Het bestuderen van Proteolyse van cycline B op de enkele cel niveau in Hele celpopulaties

Het doel van deze procedure is om te monitoren hoe proteolyse van cycling B het begin van de anafase en het einde van de mitose reguleert. Dit wordt bereikt door eerst cycling B snap reporter cellen uit te zaaien op microscopie-objectglazen. De tweede stap is het labelen van het chimere Cyclin B snap reporter molecuul met het fluorescerende substraat TMR star.

Vervolgens worden de beeldreeksen vastgelegd bij een microscopiestation. De laatste stap is het analyseren van de cellen en het berekenen van de fluorescentie-intensiteit van TMR-ster over de tijd, wat de proteolyse van cycling B weerspiegelt. Uiteindelijk onthult immunofluorescentiemicroscopie van levende reportercellen de kinetiek van de proteolyse van cycling B die plaatsvindt tijdens de mitose.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals het monitoren van cyclone BGFP, is dat cyclone B SNAP het mogelijk maakt om de degradatie van cyclone B te monitoren in plaats van de expressie van het volledige eiwit. De snap-reportercellen voor dit experiment mogen in eerste instantie gedurende ten minste 48 uur asynchroon groeien in de logaritmische fase. Om te beginnen is de procedure voor het zaaien met trypsine het gebruik van subconfluente snap-reportercellen voor het zaaien van cellen op eight-well microscopiekamers, met een constante distributie over het gehele oppervlak van de centrifugekamer.

Resuspendeer 10.000 cellen in 350 µL van een fenolroodvrij normaal groeimedium. Overbreng de celsuspensie naar de microscopiekamer voor het zaaien van cellen op microscopiekamers met acht putjes, met een maximale celdichtheid in het centrum van de kamer. Vul de kamer eerst met 300 µL fenolroodvrij normaal groeimedium.

Voeg vervolgens voorzichtig 5.000 cellen toe aan het midden van de microscopiekamer voor het uitplaten van cellen op speciale optische 96-wells platen, met een constante distributie over het gehele oppervlak van de well. Centrifugeer 5.000 cellen en resuspendeer deze in 300 µL fenolroodvrij normaal groeimedium, afhankelijk van het totale aantal benodigde wells met cellen. Pas het aantal cellen en het totale volume van het suspensiemedium aan.

Breng vervolgens de celsuspensie over naar een 96-wellplaat voor het uitplaten van cellen op speciale optische 96-wellplaten, waarbij de maximale celdichtheid in het centrum van de well ligt. Voeg voorzichtig 1.500 cellen in 15 µL fenolroodvrij normaal groeimedium als een kleine druppel toe aan het centrum van elke well.

Dit zal de celgroei beperken tot het centrum van de well. Laat alle gezaaide cellen gedurende ten minste 18 uur groeien onder standaard celkweekcondities, 30 minuten vóór aanvang van de kleuringsprocedure. Warm aliquots van normaal groeimedium zonder fenolrood op tot 37 °C.

Het snap-substraat in deze demonstratie is TMR-star; voor een eenvoudige hantering wordt TMR-star opgelost in DMSO om een stamoplossing met een concentratie van 400 µM te verkrijgen. Verdun 0,5 µL van de TMR-star stamoplossing in 200 µL warm, fenolroodvrij normaal groeimedium om een uiteindelijke labelingsconcentratie van 1 µM te verkrijgen. Verwijder vervolgens het normale groeimedium van de asynchroon groeiende cellen en vervang dit door het labelingsmedium. Incubeer de cellen gedurende 25 minuten in het labelingsmedium onder standaard kweekcondities.

Verwijder na 25 minuten het labelingsmedium en was de cellen vier keer met warm normaal groeimedium zonder fenolrood. Incubeer de cellen na de laatste wasbeurt 30 minuten in 300 microliters warm normaal groeimedium zonder fenolrood voordat ze naar de microscoop worden getransporteerd. Vervang het medium door vers, warm normaal groeimedium zonder fenolrood om resterend ongebonden snaps-substraat te verwijderen. Transporteer de cellen naar de microscoop in een piepschuimdoos op een voorverwarmd warmteblok van 37 degree Celsius.

Om temperatuurschommelingen te minimaliseren, dient men twee uur vóór de meting van de fluorescentie-intensiteit de luchttemperatuur van de klimaatkamer in de droge modus in te stellen op 37 °C, zodat de microscoop en alle componenten de gewenste temperatuur bereiken. Om condensatie en daarmee gepaard gaande schade aan de microscoop te voorkomen, is het belangrijk om voor te verwarmen voordat de luchtvochtigheid wordt ingesteld.

Zodra het gehele microscopiesysteem 37 °C heeft bereikt, wordt de luchtvochtigheid ingesteld op 60% en de koolstofdioxidespiegel op 5%. Start de scan- of acquisitiesoftware en definieer de standaardinstellingen. Bepaal de posities van de wells die geanalyseerd moeten worden. Definieer de delta T of de acquisitiecyclusduur en het absolute aantal acquisitiecycli.

In deze demonstratie is hardware-autofocus vooraf geselecteerd voor de analyse van een groter aantal wells. Start de acquisitie en houd toezicht over de eerste twee acquisitiecycli.

De microscoop zal focussen op het histon H2 GFP-signaal, waarna een eerste beeld in dat kanaal wordt vastgelegd voordat het filter wordt gewisseld en het overeenkomstige TMR-star-beeld wordt verkregen. Dit proces wordt herhaald voor alle posities binnen een putje en voor elk van de te onderzoeken putjes voordat de volgende cyclus opnieuw wordt gestart. Om proteolytische profielen te analyseren, start dan de scan R-analysesoftware.

Analyseer de beelden met de celkernen zoals gevisualiseerd door histone H2 GFP, gedefinieerd als het hoofdobject met behulp van een drempelwaarde op basis van signaalintensiteit en een watershed-algoritme om te helpen bij het scheiden van naburige cellen. Voor de TMR*-analyse moet een subobject worden gemaakt bestaande uit de kern met cytoplasma. Belangrijke eigenschappen van het hoofdobject zijn de X- en Y-posities, tijd en de maximale en gemiddelde intensiteiten van GFP voor het hoofdobject en de totale intensiteit gedeeld door het oppervlak.

Kies voor het TMR star-subobject de trace-modus om de gemiddelde TMR star-fluorescentie-intensiteit van het subobject over de tijd te visualiseren, of de celtraces die zijn toegewezen aan de geanalyseerde hoofdobjecten. Het bekijken van een groter aantal cellen biedt een eerste representatief en objectief inzicht, maar het aantal te onderzoeken cellen kan worden beperkt door te gaten op metingen die ten minste 140 cycli duren en een hoge maximale histone H two GFP-intensiteit bevatten. Selecteer een celtrace van belang om histone H two GFP en TMR star fluorescentie gelijktijdig op enkelcelniveau te visualiseren.

Klik met de rechtermuisknop op een cel van interesse en genereer een exporteerbare afbeelding. Galerij ter illustratie van histon H2 GFP en cycling B snap TMR ster voor elk enkel tijdstip. Schakel over naar de populatiemodus van de scanner-analysesoftware en gate de regio waar de cel van interesse op de dot blot is weergegeven.

Pas een nieuw dot-plot-venster toe op de gegate regio en visualiseer de gemiddelde TMR star-fluorescentie-intensiteit over de tijd. Exporteer de gegevens naar Microsoft Excel voor verdere berekeningen. De figuren hier tonen de Cycline B-kinetiek, weergegeven door een TMR star-fluorescentie-intensiteitscurve van een cel die een normale mitose doorloopt zonder tekenen van chromosomale misalignement bij compactie van het cytoplasma na afbraak van de kernenvelope of NEBD, zoals aangegeven door de rode driehoek. De TMR star-fluorescentie-intensiteit vertoont een abrupte stijging totdat het isomorfe venster is bereikt.

Wanneer de cel de prometafase ingaat, blijft de fluorescentie-intensiteit op een stabiel niveau zolang de cel de profase en metafase doorloopt, om vervolgens snel te dalen. Zodra alle chromosomen een stabiele metafaseplaat hebben gevormd, gaat deze daling vooraf aan de chromosoomscheiding. Tijdens de anafase, aangegeven door de blauwe stip op de curve in de late mitose, begint het chromatine te decondenseren en krijgt de cel een interfase-morfologie.

Terwijl de fluorescentie-intensiteitscurve het plateau nadert, dat lager is dan het plateau vóór de mitose na de ontwikkeling ervan. Deze techniek baande de weg voor onderzoekers in het vakgebied van de mitose om het nauwe evenwicht tussen cyclische afbraak en synthese te onderzoeken dat de mitotische progressie reguleert.