Name: Een Explantatie Assay voor het beoordelen van cellulair gedrag van de craniale mesenchym (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Leer een ex vivo explantatie-assay om cellulair gedrag van craniale mesenchym te bestuderen tijdens neurulatie bij muizenembryo's. Deze methode maakt farmacologische manipulaties en live imaging mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk wordt ondersteund door R01-HD058629 te IEZ

1. Voorbereiding van ECM Coated Cultuur gerechten of Dekglaasjes <ol><li> Bereid ECM stock oplossing door oplossen ECM substraat in PBS (Dulbecco&#39;s fosfaat gebufferde zoutoplossing, Invitrogen, # 14040-133). Filtreer een 0,2 mm spuitfilter (VWR, # 28145-495) en vries in aliquots bij -80 ° C. </li><li> Verdun ECM stock oplossing in PBS gewenste concentratie. Voor MaxGel verdunnen in DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium, Invitrogen, # 11995-065). </li><li> Als immunofluorescentie zal worden uitgevoerd, steriliseren 12 mm ronde dekglaasjes (VWR, # +89,015-724) door dompelen in ethanol en laat aan de lucht drogen. Dit dient te gebeuren in de steriele laminaire kap. Als immunofluorescentie wordt niet uitgevoerd doorgaan naar 1,5 stap. </li><li> Plaats gesteriliseerd dekglaasjes in elk putje van een plaat met 24 putjes (Corning, # 3526). </li><li> Voeg 0,5 ml van het verdunde substraatoplossing aan elke well van 24 wells-plaat en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 uur. </li><li> Zuig uit de ECM-oplossing en was three keer in PBS. </li><li> Aspireren uit PBS en gebruik onmiddellijk of verpakt in parafilm en bewaard bij 4 ° C gedurende maximaal 2 weken. </li></ol> 2. Voorbereiding van Dissectiemateriaal Sylgard platen met toegevoegde houtskool worden bereid volgens het protocol van de fabrikant. De resistente zwarte achtergrond van deze platen biedt ondersteuning voor beetgepakt het embryo en de kleur biedt een goed contrast dat vergemakkelijkt het visualiseren van de doorschijnende embryo. <ol><li> Om platen te bereiden wegen direct in een tri-giet bekerglas op een evenwicht 150 g, deel A, vloeibare 15 g deel B en 1 g houtskool poeder (World precisie-instrumenten, # SYLG184). Meng met behulp van een houten ijslolly stok of tongspatel. Giet in glazen of plastic 100 cm gerechten. Gebruik een kleine butaan fakkel gehouden ongeveer 10 tot 12 centimeter boven de gerechten te branden uit alle bubbels. Plaats deksels op platen en laat zitten voor ten minste 24 uur in te stellen. </li><li> Om dissectie-instrumenten voor te bereiden insert een Minutien pin (0,1 mm diameter) in een penhouder (schone wetenschappelijke instrumenten, # 26002-10 en # 26018-17, respectievelijk) alternatief 26 gauge naalden (BD, # 309597) rechthoekig omgebogen met behulp van forceps kan worden gebruikt als ontleden instrumenten. Geslepen Student Dumont # 5 tang (Fine Science Tools, # 91150 tot 20) met behulp van een slijpsteen (Fine Wetenschappelijke Gereedschappen, # 29,008-22). </li><li> Steriliseer alle dissectie-instrumenten met 70% ethanol voor gebruik. </li></ol> 3. Winnen van embryo <ol><li> Euthanaseren de getimede zwangere muis op 8,5 dagen na coitum volgens het gebruik van dieren commissie regelgeving en verwijderen baarmoeder. </li><li> Plaats baarmoeder in een plastic petrischaal met steriele PBS. </li><li> Ze wast baarmoeder met steriele PBS. </li><li> Onder een dissectie microscoop verwijder embryo van deciduas met behulp van een pincet. </li><li> Verwijder extra-embryonale membranen en sparen voor genotypering indien nodig. </li><li> Stage embryo door het tellen van somieten. De ideale stappen om explantaten voor cellulaire analyse behAvior tijdens neurale voudige verhoging zou zijn tussen de 6 en 10 somiet stadia, wanneer de neurale plooien net beginnen te verheffen en voor de grote morfogenese van de craniale mesenchym plaatsvindt. </li><li> Was embryo in PBS. Leg ze in een zwarte Sylgard plaat met DMEM dat er geen fenol rood (Invitrogen, # 21.063-029) bevat. Verwijder de extra-embryonale membranen en sparen voor genotypering indien nodig. </li></ol> 4. Bereiding van explantaten <ol><li> Heroriëntatie de microscoop bij de maximale vergroting over het hoofd gebied van de embryo. </li><li> Maak sneden met een dissectie naald in elke hand. Gebruik een naald om het weefsel op zijn plaats en de andere ingedrukt om bezuinigingen te maken. </li><li> Snijd de kop van het embryo anterior aan de rhombomeres. </li><li> Knip langs de middellijn aan het hoofd halveren in twee gelijke helften. </li><li> Snijd rond de buitenste rand van het hoofd en middellijn. Deze besparingen zullen verwijderen van de premigratory kuif en de oppervlakte ectoderm aan de buitengrens ende prechordale plaat op de middellijn. De resterende weefsel het explantaat en zal de migratie craniale neurale paraxiale mesoderm en ectoderm oppervlak bevatten. </li><li> Omdat het weefsel wordt gesneden, verwijder ontleed puin van de schaal met behulp van een steriele pasteur pipet. Dit voorkomt verwarring het explantaat met puin ontleed. </li><li> Voorzichtig wassen de explantatie door pipetteren op en neer met een 20 ul pipet tip en Pipetman. Hiermee verwijdert u losjes bevestigde cellen en het voorkomen van scherpe randen op de explantaten. </li><li> Zorgvuldig halen elk explantaat in ongeveer 10 ui vloeistof met een 20 pi pipetpunt en Pipetman en in het middelpunt van de beklede kweekputje. </li><li> Voeg 20 ul kweekmedium aangevuld met 15% FBS om de explant dekken. </li><li> Plaat in een bevochtigde weefselkweek incubator (5% CO2, 37 ° C) gedurende 1-2 uur om het explantaat te hechten aan de bodem van de schaal. Zie regelmatig dat de explant niet uitdroogtuit. </li><li> Wanneer het explantaat is bevestigd, Voeg aan elk putje 250 ui DMEM aangevuld met 10% FBS dat is verwarmd tot 37 ° C in een waterbad. Zodra explantaten hebben bevestigd dat ze niet bewegen wanneer plaat wordt voorzichtig geschud onder de microscoop. </li><li> Terug schotel naar weefselkweek incubator. </li><li> Na 24 uur wordt de explantaten stevig zijn bevestigd en cellen begint te emigreren. Momenteel farmacologische middelen kunnen worden toegevoegd aan de media. </li><li> 48 uur na het plateren zullen cellen gemigreerd van de explantaten. Gemigreerd De afstand kan worden gevisualiseerd en afgebeeld. We normaal gesproken niet meer de cultuur op dit punt sinds explantaten beginnen te tekenen van verminderde levensvatbaarheid met een langere incubaties tonen. Een vitale kleurstof zoals acridine oranje of trypan blue kan ook worden gebruikt om de levensvatbaarheid van het explantaat controleren. </li><li> Op dit punt beelden kunnen worden verkregen om de afstand en aantal cellen die migreren uit de explantaat documenteren. Als alternatief werden als explantaten uitgeplaat op dekglaasjes,ze kunnen worden vastgesteld en immunohistochemische analyses uitgevoerd om eiwitten van belang te visualiseren. </li></ol> Kritische stappen in het protocol <ol><li> Snij explantaten van ongeveer dezelfde grootte. </li><li> Wis alle dissectie puin van de dissectie plaat als u ontleden tot verwarrende puin te vermijden met de gewenste geëxplanteerd weefsel. </li><li> Wanneer plating explantaten in putten of op dekglaasjes moet u druppel media plaatsen bij explantatie in het centrum van goed. </li><li> Laat explanteren voldoende tijd te bevestigen voordat overstromingen het goed met media. </li><li> Behandeling voorwaarden moeten worden gestandaardiseerd voor elke test substraat en farmacologisch middel gebruikt. </li><li> Twee explantaten kan van elk embryo (van links en van rechts van de neurale buis). </li><li> Bij het testen migratie van cellen uit mutantmuis lijnen onder verschillende experimentele condities, zet een mutant explant in de controlegroep en de andere in de behandelde groep. </li></ol> Problemen oplossen <ol><li> Als explantaten niet bevestigen, verhoging van de toegestane tijd voor de bevestiging. In onze ervaring, denk ongeveer de helft van de explantaten niet bevestigen en grotere explantaten zich efficiënter. </li><li> Als explantaten hechten aan de omtrek van de put zullen zij moeilijk beeld. Zorg ervoor dat explantaten plaatsen in het midden van de put. </li><li> Idealiter explantaten zal ongeveer van dezelfde grootte zijn. Desalniettemin kunnen afwijkingen in explant maat worden gecorrigeerd met de diameter van de explantaten als correctiefactor bij quanitating migratie van cellen uit explantaten. </li><li> Mocht contaminatie optreden zeker steriele werkomstandigheden worden gebruikt. Alle gereedschappen en werkoppervlakken moeten worden gesteriliseerd met 70% ethanol. Pipetten en petrischaaltjes moeten nieuw zijn en steriel. </li><li> Als explantaten krijgen verloren tijdens de dissectie, periodiek verwijderen van afval tegen het verlies van explantatie. </li><li> Het beheersen van de dissectie is tijdrovend en vergt oefening. Optimal vergroting, scherpe dissectie-instrumenten en naalden hulp. </li></ol>

<ol><li>Copp, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurulation+in+the+cranial+region--normal+and+abnormal%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+anatomy%22%5BJournal%5D)">Neurulation in the cranial region--normal and abnormal.</a> Journal of anatomy. 207, 623-635 (2005).</li>
<li>Fleming, A., Gerrelli, D., Greene, N. D., Copp, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+normal+and+abnormal+neurulation%3A+evidence+from+embryo+culture+studies%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of normal and abnormal neurulation: evidence from embryo culture studies.</a> The International Journal of Developmental Biology. 41, 199-212 (1997).</li>
<li>Copp, A. J., Greene, N. D., Murdoch, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+basis+of+mammalian+neurulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">The genetic basis of mammalian neurulation.</a> Nat. Rev. Genet. 4, 784-793 (2003).</li>
<li>Tuckett, F., Morriss-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+fibronectin%2C+laminin+and+entactin+in+the+neurulating+rat+embryo+studied+by+indirect+immunofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">The distribution of fibronectin, laminin and entactin in the neurulating rat embryo studied by indirect immunofluorescence.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 94, 95-112 (1986).</li>
<li>Tuckett, F., Morriss-Kay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcian+blue+staining+of+glycosaminoglycans+in+embryonic+material%3A+effect+of+different+fixatives%5BTitle%5D)+AND+%22The+Histochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Alcian blue staining of glycosaminoglycans in embryonic material: effect of different fixatives.</a> The Histochemical Journal. 20, 174-182 (1988).</li>
<li>Morris-Wiman, J., Brinkley, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+mesenchyme+in+mouse+neural+fold+elevation.+II.+Patterns+of+hyaluronate+synthesis+and+distribution+in+embryos+developing+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The role of the mesenchyme in mouse neural fold elevation. II. Patterns of hyaluronate synthesis and distribution in embryos developing in vitro.</a> The American Journal of Anatomy. 188, 133-147 (1990).</li>
<li>Morris-Wiman, J., Brinkley, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+mesenchyme+in+mouse+neural+fold+elevation.+I.+Patterns+of+mesenchymal+cell+distribution+and+proliferation+in+embryos+developing+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The role of the mesenchyme in mouse neural fold elevation. I. Patterns of mesenchymal cell distribution and proliferation in embryos developing in vitro.</a> The American Journal of Anatomy. 188, 121-132 (1990).</li>
<li>Morris-Wiman, J., Brinkley, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+mesenchymal+cell+and+hyaluronate+distribution+correlate+with+in+vivo+elevation+of+the+mouse+mesencephalic+neural+folds%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">Changes in mesenchymal cell and hyaluronate distribution correlate with in vivo elevation of the mouse mesencephalic neural folds.</a> Anat. Rec. 226, 383-395 (1990).</li>
<li>Yoshida, T., Vivatbutsiri, P., Morriss-Kay, G., Saga, Y., Iseki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+in+mammalian+craniofacial+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Cell lineage in mammalian craniofacial mesenchyme.</a> Mech. Dev. 125, 797-808 (2008).</li>
<li>Noden, D. M., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relations+and+interactions+between+cranial+mesoderm+and+neural+crest+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+anatomy%22%5BJournal%5D)">Relations and interactions between cranial mesoderm and neural crest populations.</a> Journal of anatomy. 207, 575-601 (2005).</li>
<li>Jiang, X., Iseki, S., Maxson, R. E., Sucov, H. M., Morriss-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+origins+and+interactions+in+the+mammalian+skull+vault%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tissue origins and interactions in the mammalian skull vault.</a> Dev. Biol. 241, 106-116 (2002).</li>
<li>Morriss-Kay, G. M., Tuckett, F., Solursh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+Streptomyces+hyaluronidase+on+tissue+organization+and+cell+cycle+time+in+rat+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">The effects of Streptomyces hyaluronidase on tissue organization and cell cycle time in rat embryos.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 98, 59-70 (1986).</li>
<li>Morriss-Kay, G., Tuckett, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+localisation+of+chondroitin+sulphate+proteoglycans+and+the+effects+of+chondroitinase+ABC+in+9-+to+11-day+rat+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical localisation of chondroitin sulphate proteoglycans and the effects of chondroitinase ABC in 9- to 11-day rat embryos.</a> Development. , 106-787 (1989).</li>
<li>Tuckett, F., Morriss-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparitinase+treatment+of+rat+embryos+during+cranial+neurulation%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Embryol.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Heparitinase treatment of rat embryos during cranial neurulation.</a> Anat. Embryol. (Berl). 180, 393-400 (1989).</li>
<li>Sarkar, A. A., Zohn, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hectd1+regulates+intracellular+localization+and+secretion+of+Hsp90+to+control+cellular+behavior+of+the+cranial+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Hectd1 regulates intracellular localization and secretion of Hsp90 to control cellular behavior of the cranial mesenchyme.</a> The Journal of Cell Biology. 196, 789-800 (2012).</li>
<li>Zohn, I. E., Anderson, K. V., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hectd1+ubiquitin+ligase+is+required+for+development+of+the+head+mesenchyme+and+neural+tube+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Hectd1 ubiquitin ligase is required for development of the head mesenchyme and neural tube closure.</a> Dev. Biol. 306, 208-221 (2007).</li>
<li>Chen, Z. F., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twist+is+required+in+head+mesenchyme+for+cranial+neural+tube+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Twist is required in head mesenchyme for cranial neural tube morphogenesis.</a> Genes Dev. 9, 686-699 (1995).</li>
<li>Tzahor, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonists+of+Wnt+and+BMP+signaling+promote+the+formation+of+vertebrate+head+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Antagonists of Wnt and BMP signaling promote the formation of vertebrate head muscle.</a> Genes Dev. 17, 3087-3099 (2003).</li>
<li>Lumsden, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+the+epithelium+and+the+role+of+neural+crest+cells+in+the+initiation+of+the+mammalian+tooth+germ%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of the epithelium and the role of neural crest cells in the initiation of the mammalian tooth germ.</a> Development. 103, 155-169 (1988).</li>
<li>Newgreen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spreading+of+explants+of+embryonic+chick+mesenchymes+and+epithelia+on+fibronectin+and+laminin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Spreading of explants of embryonic chick mesenchymes and epithelia on fibronectin and laminin.</a> Cell and tissue Research. 236, 265-277 (1984).</li>
<li>Peyton, S. R., Ghajar, C. M., Khatiwala, C. B., Putnam, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+ECM+mechanics+and+cytoskeletal+tension+as+important+regulators+of+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">The emergence of ECM mechanics and cytoskeletal tension as important regulators of cell function.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 47, 300-320 (2007).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De toegepaste methode hier een krachtige assay om het gedrag van craniale mesenchymcellen onderzoeken. Naast de statische analyses hier gepresenteerde experimenten imaging leven helderveld of in combinatie met expressie van GFP-gemerkte eiwitten kunnen worden gebruikt om het gedrag van cellen in real time onderzoeken als ze migreren uit het explantaat. Voor levende imaging experimenten konden explantaten worden gelabeld met DiI of migratie van neurale onderscheiden van de paraxiale mesoderm, ROSA-YFP, Mesp1-cre of ROSA-YFP, Wnt1-cre of andere transgene lijnen kunnen worden gebruikt. Cranial mesenchym-ECM interacties kunnen ook worden onderzocht gebruik te maken van deze explantatie test. Hier plaat explantaten op verschillende ECM substraten die aanwezig zijn in de schedelholte mesenchym aangetoond dat cellen die migreren in verschillende mate en de ECM beïnvloedt de morfologie van de cellen. Bovendien kunnen explantaten worden ingebed in een driedimensionale matrix om het gedrag van cel openenls in deze context. Deze assay is wijzigbaar explant de analyse van het effect van genetische en farmacologische manipulaties op craniale mesenchym gedrag om intrinsieke en extrinsieke signalen die kunnen reguleren en wijzigen migratie analyse. Zo gebruikten we deze assay in onze studies om de rol van overtollige Hsp90 secretie onderscheiden in het abnormale cellulaire gedrag in Hectd1 mutant craniale mesenchym 15. In deze experimenten, behandelden wij explantaten met anti-Hsp90 antilichaam, Hsp90 eiwit geldanamycine en DMA (dimethyl amelioride) om secretie van Hsp90 te tonen dat het abnormale gedrag van Hectd1 mutant cellen door overmatige extracellulaire Hsp90 15 blokkeren. Soortgelijke benaderingen kunnen worden gebruikt om extra farmacologisch ontleden pathways onderliggende normaal of abnormaal morfogenese van de craniale mesenchym. Nadat de assay is voltooid, kan explantaten en migrerende cellen worden geanalyseerd door een groot aantal methoden. Bijvoorbeeld immunohistochemische analyses cEen worden om lokalisatie van eiwitten belangrijk voor celbewegingen onderzoeken. Transcriptoomanalyses kunnen ook worden gebruikt om te bepalen hoe behandelingen genexpressie beïnvloeden. Een belangrijke beperking van deze techniek is dat het niet model gedrag in drie dimensies omdat zij voorkomen in vivo. Modificatie van het protocol waarbij explantaten worden in een driedimensionale matrix (bijv. matrigel) ingebed met expressie van fluorescent protein gemarkeerde cellulaire compartimenten kunnen worden gebruikt moet dit probleem. Zelfs indien deze wijzigingen uitgevoerd, verdere experimenten gedrag gezien in deze ex vivo assay met de in vivo correleren noodzakelijk. Andere beperkingen zijn het grote aantal embryo&#39;s moet voldoende statisch significante gegevens te genereren. Het belangrijkste is dat de dissectie is relatief eenvoudig, het vereist de praktijk te beheersen.

Neurale buis sluiting in de schedel optreedt tussen embryonale dag 8.5 (E8.5) en 9,5 in de muis embryo. Als de neurale buis goed sluit in hoofd resultaten in anencefalie, een gemeenschappelijk structureel aangeboren afwijking bij mensen en is incompatibel is met leven. De krachten die Cephalic neurale buis sluiting rijden worden gegenereerd op basis van zowel de neurale weefsel zelf en de omringende epidermis en mesenchym 3. Met name expansie van de craniale mesenchym wordt gedacht dat essentieel is voor verhoging van de craniale neurale plooien 1,2. De craniale mesenchym is rijk aan ECM eiwitten met name geglycosyleerde eiwitten zoals heparine sulfaat proteoglycans, chondroïtine sulfaten en hyaluronate 4-8. Anders dan in het kippenembryo waar neurale cellen van de neurale buis dorsale emigreren na neurale buis sluiting de neurale in de muis embryo migreert tegelijkertijd de neurale plooien gaan rise (na de 5 somiet stadium). Dus tijdens neurulatie in de muis embryo wordt de craniale mesenchym uit cellen uit de neurale lijst en de paraxiale mesoderm. Neurale lijst en paraxiale mesoderm populaties worden geïnduceerd op verschillende momenten in de ontwikkeling, gelokaliseerd in verschillende posities in het embryo en zich ontwikkelen tot verschillende structuren 9,10. De paraxiale mesoderm is afkomstig van de primitieve streep en migreert naar de voorste gebied van het embryo naar de vermoedelijke neurale plaat ten grondslag liggen. De neurale wordt geïnduceerd op het kruispunt van de neurale plaat en epidermale ectoderm, ondergaat een epitheliale naar mesenchym overgang en delamineert vlak voor neurale voudige verhoging in de knaagdieren embryo. Neurale lijst cellen migreren langs stereotype paden in de subectodermal paraxiale mesoderm aan de branchial boog, frontonasal en perioculaire mesenchym. De paraxiale mesoderm zal bijdragen aan een deel van de beenderen van de schedel kluis en spieren van het gezicht en dat ee neurale lijst zal bijdragen aan andere beenderen van de schedel en het gezicht in aanvulling op hersenzenuwen 9-11. De paraxiale mesoderm en de neurale lijst lineages kan verschillend worden gekenmerkt door de Mesp1-cre en Wnt1-cre transgene muis lijnen, respectievelijk 9. De essentiële rol van de craniale mesenchym in neurale buis sluiting is afgeleid uit experimenten waarbij de behandeling van knaagdieren embryo&#39;s met ECM verstoren middelen zoals hyaluronidase, chondroïtinase ABC, heparitinase of Diazo-oxo-norleucine (DON) tijdens neurulatie verminderde neurale buis sluiting 7, 12-14. In deze experimenten histologische analyse van vaste gedeelten na neurulatie bleek geassocieerd dysmorphogeneis van de craniale mesenchym 7,12-14. Aangezien de teratogene stof hadden toegang tot meerdere weefsels, moet nog worden vastgesteld of de craniale mesenchym echt het doelweefsel. Ter ondersteuning van de conclusie dat dit weefselis essentieel voor neurulatie, de craniale mesenchym abnormaal lijkt op histologische analyses in sommige muizenmutanten met exencefalie 15-17. Nog in de meeste gevallen is het effect van de mutatie op de cellulaire gedrag van de craniale mesenchym niet verholpen. We hebben bedacht een ex vivo assay explant direct onderzoeken gevolg zijn van genetische mutatie of farmacologische manipulatie van het gedrag van craniale mesenchymcellen 15. Deze test is vergelijkbaar met die welke door Tzahor et al 2003 de differentiatie potentieel van de craniale mesenchym toegang die ten grondslag de rhombomeres 18 behalve wij het ​​explantaat dissectie aangepast om de trekkende eigenschappen van meer anterior populaties van craniale mesenchym bestuderen die de voorzijde neurale grondslag plaat. Onze methode is ook een wijziging van explantatie testen uitgevoerd in het kippenembryo het migrerende gedrag van de neurale lijst analyseren met key verschillen. Vorige voorbereidingen geëxplanteerd de neurale lijst of de meer posterieure paraxiale mesoderm 19,20. Verder is tijdens neurale voudige verhoging bij het kippenembryo, heeft de neurale lijst nog niet geëmigreerd uit het dorsale neurale buis en dus explantaten gehouden met de voorste paraxiale mesoderm zou niet bevatten neurale lijst cellen. In onze assay worden craniale mesenchym explantaten bestaande uit paraxiale mesoderm, neurale en oppervlakte ectoderm bereid en uitgeplaat op een substraat. Experimentele manipulatie inclusief isolatie van explantaten van genetische mutanten, plating explantaten op verschillende ECM of farmacologische behandelingen kunnen worden uitgevoerd. Cellen migreren van de explantatie en de afstand, het aantal en het gedrag kan worden geanalyseerd en vergeleken tussen de behandelingsgroepen. Bovendien, dit preparaat amendeerbaar voor een analyse van cellulaire migratie door levende beeldvormingstechnieken. Na de migratie experiment, kan explantaten worden vastgesteld en onderworpen aan immunohistochemische analyses te bontpoort aansluiten verduidelijken het effect van behandelingen. Over het algemeen de hier gepresenteerde protocol is een eenvoudige ex vivo assay om het gedrag van de craniale mesenchym onderzoeken. Als een representatief experiment gebruiken we deze assay de migratie van craniale mesenchym op verschillende extracellulaire substraten onderzocht.

een explantatie assay voor het beoordelen van cellulair gedrag van de craniale mesenchym

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

Het centrale zenuwstelsel is afgeleid van de neurale plaat die een reeks complexe morfogenetische bewegingen als gevolg de vorming van de neurale buis in een proces dat neurulatie ondergaat. Tijdens neurulatie, wordt morfogenese van het mesenchym dat de neurale plaat ten grondslag ligt vermoedelijk neuraal voudige verhoging rijden. De craniale mesenchym bestaat uit de paraxiale mesoderm en de neurale lijst cellen. De cellen van de craniale mesenchym vormen een pourous meshwork uit stellaatcellen gevormde cellen en vermenging extracellulaire matrix (ECM) strengen die de neurale plooien ondersteunen. Tijdens neurulatie, de craniale mesenchym ondergaat stereotiepe herschikkingen leiden tot de uitbreiding en deze bewegingen worden verondersteld om een ​​drijvende kracht voor neurale voudige verhoging. Blijven echter de paden en cellulaire gedragingen die craniale mesenchym morfogenese rijden slecht bestudeerd. Interacties tussen de ECM en de cellen van de craniale mesenchym onderliggende These cel gedrag. Hier beschrijven we een ex vivo assay explant ontworpen om het gedrag van deze cellen te karakteriseren. Deze test is wijzigbaar de farmacologische manipulatie van de signaalroutes die live beeldvorming en analyses ontleden om verder te karakteriseren het gedrag van deze cellen. Wij presenteren een representatief experiment tonen de bruikbaarheid van deze assay karakteriseren van de migrerende eigenschappen van de craniale mesenchym op diverse ECM componenten.

Het verschijnen van cellen migreren van craniaal mesenchym explantaten is getoond in figuur 2. We testten migratie op diverse ECM substraten die aanwezig zijn in de schedelholte mesenchym tijdens neurulatie zoals fibronectine (100 mg / ml; Sigma # F1141), laminine (100 mg / ml; Sigma # L2020), MaxGel ECM (1:500 verdunning in DMEM ; Sigma # E0282) en hyaluronzuur (1 mg / ml, Sigma, # 53747). Cellen niet te migreren van het explantaat wanneer er geen ECM aanwezig is (gegevens niet getoond) en alle substraten getest ondersteunde migratie van de cellen. Zowel de vorm en de grootte van cellen die migreren uit de explantaten afhankelijk van de ondergrond. Dit is verwacht aangezien eerdere studies blijkt dat de mechanische krachten die ontstaan ​​door interactie van cellen met verschillende ECM zowel de vorm als trekkende eigenschappen van cellen 21 te beïnvloeden. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4245/4245fig1.jpg" fo:content-width = &quot;5.5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/4245/4245fig1highres.jpg&quot; /&gt; Figuur 1. Voorbereiding van explantaten. (A) Om explantaten voor te bereiden, zijn E8.5 embryo&#39;s ontleed uit deciduas en extra-embryonale weefsels. (B) Embryo koppen geprepareerd uit het lichaam anterior de rhombomeres. Explantaten worden bereid door verwijderen van weefsel van de middellijn en de buitenranden van het hoofd naar prechordale plaat verwijderen op de middellijn en de premigratory neurale en ectoderm oppervlak aan de grens, respectievelijk. (C) Explantaten worden bereid door het wegsnijden van weefsel van de middellijn en buitenste randen van het hoofd naar prechordale plaat verwijderen op de middellijn en de premigratory neurale en oppervlakte ectoderm aan de grenzen. (D) Explantaten worden in een klein volume media ECM beklede schalen / coverslips en toegestaan ​​te hechten vóór toevoeging van meer media. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4245/4245fig2.jpg" /> Figuur 2. Migratie van craniale mesenchymcellen van explantaten geplaat op verschillende substraten. Explantaten werden uitgeplaat op fibronectine, laminine, MaxGel ECM of hyaluronzuur en gefotografeerd na 48 uur in cultuur. Grootte bar = 200 mm.

De craniale mesenchym ondergaat dramatische morfogenische bewegingen die waarschijnlijk zorgt voor een drijvende kracht voor verhoging van de neurale plooien<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Hier beschrijven we een<em&gt; Ex vivo</em&gt; Explanteren assay om de cellulaire gedrag van de craniale mesenchym karakteriseren tijdens neurulatie. Deze test heeft vele toepassingen waaronder dat vatbaar is voor farmacologische manipulatie en live imaging analyses.

Een Explantatie Assay voor het beoordelen van cellulair gedrag van de craniale mesenchym

Het centrale zenuwstelsel is afkomstig van de neurale plaat, die een reeks complexe morfogenetische bewegingen ondergaat die resulteren in de vorming van de ...

Het doel van deze procedure is om het gedrag van de craniale meen chiming-cultuur te monitoren onder gedefinieerde kweekcondities. De eerste stap is het verzamelen van de uterine hoorns van een muis met een tijdgecontroleerde zwangerschap.8,5 dagen na de copulatie. Eenmaal geïsoleerd worden de embryo's uit de decidua verwijderd en wordt de dooierzak verwijderd voor genotypering. Vervolgens worden de craniale mesenchymplanten gemicrodissecteerd en overgebracht naar weefselkweekplaatjes die gecoat zijn met extracellulaire matrix.X-explantaten krijgen de kans om te hechten en worden gedurende maximaal 48 uur gekweekt in de aanwezigheid of afwezigheid van gedefinieerde farmacologische agentia. Uiteindelijk worden er beelden van de explantaten gemaakt om verschillen in celmigratie aan te tonen. Deze methode is nuttig voor het beantwoorden van kernvragen, zoals welke signaleringspaden en extracellulaire matrixeiwitten betrokken zijn bij en het gedrag van de craniale neurale lijst controleren tijdens de elevatie van de neurale plooien.Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat de stappen van microdissectie moeilijk aan te leren zijn en geduld en oefening vereisen om onder de knie te krijgen. Begin met het voorbereiden van dekglasjes als er immunohistochemie zal worden uitgevoerd; anders kan deze stap worden overgeslagen en kunnen weefselkweekplaten direct met ECM worden gecoat. Steriliseer ronde glazen dekglasjes van 12 millimeter door ze in ethanol te dopen. Laat ze aan de lucht drogen. Plaats vervolgens in elke well van een 12-wells plaat een gesteriliseerd dekglasje.Werk in een laminaire flowkast en breng 1 mL extracellulaire matrix of ECM aan om de dekglasjes of de bodem van een weefselkweekplaat te coaten. Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende drie uur. Na de incubatie wordt de ECM-oplossing weggezogen en wordt de plaat drie keer gewassen met PBS. Op dit punt kunnen de gecoate platen direct worden gebruikt of in folie worden gewikkeld en bewaard bij 4 °C voor maximaal twee weken.Hulp bij het visualiseren van het doorschijnende embryo. Syl guard platen met resistente zwarte achtergronden worden voorbereid, volgens het protocol van de fabrikant.Bereid de dissectie-instrumenten voor door een fijne speldenprik in een speldenhouder te plaatsen. Gebruik een slijpblok om de pincetten te slijpen zodra alles is voorbereid. Neem de uterus uit een zwangere muis met een bekende drachtduur van 8,5 dagen post quot.Plaats de geïsoleerde uterus in een schaaltje met steriele PBS en was deze. Scheid onder een dissectiemicroscoop de afzonderlijke decidua's met een schaar en een pincet. Verwijder het uterine bindweefsel met een scheurende beweging, waarbij u voorzichtig bent om geen druk uit te oefenen zodat het embryo niet uit de decidua springt.Gebruik een pincet om voorzichtig het baarmoedeweefsel aan de zijde tegenover de placenta openscheuren. Om het embryo in de dooierzak bloot te leggen, gebruikt u het pincet om het embryo en de dooierzak van de placenta los te knijpen en verwijdert u het baarmoedeweefsel uit de schaal. Scheur vervolgens met het pincet voorzichtig de dooierzak van het embryo af om deze te verwijderen.Plaats de dooierzak met een pipet in een eppendorfbuisje voor genotypering; bepaal na isolatie het stadium van het embryo door de somieten te tellen. Idealiter bevindt het embryo zich tussen de zes en tien somieten, oftewel de milt-stadia. In dit stadium beginnen de neurale plooien net op te rijzen en heeft de belangrijkste morfogenese van het craniale mesenchym nog niet plaatsgevonden.Zodra het stadium is bepaald, wordt het embryo overgebracht naar een zwarte cellguard-plaat met DMEM zonder fenolrood. Focus eerst onder een dissectiemicroscoop met de hoogst mogelijke vergroting op de kop van het embryo met een dissectienaald in elke hand en dissecteer de kop anterieur aan de rmba-meres. Snijd vervolgens langs de middellijn om bi.Dissect de kop in twee gelijke helften met een dissectienaald in elke hand. Dissecteer de buitenste randen langs de marge van de kop van het embryo en de middellijn. Verwijder weefsel indien nodig om te voorkomen dat het gewenste vlak wordt verward met ongewenst weefsel.Het explantaat zal migrerende craniale neurale kamcellen, paraxiaal mesoderm en oppervlakte-ectoderm bevatten om losjes gebonden cellen te verwijderen. Pipetteer voorzichtig op en neer met een 200 µL pipetpunt. Neem vervolgens het explantaat voorzichtig op met een pipetpunt.Plaats ongeveer 10 µL DMEM in het midden van een gecoate weid van een weefselkweekschaal en voeg 20 µL warme DMEM toe, aangevuld met 15% FBS; de kweekschaal kan nu worden overgebracht naar een weefselkweekincubator. Na ongeveer één tot twee uur is het explantaat gehecht en kunnen er nogmaals 250 µL medium worden toegevoegd. Na ongeveer 24 uur zal het explantaat stevig aan het dekglas gehecht zijn.Op dit moment kunnen farmacologische middelen aan het medium worden toegevoegd; na nog eens 24 uur zullen de cellen vanuit deze migreren. Doorgaans worden er beelden vastgelegd om de afstand en het aantal cellen dat vanuit deze migreert te documenteren. Op dit punt beginnen de cellen tekenen van verminderde levensvatbaarheid te vertonen bij langere incubatieperioden.Hier zijn voorbeelden van cellen die migreren vanuit craniale mesenchymale en chix-planten. Na 48 uur in verschillende substraten zijn zowel de vorm als de grootte van de cellen die vanuit het explantaat migreren, afhankelijk van het substraat. Migratie werd ondersteund op fibronectine, laminine, matrigel, ECM en hyaluronzuur.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals immunofluorescentie en live imaging, worden gebruikt om de signaalpaden die het gedrag van het craniale mesenchym tijdens de elevatie van de neurale plooien reguleren, verder te onderzoeken.

an-explant-assay-for-assessing-cellular-behavior-cranial

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit artikel beschrijft een weefseltransplantatie techniek die is ontworpen om de signalering en patroonvorming eigenschappen van de oppervlakte Cephalic ectoderm tijdens de craniofaciale ontwikkeling test.

Het beoordelen van Signalering Eigenschappen van ectodermale epitheel Tijdens craniofaciale ontwikkeling

Een benadering om de migratie van cellen geëxplanteerde (trunk neurale cellen) analyseren beschreven. Deze methode is goedkoop, zacht en kunnen onderscheiden chemotaxis van zowel chemokinesis en andere invloeden op trekkende polariteit zoals die afgeleid van cel-cel interacties in de primaire neurale stam celkweek.

Analyse van Trunk neurale cel migratie met behulp van een gewijzigd Zigmond Kamer Assay

Craniofaciale kraakbeen te ontwikkelen in nauw contact met andere weefsels en zijn moeilijk te manipuleren in levende dieren. Wij maken gebruik van elektroporatie van moleculaire tools te leveren tijdens de groei van het craniofaciale skelet, terwijl het omzeilen van de vroege embryonale effecten. Deze aanpak stelt ons in staat om efficiënt te testen...

Elektroporatie van Craniofaciale Mesenchym

Het lot van een individuele embryonale cel kan worden beïnvloed door erfelijke moleculen en / of signalen van naburige cellen. Gebruik te maken van het lot kaarten van de splitsing podium Xenopus embryo, kan enkel blastomeren worden geïdentificeerd voor cultuur in isolatie om de bijdragen van erfelijke moleculen te beoordelen ten opzichte van cel-cel interacties.

Blastomeer Explantaten om te testen voor mobiele Fate Commitment tijdens de embryonale ontwikkeling

This video illustrates a technique for isolating cranial neural folds from the midbrain region of chick embryos. It presents a detailed dissection process of the neural folds, their placement, and attachment on fibronectin-coated coverslips, followed by the observation of neural crest cell migration from the neural folds.

Isolating Cranial Neural Folds From a Chick Embryo for a Neural Crest Cell Culture

In Xenopus embryo's, cellen van het dak van de blastocoel zijn pluripotent en kunnen worden geprogrammeerd om verschillende weefsels te genereren. Hier beschrijven we protocollen om uitstrijkjes van de amfibische blastocoel-dak als een assaysysteem te gebruiken om belangrijke in vivo en in vitro kenmerken van vroege neurale ontwikkeling te onderzoeken.

Stamcelachtige<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Explantaten om te studeren Early Neural Developmental Kenmerken<em&gt; In Vitro</em&gt; En<em&gt; In Vivo</em

Epitheliële naar mesenchymale overgang (EMT) maakt het mogelijk dat kankers invasief worden. Om EMT te onderzoeken, wordt een op neurale stamcellen (NSC) gebaseerd in vitro model beschreven dat vrij is van serum en enzymen. Dit gestandaardiseerde systeem maakt een kwantitatieve en kwalitatieve beoordeling van celmigratie, gen- en eiwitexpressie mogelijk. Het model is geschikt voor geneesmiddelontdekking.

Een enzym en Serum-free neurale stamcel Cultuur Model voor EMT Investigation Geschikt voor Drug Discovery

Dit protocol beschrijft de dissectie en de cultuur van craniale neurale Crest cellen van muismodellen, voornamelijk voor de studie van de Celmigratie. We beschrijven de gebruikte technieken voor Live Imaging en de analyse van veranderingen in snelheid en celvorm.

Dissectie, cultuur en analyse van primaire Cranial neurale Crest cellen van de muis voor de studie van neurale Crest Celdelaminatie en migratie

We presenteren een protocol voor isolatie en kweek van primaire muisembryogene palatale mesenchymale cellen voor time-lapse beeldvorming van tweedimensionale (2D) groei- en wondhersteltests. We bieden ook de methodologie voor de analyse van de time-lapse beeldvormingsgegevens om de vorming van celstromen en directionele beweeglijkheid te bepalen.

Isolatie en time-lapse beeldvorming van primaire muisembryo's van palatale mesenchymcellen om collectieve bewegingskenmerken te analyseren

Dit veelzijdige protocol beschrijft de isolatie van premigratory neural crest cells (NCC's) door de excisie van craniale neurale plooien van kuikenembryo's. Bij plating en incubatie komen migrerende NCC's tevoorschijn uit neurale vouwexplantaten, waardoor celmorfologie en migratie in een vereenvoudigde 2D-omgeving kunnen worden beoordeeld.

Voorbereiding en morfologische analyse van Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures

We presenteren een driedimensionaal (3D) in vitro differentiatieprotocol dat neurosferen van reproduceerbare grootte genereert om craniale neurale lijstcellen te produceren uit embryonale stamcellen van muizen. We laten zien dat deze methodologie de variabiliteit vermindert in vergelijking met eerdere protocollen en hoe deze kan worden gebruikt voor multiplexed assay om de ontwikkeling van craniale neurale lijstcellen te bestuderen.

Het craniale Neurale Protocol van de Lijstcellen Driedimensionaal in vitro Differentiatie voor Gemultiplexte Analyse

Leer een ex vivo explantatie-assay om cellulair gedrag van craniale mesenchym te bestuderen tijdens neurulatie bij muizenembryo's. Deze methode maakt farmacologische manipulaties en live imaging mogelijk.

Een Explantatie Assay voor het beoordelen van cellulair gedrag van de craniale mesenchym

Meer video's verkennen