Een Explantatie Assay voor het beoordelen van cellulair gedrag van de craniale mesenchym

Het doel van deze procedure is om het gedrag van de craniale meen chiming-cultuur te monitoren onder gedefinieerde kweekcondities. De eerste stap is het verzamelen van de uterine hoorns van een muis met een tijdgecontroleerde zwangerschap.

8,5 dagen na de copulatie. Eenmaal geïsoleerd worden de embryo's uit de decidua verwijderd en wordt de dooierzak verwijderd voor genotypering. Vervolgens worden de craniale mesenchymplanten gemicrodissecteerd en overgebracht naar weefselkweekplaatjes die gecoat zijn met extracellulaire matrix.

X-explantaten krijgen de kans om te hechten en worden gedurende maximaal 48 uur gekweekt in de aanwezigheid of afwezigheid van gedefinieerde farmacologische agentia. Uiteindelijk worden er beelden van de explantaten gemaakt om verschillen in celmigratie aan te tonen. Deze methode is nuttig voor het beantwoorden van kernvragen, zoals welke signaleringspaden en extracellulaire matrixeiwitten betrokken zijn bij en het gedrag van de craniale neurale lijst controleren tijdens de elevatie van de neurale plooien.

Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat de stappen van microdissectie moeilijk aan te leren zijn en geduld en oefening vereisen om onder de knie te krijgen. Begin met het voorbereiden van dekglasjes als er immunohistochemie zal worden uitgevoerd; anders kan deze stap worden overgeslagen en kunnen weefselkweekplaten direct met ECM worden gecoat. Steriliseer ronde glazen dekglasjes van 12 millimeter door ze in ethanol te dopen. Laat ze aan de lucht drogen. Plaats vervolgens in elke well van een 12-wells plaat een gesteriliseerd dekglasje.

Werk in een laminaire flowkast en breng 1 mL extracellulaire matrix of ECM aan om de dekglasjes of de bodem van een weefselkweekplaat te coaten. Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende drie uur. Na de incubatie wordt de ECM-oplossing weggezogen en wordt de plaat drie keer gewassen met PBS. Op dit punt kunnen de gecoate platen direct worden gebruikt of in folie worden gewikkeld en bewaard bij 4 °C voor maximaal twee weken.

Hulp bij het visualiseren van het doorschijnende embryo. Syl guard platen met resistente zwarte achtergronden worden voorbereid, volgens het protocol van de fabrikant.

Bereid de dissectie-instrumenten voor door een fijne speldenprik in een speldenhouder te plaatsen. Gebruik een slijpblok om de pincetten te slijpen zodra alles is voorbereid. Neem de uterus uit een zwangere muis met een bekende drachtduur van 8,5 dagen post quot.

Plaats de geïsoleerde uterus in een schaaltje met steriele PBS en was deze. Scheid onder een dissectiemicroscoop de afzonderlijke decidua's met een schaar en een pincet. Verwijder het uterine bindweefsel met een scheurende beweging, waarbij u voorzichtig bent om geen druk uit te oefenen zodat het embryo niet uit de decidua springt.

Gebruik een pincet om voorzichtig het baarmoedeweefsel aan de zijde tegenover de placenta openscheuren. Om het embryo in de dooierzak bloot te leggen, gebruikt u het pincet om het embryo en de dooierzak van de placenta los te knijpen en verwijdert u het baarmoedeweefsel uit de schaal. Scheur vervolgens met het pincet voorzichtig de dooierzak van het embryo af om deze te verwijderen.

Plaats de dooierzak met een pipet in een eppendorfbuisje voor genotypering; bepaal na isolatie het stadium van het embryo door de somieten te tellen. Idealiter bevindt het embryo zich tussen de zes en tien somieten, oftewel de milt-stadia. In dit stadium beginnen de neurale plooien net op te rijzen en heeft de belangrijkste morfogenese van het craniale mesenchym nog niet plaatsgevonden.

Zodra het stadium is bepaald, wordt het embryo overgebracht naar een zwarte cellguard-plaat met DMEM zonder fenolrood. Focus eerst onder een dissectiemicroscoop met de hoogst mogelijke vergroting op de kop van het embryo met een dissectienaald in elke hand en dissecteer de kop anterieur aan de rmba-meres. Snijd vervolgens langs de middellijn om bi.

Dissect de kop in twee gelijke helften met een dissectienaald in elke hand. Dissecteer de buitenste randen langs de marge van de kop van het embryo en de middellijn. Verwijder weefsel indien nodig om te voorkomen dat het gewenste vlak wordt verward met ongewenst weefsel.

Het explantaat zal migrerende craniale neurale kamcellen, paraxiaal mesoderm en oppervlakte-ectoderm bevatten om losjes gebonden cellen te verwijderen. Pipetteer voorzichtig op en neer met een 200 µL pipetpunt. Neem vervolgens het explantaat voorzichtig op met een pipetpunt.

Plaats ongeveer 10 µL DMEM in het midden van een gecoate weid van een weefselkweekschaal en voeg 20 µL warme DMEM toe, aangevuld met 15% FBS; de kweekschaal kan nu worden overgebracht naar een weefselkweekincubator. Na ongeveer één tot twee uur is het explantaat gehecht en kunnen er nogmaals 250 µL medium worden toegevoegd. Na ongeveer 24 uur zal het explantaat stevig aan het dekglas gehecht zijn.

Op dit moment kunnen farmacologische middelen aan het medium worden toegevoegd; na nog eens 24 uur zullen de cellen vanuit deze migreren. Doorgaans worden er beelden vastgelegd om de afstand en het aantal cellen dat vanuit deze migreert te documenteren. Op dit punt beginnen de cellen tekenen van verminderde levensvatbaarheid te vertonen bij langere incubatieperioden.

Hier zijn voorbeelden van cellen die migreren vanuit craniale mesenchymale en chix-planten. Na 48 uur in verschillende substraten zijn zowel de vorm als de grootte van de cellen die vanuit het explantaat migreren, afhankelijk van het substraat. Migratie werd ondersteund op fibronectine, laminine, matrigel, ECM en hyaluronzuur.

Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals immunofluorescentie en live imaging, worden gebruikt om de signaalpaden die het gedrag van het craniale mesenchym tijdens de elevatie van de neurale plooien reguleren, verder te onderzoeken.