Modellen van bot metastase

Het algemene doel van deze procedure is om tumorcellen op een zodanige wijze te injecteren dat tumorgroei in het bot en daaropvolgende botdestructie worden geïnduceerd. Dit wordt bereikt door tumorcellen eerst te resuspenderen in koude PBS en op ijs te plaatsen. Vervolgens wordt een passend aantal cellen geïnjecteerd in de linker hartventrikel of in de tibia van een geanestheseerde muis.

Vervolgens worden de groei van de bottumor en de botparameters longitudinaal gevolgd via meerdere beeldvormingstechnieken. Ten slotte wordt een eindpuntkwantificering van de tumor- en botparameters uitgevoerd. Uiteindelijk wordt een combinatie van in vivo en ex vivo fluorescentie of luminescentie 2D-radiografie 3D ingezet.

Micro-CT en histologie worden gebruikt om tumorgroei en veranderingen in de botmicro-omgeving op cellulair en structureel groeiniveau aan te tonen. Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van kankermetastasering, zoals welke factoren in het bot de metastatische kolonisatie van borst- en prostaatkanker mogelijk maken. De celvoorbereiding zal worden gedemonstreerd door Alisa Merkel, een onderzoeksassistent in mijn laboratorium, die de cellen minder dan een week onderhoudt.

Kweek de GFP-gelabelde MDAMB 231-kloon in DMEM met 10% FBS en 0,1 mg/mL penicilline-streptomycine bij 37 °C in 5 tot 8% CO2. Pas aan wanneer de cellen een confluentie van 80 tot 90% bereiken en vervang het medium in een 1:10 verdunning. Om de cellen voor inoculatie voor te bereiden, worden ze bij 80 tot 90% confluentie getrypsiniseerd met 0,15% trypsine-EDTA met gebruik van 10 mL.

Overbreng de cellen onmiddellijk naar een conische buis van 50 milliliter met ijskoud DMEM met 10% FBS en centrifugeer gedurende vijf minuten. Resuspendeer de pellet in een conische buis van 50 milliliter in 25 milliliter ijskoud PBS zonder calcium en magnesium en tel de cellen; pellet de cellen opnieuw en resuspendeer in ijskoud PBS op een concentratie van 10⁶ cellen per milliliter voor intracardiale inoculatie en 250.000 cellen per milliliter voor intratibiale injectie.

Voor deze experimenten worden immuungecompromitteerde vrouwelijke muizen van vier tot zes weken oud gebruikt, die vijf tot 10 dagen voor de injectie een Tela 29 20 x dieet hebben gekregen. Nadat de muis in een kamer is geanestheseerd met 2,5% isofluorine, wordt de muis onder een geventileerde kap naar een neusmasker verplaatst en op de rug gepositioneerd. Gebruik een 10% povidonjodiumoplossing om de borst te wassen, gevolgd door 70% ethanol.

Markeer de borst van de muis voor de injectie halverwege tussen de sternale inkeping en de bovenkant van het xiphoidale proces, en iets links van het sternum. Gebruik vervolgens een insulinespuit van 300 µL met een naald van 28 gauge en een halve inch. Trek een kleine luchtbel op om ruimte te creëren tussen de zuiger en de meniscus, en trek 100 µL cellen op terwijl u met één hand de huid van de muis strak houdt.

Houd de naald rechtop; bij een succesvolle inbreng in de linker hartventrikel moet een duidelijk helderrode bloedpuls in de spuit zichtbaar zijn. Duw op deze diepte de zuiger van de spuit voorzichtig in zonder de naald significant te bewegen, om te voorkomen dat het hart wordt doorboord of dat er cellen in de borstholte lekken. Om het druppelen van cellen in de borstholte te verminderen, kan de zuiger iets worden omhooggetrokken om een kleine hoeveelheid negatieve druk te creëren.

Trek vervolgens de naald direct uit de borstkas, waarbij u er zeker van bent dat de naald tijdens het verwijderen niet kantelt, aangezien dit het hartzakje kan scheuren en bloedingen kan veroorzaken. Oefen ongeveer één minuut lang een lichte druk uit op de injectieplaats om de bloeding te verminderen. Verplaats de muis terwijl u de neuskegel verwijdert naar een warmtemat tot het dier volledig bij bewustzijn is.

Injecteer de muis vlak voor de intratibiale procedure met bup printex. Nadat de muis is geanestheseerd en in een neusconus is geplaatst, worden beide poten gereinigd met 10% povidonjodium, gevolgd door ethanol, met een beweging van vier vingers en de duim.

Pak de malleolus lateralis, de malleolus medialis en de onderste helft van de tibia voorzichtig vast. Buig vervolgens het been zodanig dat de knie zichtbaar en toegankelijk is. Maak de huid nat met 70%ethanol om de zichtbaarheid van het onderliggende patellaligament te vergroten; dit zou zichtbaar moeten zijn als een duidelijke dikke witte lijn terwijl de enkel stevig wordt vastgehouden.

Steek een naald van 28 gauge en een halve inch onder de patella, door het midden van het ligamentum patellae en in het gebied van de anterior intercondylaire inkeping aan de bovenzijde van de tibia. Oefen een gestage, stevige druk uit met een lichte boorbeweging om de naald voorzichtig door de groeischijf te leiden. Zodra de groeischijf van de tibia is doorboord, zal de naald aanzienlijk minder weerstand ondervinden.

Beweeg de naald voorzichtig zijwaarts om er zeker van te zijn dat deze zich in de tibia en door de groeischijf bevindt. De beweging zal beperkt zijn als de naald op de juiste plaats in de tibia zit. Druk de zuiger langzaam in om 10 µL van de celoplossing te injecteren.

Op dit punt mag er weinig tot geen weerstand voelbaar zijn. Trek vervolgens langzaam de naald eruit. Haal de muis uit de anesthesie en houd deze op een warmtemat tot het dier volledig is hersteld.

Controleer de muis twee tot drie keer per week. Diverse beeldvormingstechnieken, zoals luciferase, GFP-fluorescentie en röntgenstraling, worden uitgevoerd op geanestheseerde muizen. De fluorescentie geeft de gebieden met tumor aan.

Een estron-scan wordt gebruikt om laesies te lokaliseren. De laesies komen overeen met de fluorescentiebeelden. Verdere details over de beeldvormingstechnieken zijn te vinden in het geschreven gedeelte van dit protocol.

21 tot 35 dagen na injectie. Offer de muizen op met een door de IACUC goedgekeurde methode en bewaar de botten in 4% Formaline. Voer ex vivo-analyses uit met micro-CT en histomorfometrie met hematoxine- en DSN-kleuring op de geïsoleerde botten. Details zijn te vinden in het geschreven protocol voor intracardiale of intratibiale inoculatie van tumorcellen.

Muizen worden wekelijks gecontroleerd via radiografie en fluorescentie of luminescentie. Laesies worden normaal gesproken tussen week twee en drie zichtbaar op de röntgenfoto. Hoewel ze, afhankelijk van het model zoals hier getoond, al in week twee zichtbaar kunnen zijn via fluorescentie en luminescentie, zijn laesies zichtbaar als donkere gaten in het bot en kunnen deze na verloop van tijd prominenter worden. Laesies werden gekwantificeerd met behulp van metamorph-analyse van radiografieën en fluorescentie.

Kwantificering is uitgevoerd met maestro-beeldverwervings- en analysesoftware. In deze figuur wordt botverlies gekwantificeerd met micro-CT-analyse. Botstructurele en minerale gegevens uit micro-CT-metingen zijn weergegeven als 3D-beelden van gezond bot en een tumorhoudend bot, waarbij gebieden met botdestructie als een leegte worden getoond.

Vervolgens werd histomorfometrie uitgevoerd op de monsters om de tumorlast en de botvolumefractie (botvolume ten opzichte van weefselvolume) te bepalen. Bij het uitvoeren van deze procedures is het belangrijk om geduldig te zijn, elke muis zorgvuldig te positioneren en de muizen nauwlettend te volgen. Als ze beginnen te sterven, is dit waarschijnlijk te wijten aan celklontering en moet u onmiddellijk nieuwe cellen prepareren.

Het ergste wat u kunt doen is de procedures overhaasten of gefrustreerd raken. Onthoud dat u met meer oefening en tijd beter en sneller zult worden. Na hun ontwikkeling maakten deze technieken de weg vrij voor kankeronderzoekers om botmetastasen in vivo te bestuderen.