Een praktische en nieuwe methode om Genomic DNA Uittreksel uit Bloedafname Kits voor Plasma Protein Preservation

In deze video wordt een praktische en innovatieve methode beschreven om genomisch DNA te extraheren uit het nieuwe BDP 100 plasmaproteïnebewaaringssysteem, aangeduid als P 100-buisjes. TNA. Extractie uit serum- en plasmabuisjes was in het verleden een vrij gangbare procedure, maar de combinatie van dit nieuwe P 100-buisje en de hier gepresenteerde extractiemethode biedt een nieuwe, eenvoudigere benadering om DNA van betere kwaliteit te verkrijgen met aanzienlijk minder inspanning. De binnenkant van het P 100-buisje is gecoat met kalium-EDTA en protease-remmers.

Dit voorkomt stolling en stabiliseert plasmaproteïnen. Bloed wordt in deze buizen verzameld om na centrifugatie plasma te kunnen winnen voor testen. Bloed in een P 100 zal zich scheiden in lagen op basis van dichtheid, met plasma aan de bovenkant, rode bloedcellen aan de onderkant en witte bloedcellen.

De buffykop bevindt zich tussen deze twee lagen. Het winnen van plasma is over het algemeen het primaire gebruik van deze buizen. Met dit plasma worden verschillende metingen uitgevoerd, zoals het bepalen van antilichaam- en proteïneniveaus.

De buffy coat wordt doorgaans weggegooid, maar zoals in deze video zal worden aangetoond, bevat deze voldoende DNA voor verschillende analyses, waaronder sequenering, genotypering, identificatie van biomarkers en dergelijke. P one hundreds bestaan uit drie hoofdonderdelen: de dop, de buis en de separator. De mechanische separator migreert naar een positie vlak boven de buffy coat-laag.

Om toegang te krijgen tot de buffy coat, is het noodzakelijk om de afstand tussen de separator en de buffy coat te vergroten. Dit wordt bereikt door de toevoeging van 17%sucrose. De buffy coat wordt normaal gesproken samen met de P 102 weggegooid, maar zoals in deze video zal worden aangetoond, is het mogelijk om gemakkelijk voldoende DNA uit deze laag te winnen om verschillende analytische tests uit te voeren voordat P 100-buisjes uit de vriezer van minus 80 °C worden gehaald.

Verwarm een waterbad voor tot 37 °C, plaats elke P 100-buis in het warme waterbad en incubeer gedurende ongeveer vijf minuten om alle monsters te ontdooien. Zodra alle monsters volledig zijn ontdooid, moet eventueel serum dat zich boven de separator bevindt, worden verwijderd. Voeg vervolgens 5 mL 17% sucrose toe boven de separator. Centrifugeer na toevoeging van de sucrose alle buizen gedurende 20 minuten bij 2.500 G. Nu de separator zich aan de bovenkant van de buis bevindt en is losgekomen van de buffy coat, kan deze eenvoudig worden verwijderd.

Spray 70%ethanol op een chemisch schoonmaakdoekje en steriliseer een papercliphaak door het gehele oppervlak grondig af te vegen. Houd de P 100 buis onder een hoek van 45 graden ten opzichte van de steriele paperclip. Begin de separator uit de buis te werken door voorzichtig aan de rand van de separator te trekken en deze in een biohazardzak te geleiden.

Verwijder, nadat de scheidingswand is uitgehaald, zoveel mogelijk van de 17%sucrose-laag zonder de buffy coat of de rode bloedcellagen te verstoren; de buffy coat moet nu de bovenste laag in de buis zijn. Breng deze laag over naar een nieuwe, gelabelde conische buis van 15 milliliter. Het volume aan buffy coat dat per buis wordt verwijderd zal variëren, maar moet minder dan drie milliliter zijn.

Om het volume van alle buizen te normaliseren, voegt u voldoende PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing) toe om het volume van elke buis op drie milliliter te brengen. Nu alle buffycoats zijn gesuspendeerd in een gelijk volume, moeten eventuele resterende rode bloedcellen worden verwijderd door toevoeging van negen milliliter RBC-lysisoplossing (rode bloedcellen).

Keer de buizen vervolgens meerdere keren om tijdens een incubatie van 10 minuten bij kamertemperatuur om de gelyseerde rode bloedcellen van de buffy coat te scheiden. Centrifugeer vijf minuten bij 2.500 G; centrifugeren creëert een pellet waaruit het DNA zal worden geëxtraheerd. Giet dit afval uit elke buis in een opvangbak voor biologisch gevaarlijk vloeibaar afval, waarbij een klein volume achterblijft waarin de pellet zal worden resuspenderd. Vortex de buis om de pellet los te maken en te resuspenderen.

Voeg drie milliliter cellysisoplossing toe en vortex krachtig gedurende ten minste 10 seconden. Nadat de cellen zijn gelyseerd, zijn de eiwitten en het DNA nu vrij gesuspendeerd in de oplossing en moeten deze worden gescheiden; begin met het neerslaan van de eiwitten met behulp van één milliliter eiwitprecipitatie-oplossing en vortex op een hoge stand gedurende ten minste 15 seconden. Centrifugeer de buizen vervolgens vijf minuten bij 2 500 G om de eiwitten tijdens deze centrifugatie te pelletteren.

Stap op passende wijze. Label voor elk monster dat in een nieuwe buis wordt verwerkt één conische buis van 15 milliliter. Breng drie milliliter 100% isopropanol over.

Zodra de eiwitten zijn neergeslagen en gecentrifugeerd, moet elke buis een relatief grote pellet en een transparant, grotendeels kleurloos supernatant bevatten. Decanteer het DNA-bevattende supernatant van elke buis in de overeenkomstige isopropanolbuis die tijdens de laatste stap is voorbereid; de isopropanol moet ervoor zorgen dat het DNA in de oplossing neerslaat als kleine, witte, draderige slierten. Keer alle buizen 50 keer om om een goede menging te waarborgen. Centrifugeer vervolgens alle buizen gedurende drie minuten bij 2.500 G om een DNA-pellet te vormen; het DNA is gewoonlijk zichtbaar als een kleine witte pellet op de bodem van de buis. Een lage DNA-opbrengst kan echter onzichtbaar zijn voor het oog. Ga door met alle extracties totdat de concentraties zijn gemeten.

Ongeacht de aanwezigheid van een DNA-pellet, gooi het isopropanol en SDS weg. Was het DNA door 70% ethanol toe te voegen. Dit verwijdert eventuele resterende ongewenste componenten die latere analyses kunnen verstoren; centrifugeer gedurende één minuut bij 2.500 G. Om te garanderen dat het DNA-pellet goed aan de bodem van de buis hecht, gooi alle 70% ethanol uit de buizen weg en keer deze vervolgens om op een schoon papieren handdoek om één uur aan de lucht te drogen.

Er mag geen zichtbare ethanol in de buisjes achterblijven bij het vervolgen van het protocol. De laatste stap in de extractie is het resuspenderen van het DNA in een oplossing. Zowel een DNA-hydratatie-oplossing als water zijn adequate opties voor de meeste extracties.

Voeg voor monsters die weinig of geen zichtbare DNA-pluimen of pellets produceren 250 µL DNA-hydratatieoplossing minder toe; vortex het DNA voorzichtig en stapsgewijs om het te suspendere. Draag vervolgens al het gesuspendeerde DNA over naar een centrifugeerbuis. Op dit punt kunnen de concentratie en zuiverheid van het DNA worden bepaald met een NanoDrop of een andere spectrofotometer.

Over het algemeen wordt verwacht dat de zuiverheid van het DNA vergelijkbaar is met die van DNA dat direct is geëxtraheerd uit volbloed, verkregen uit kalium-EDTA-buizen die uitsluitend zijn afgenomen voor het terugwinnen van DNA. De DNA-concentratie is afhankelijk van de hoeveelheid startmateriaal, maar kan variëren van 50 nanograms per microliter tot bijna 1000 nanograms per microliter, met een gemiddelde in de range van 200 nanograms per microliter. Het voordeel van het gebruik van dit protocol is tweeledig. Ten eerste stelt het clinici in staat om één bloedafname te gebruiken voor twee klinische tests in plaats van twee keer bloed af te nemen.

Ten tweede vereenvoudigt het het proces van het verkrijgen van toegang tot DNA-bevattende cellen door gebruik te maken van moderne mechanische scheidingsbuisjes in plaats van eerdere generaties. Bij gel-scheidingsbuisjes van de vorige generatie fungeerden zowel de gel-separator zelf als een bloedstolsel als barrières voor de DNA-bevattende cellen. Bij P 100-buisjes kan de mechanische separator eenvoudig worden verwijderd door middel van dichtheidsscheiding met 17% Sucrose.

Dit is een screenshot van de NanoDrop-meting van een gemiddelde DNA-extractie. Bij gebruik van deze methode per monster P 109 resulteerde de extractie in een oplossing van 250 µL met een DNA-concentratie van 209 ng/µL. De totale opbrengst was ongeveer 52 µg.

De 260/280-ratio, de primaire maatstaf voor DNA-zuiverheid, viel met 1,88 binnen het optimale bereik van 1,8 tot 1,9. Een secundaire maatstaf voor DNA-zuiverheid, de 260/230-ratio, lag met 2,35 nabij het verwachte bereik van 2,0 tot 2,2.

Dit zijn vrij typische resultaten. In de praktijk zullen extracties variëren in opbrengst en kwaliteit, afhankelijk van het volume en de toestand van het bloed voorafgaand aan de extractie met behulp van standaard gelelektroforese met thiobromide-kleuring. Verdere kwaliteitscontroles tonen aan dat genomisch DNA dat uit P 100-buizen is geëxtraheerd, even intact is als DNA dat uit volbloed is geëxtraheerd.

Dit is duidelijk aan de heldere, dikke band die verschijnt aan de bovenkant van elke baan die genomisch DNA bevat. Er zijn twee grote voordelen aan het gebruik van dit protocol in plaats van eerdere methoden. Ten eerste combineert het wat normaal gesproken twee bloedafnames zou zijn tot één.

Ten tweede is dit protocol sneller en schoner dan een protocol waarbij typische SST-gelseparatieruizen worden gebruikt. Doordat het routinematig openbreken van gestold bloed niet langer noodzakelijk is, nemen clinici twee buizen bloed af wanneer genetische en serologische tests vereist zijn. Over het algemeen wordt een SST-gelseparatiebuis (een zogenaamde gold top) en een kalium-EDTA-buis (een zogenaamde purple top) afgenomen, waarbij serum uit de SST-buis wordt verwijderd en DNA uit de purple top-buis wordt geëxtraheerd. Door deze methode te gebruiken is het enkel nodig om één enkele red top P 100-buis af te nemen.

Hoewel instellingen die bekend zijn met de gel-separatormethode voor DNA-extractie mogelijk al één buis afnemen voor zowel serologische als genetische tests, vormt de hier gepresenteerde methode een incrementele maar substantiële verbetering ten opzichte van deze bestaande gel-separatormethoden. Beide methoden vereisen het verwijderen van een vorm van separator, hoewel gel doorgaans minder overzichtelijk is dan plastic gel.

Scheidingsbuisjes vereisen dat gestold bloed voorafgaand aan de DNA-extractie door een metaalgaas wordt gehomogeniseerd. Deze homogenisatie kan slordig verlopen, en DNA-extractie blijkt moeilijker wanneer rode bloedcellen, die geen DNA bevatten, in aanzienlijke hoeveelheden aanwezig zijn. Deze P 100-extractiemethode maakt het mogelijk om DNA-bevattende witte bloedcellen te scheiden van het hematocriet, waardoor er weinig rode bloedcellen overblijven die de DNA-extractie kunnen beïnvloeden.

Dit systeem voor het terugwinnen van DNA uit een P 100 plasmabuis in plaats van de gel-separatorbuizen van de vorige generatie biedt vele voordelen. P 100 buizen bevatten EDTA, wat magnesiumafhankelijke endonucleasen remt, en een antistollingsmiddel om bloedstolling te voorkomen. Het eindresultaat is een hogere DNA-integriteit via een veel eenvoudiger extractieprotocol, waarbij met name het opbreken en homogeniseren van gestold bloed wordt vermeden.

Daarnaast kan het plasma-gedepleteerde bloed onbepaald, tot maximaal drie jaar, worden bewaard in P 100-buisjes totdat de extractie van DNA gewenst is. Bovendien kunnen clinici nuttigere patiëntgegevens genereren met minder bloedafnames en daarmee minder stress voor de patiënten die de procedures ondergaan.