindelijke labelingsconcentratie van één micromolar te verkrijgen. Verwijder vervolgens het normale groeimedium van de asynchroon groeiende cellen en vervang dit door labelingsmedium; incubeer de cellen gedurende 25 minuten in het labelingsmedium onder standaard kweekcondities.

Verwijder na 25 minuten het labelingsmedium en was de cellen vier keer met warm, fenolroodvrij normaal groeimedium. Na de laatste wasbeurt worden de cellen gedurende 30 minuten geïncubeerd in 300 µL warm, fenolroodvrij normaal groeimedium voordat ze naar de microscoop worden getransporteerd. Vervang het medium door vers, warm, fenolroodvrij normaal groeimedium om resterend ongebonden snaps-substraat te verwijderen; transporteer de cellen naar de microscoop in een piepschuimdoos op een voorverwarmd warmteblok van 37 °C.

Om temperatuurvariaties te minimaliseren, dient twee uur vóór de meting van de fluorescentie-intensiteit de luchttemperatuur van de klimaatkamer in de droge modus op 37 °C te worden ingesteld, zodat de microscoop en alle componenten de gewenste temperatuur bereiken. Om condensatie en daaruit voortvloeiende schade aan de microscoop te voorkomen, is het belangrijk om eerst voor te verwarmen voordat de luchtvochtigheid wordt ingesteld.

Wanneer het volledige microscopiesysteem 37 °C heeft bereikt, stelt u de luchtvochtigheid in op 60% en het koolstofdioxidegehalte op 5%. Start de scan- of acquisitiesoftware en definieer de standaardinstellingen. Definieer de posities van de wells die geanalyseerd moeten worden. Definieer de delta T of acquisiecyclusduur en het absolute aantal acquisiecycli.

In deze demonstratie is de hardwarematige autofocus vooraf geselecteerd voor de analyse van een groter aantal wells. Start de acquisitie en houd toezicht tijdens de eerste twee acquisitiecycli.

De microscoop zal scherpstellen op het histone H2 GFP-signaal, gevolgd door de acquisitie van een eerste beeld in dat kanaal voordat het filter wordt gewijzigd en het corresponderende TMR-star-beeld wordt verkregen. Dit wordt herhaald voor alle posities binnen een putje en voor elk van de te onderzoeken putjes voordat de volgende cyclus opnieuw wordt gestart. Om proteolytische profielen te analyseren, start u de scan R-analysesoftware.

Analyseer de afbeeldingen waarin de celkernen zichtbaar zijn gemaakt door histone H2 GFP, gedefinieerd als het hoofdobject met behulp van een drempelwaarde op basis van signaalintensiteit en een watershed-algoritme om te helpen bij het scheiden van naburige cellen. Voor de TMR*-analyse moet een subobject worden gecreëerd dat bestaat uit de kern met cytoplasma. Belangrijke eigenschappen van het hoofdobject zijn de X- en Y-posities, de tijd, de maximale en gemiddelde intensiteiten van GFP voor het hoofdobject en de totale intensiteit gedeeld door het oppervlak.

Wijzig voor het TMR-star subobject naar de trace-modus om de gemiddelde TMR-star fluorescentie-intensiteit van het subobject over de tijd te visualiseren, of de celtraces die zijn toegewezen aan de geanalyseerde hoofdobjecten. Het bekijken van grote aantallen cellen maakt een eerste representatief en objectief overzicht mogelijk, maar het aantal te onderzoeken cellen kan worden beperkt door te gaten op metingen die ten minste 140 cycli duren en een grote maximale histone H2 GFP-intensiteit bevatten. Selecteer een celtrace van belang om histone H2 GFP en TMR-star fluorescentie gelijktijdig op single-cell niveau te visualiseren.

Klik met de rechtermuisknop op een cel van belang en genereer een exporteerbare afbeelding. Galerij ter illustratie van histon H2 GFP en cycling B snap TMR star voor elk enkel tijdstip. Schakel over naar de populatiemodus van de scanner-analysesoftware en gate de regio waar de cel van belang op de dot blot wordt weergegeven.

Pas een nieuw dot plot-venster toe op de gegate regio en visualiseer de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van TMR star over de tijd. Exporteer de gegevens naar Microsoft Excel voor verdere berekeningen. De figuren hier beelden de kinetiek van Cycline B uit, weergegeven door een fluorescentie-intensiteitscurve van TMR star van een cel die een normale mitose doorloopt zonder tekenen van chromosomale misalignering bij compactie van het cytoplasma na afbraak van de kernenvelop of NEBD, zoals aangegeven door de rode driehoek; de fluorescentie-intensiteit van TMR star vertoont een abrupte stijging totdat het isomorfe venster is bereikt.

Wanneer de cel de prometafase ingaat, blijft de fluorescentie-intensiteit op een stabiel niveau zolang de cel de profase en metafase doorloopt, om vervolgens snel te dalen. Zodra alle chromosomen een stabiele metafaseplaat hebben gevormd, gaat deze daling vooraf aan de chromosoomscheiding. Tijdens de anafase, aangegeven door de blauwe stip op de curve in de late mitose, begint het chromatine te decondenseren en neemt de cel de morfologie van de telofase aan.

Terwijl de fluorescentie-intensiteitscurve het plateau nadert, dat lager is dan het plateau vóór de mitose na de ontwikkeling ervan. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het vakgebied van de mitose om het nauwe evenwicht tussen cycli, degradatie en synthese te verkennen dat de mitotische progressie reguleert.