Name: Modellen van bot metastase (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Leer methoden voor tumorinoculatie bij muizen om botmetastase van kanker te bestuderen. Dit protocol beschrijft injectietechnieken en beeldvorming voor het monitoren van tumorprogressie en botdestructie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs erkennen de volgende financieringsbronnen: P01CA040035 (FE / JAS) en VA Career Development Award (JAS).

1. Cel Onderhoud <ol><li> Veel botten uitgezaaide subklonen van MDA-MB-231 zijn gedefinieerd met variabele neiging tot bot kolonisatie en groei. Voor onze experimenten gebruiken kloon afgeleid van de GFP-gemerkte MDA-MB-231 ontwikkeld UTHSCA 2. Deze specifieke sub-kloon vormen zichtbaar osteolytische botlaesies ongeveer 3 weken na inoculatie met opoffering na 4 weken. </li><li> Handhaven cellen in DMEM met 10% FBS en 0,1 mg / ml penicilline-streptomycine bij 37 ° C in 5-8% CO 2 7. </li><li> Passage cellen bij 80-90% confluentie en re-plaat met een 1:10 verdunning (dit varieert afhankelijk van het celtype en de grootte plaat. Voor MDA-MB-231-cellen in een T-75 is ongeveer 6x10 5), die is ongeveer elke 72 uur. </li><li> MDA-MB-231 cellen een algemeen fibroblastische verschijning met talrijke pseudopodia. Elke afronding is indicatief overbevolking of andere ongewenste stress, en moet worden vermeden omdat ditkunnen beïnvloeden metastatisch potentieel in vivo. </li><li> Idealiter moeten de cellen in cultuur worden gehouden slechts kort voor enting (raden minder dan 1 week of totdat genoeg cellen voor het experiment) en een nieuwe injectieflacon worden ontdooid wanneer afronding of veranderingen in celgroeisnelheid optreden. </li></ol> 2. Celpreparaat <ol><li> Trypsinize cellen bij 80-90% confluentie met 0,15% trypsine / EDTA (Gibco verdunnen 0,5% trypsine EDTA 1:2 in PBS). Deze concentratie maakt een snelle afscheiding (&lt;2 min) en vermindert klonteren van de cellen. </li><li> Verwijder onmiddellijk cellen van plaat met 10 ml ijskoude DMEM met 10% FBS, pipet in 15 ml conische buis en gecentrifugeerd bij 200 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Hersuspendeer pellet in een 50 ml conische buis in 25 ml ijskoude PBS (zonder Ca en Mg) en tellen. </li><li> Centrifugeer opnieuw pellet en resuspendeer in 10 6 cellen per ml (intracardiale) of op 250.000 cells/10 pl (intratibial) in ijskoude PBS. De temperatuur van PBS is belangrijk om samenklonteren van cellen en achtereenvolgens embolie na injectie. De celsuspensie moet blijven op ijs tijdens het uitvoeren van injecties en levensvatbaar blijven en niet-klonteren gedurende 30 minuten. Hoewel de exacte vereiste aantal platen varieert van onderzoeker onderzoeker, We gebruiken een T-75 voor tussen 8-10 muizen. </li></ol> 3. Intracardiale Inoculatie <ol><li> 4-6 weken oude vrouwelijke (Foxn nu-/ -: Harlan) muizen worden gebruikt voor deze experimenten, hoewel andere immuun-gecompromitteerde muizen (RAG1-/ -, RAG2-/ -, SCID, XID en etc.) kunnen ook gebruikt met menselijke kankercellijnen experimenten. </li><li> Het naakt muizen moet worden gevoed Teklad 2920x dieet 5-10 dagen voor injectie op mortaliteit door de injectie procedure te verlagen, en het verminderen van achtergrond fluorescentie in beeldvorming procedures (aangezien het eten is alfalfa gratis). </li><li> Bij gebruik van muizen dan nu / nu, verwijdert haar door het scheren of het gebruik van Nair (in onze ervaring Nair werkt beter) op ventrale buik area voordat procedure. </li><li> Verdoven muis in een isolatiekamer met een verdamper isofluraan (2,5% Iso: 2-3 l / min O 2) of andere gewenste anesthesie (in onze ervaring is de beste isofluraan getolereerd intracardiale inentingen). </li><li> Verplaats een muis op een moment om de neuskegel van de anesthesie machine in een roestvrij stalen geventileerde kap. </li><li> Plaats elke muis op zijn rug met de borst naar boven. </li><li> Was de borst met een 10% povidon / jodium wattenstaafje / oplossing gevolgd door 70% ethanol, 2 keer herhalen. </li><li> Mark muis op de borst voor injectie (met behulp van een steriele marker of markering iets naar de kant te houden van de injectieplaats steriel). We maken gebruik van een teken locatie, halverwege het borstbeen en de bovenkant van xyphoid proces, en iets naar links (anatomische) van het borstbeen. Teken een luchtbel in de injectiespuit om ruimte tussen de plunjer en meniscus (belangrijk voor cardiale zien puls) van een 300 ui 28 g ½ insulinespuit maken enhet opstellen van 100 pi van de cellen. </li><li> Rechtop te houden naald. Houd de huid van de muis strak met de andere hand, steek de naald. </li><li> Succesvolle insertie in linker ventrikel moeten resulteren in een duidelijke rode heldere puls van bloed in de injectiespuit. Op deze diepte, zorgvuldig druk plunjer van de spuit (100 pl volume), zonder noemenswaardige beweging van de naald om te voorkomen dat aanprikken van de hart-of morsen cellen in de borstholte. </li><li> Na cellen worden geïnjecteerd, trekt op zuiger om een ​​kleine hoeveelheid negatieve druk te verminderen druipen van cellen in de borstholte maken. </li><li> Trek de naald direct uit de borst terwijl ze zeker het kantelen van de naald te voorkomen tijdens het verwijderen, die de bekleding van het hart kan scheuren en bloedingen veroorzaken. </li><li> Breng lichte druk op de borst op de injectieplaats om het bloeden te verminderen. </li><li> Verwijder de muis uit de neuskegel en blijven lichte druk gedurende ongeveer 1 minuut toe te passen. </li><li> Beweeg de muis om verwarming pad tot volledige conbewuste. </li><li> Als de muis begint te draaien of na herstel trillen, de waarschijnlijke oorzaak is een embolie. Intraperitonally injecteren muis met 80-120 mg / kg ketamine van de bloedstroom en het hartminuutvolume te verhogen terwijl het verminderen vaatweerstand. Dit zou moeten helpen met de muis langs de prop. Na dit gebeurt, is het beter om celpreparaten, omdat het aangeeft dat de cellen klonteren. We veranderen celpreparaten na ongeveer 8 muizen, of 30 minuten. </li></ol> 4. Intratibial <ol><li> Injecteer muis met Buprenex (0,1 mg / kg) en dergelijke erkende analgetische onmiddellijk vóór procedure. </li><li> Verdoof muis met behulp van isofluraan, ga dan naar neuskegel en onderhouden van anesthesie. </li><li> Reinig beide benen met 10% povidon / jood swab / oplossing, gevolgd door ethanol, 2 keer herhalen. Epileren benen (met Nair of soortgelijk product) voor het reinigen of bont aanwezig. </li><li> Voorzichtig begrijpen laterale malleolus, mediale malleolus, en onderste helft van het scheenbeen met wijsvinger en thUMB, buig been (combinatie van flexie en exorotatie, zodat de knie zichtbaar en toegankelijk. </li><li> Bevochtig de huid met 70% EtOH om de zichtbaarheid van de onderliggende knieschijf ligament, wat zichtbaar moet zijn als een aparte, dikke, witte lijn te verhogen. Terwijl stevig grijpen enkel / been van de muis insert 28g ½ naald onder patella, door het midden van patella ligament, en in de voorste intercondylaris gebied in de top van het scheenbeen. </li><li> Bij het plaatsen van de naald in de tibia, zorgvuldig begeleiden bij groeischijf met behulp van stabiele, stevige druk met lichte boren actie. </li><li> Bij penetratie van scheenbeen groeischijf, zal de naald tegenkomen duidelijk minder weerstand. </li><li> Gebruik een zachte, zijdelingse beweging van de naald om ervoor te zorgen naald in het scheenbeen en door middel van de groeischijf. Beweging zal worden beperkt als de naald in de juiste plaats binnen scheenbeen. </li><li> Duw langzaam zuiger tot en met 10 ul van cel-oplossing injecteren. Weinig tot geen weerstand worden gevoeld op dit punt. </li><li> Slowly halen naald. </li><li> Volgens dezelfde procedure, gaan naar de volgende poot 10 pl PBS injecteren. </li><li> Verwijder de muis uit narcose en blijf verwarming pad tot hersteld. </li><li> Bewaken van de muizen in de komende 24 uur en injecteer met extra Buprenex elke 12 uur als de dieren nog steeds tekenen van nood tonen. </li></ol> 5. Imaging Time Cursus <ol><li> Luciferase Imaging: voorkomend geval luciferase beeldvorming moet worden gebruikt beginnen op 7 dagen na tumorcel inoculatie (hoewel in de meeste botmetastasen modellen detecteerbaar dichter bij dag 14). Muis intraperitoneaal geïnjecteerd met 150 mg / kg luciferin, verdoofd en afgebeeld 8 min na injectie met IVIS materiaal 8. </li><li> GFP beeldvorming: Typisch GFP-expressie tumoren beginnen te detecteerbaar zijn rond dag 10 tot 14 voor intratibial injecties en 16-21 voor intracardiale experimenten met Maestro imaging-apparatuur (CRI) 9. Kort werden muizen verdoofd met isofluraan (3%) En gehandhaafd onder verdoving door middel van een neuskegel in de Maestro beeldvorming kamer. Voor onze eGFP-expressie brengen we gebruik van de blauwe filter set (498 excitation/515 emissie voor eGFP) op 500 ms blootstelling in 10 nm stappen. </li><li> Faxitron (X-ray): X-stralen worden wekelijks afgenomen begint tussen dag 7 tot 14. Laesies zullen zichtbaar zijn in de intracardiale model op dag 21 en een week eerder in de intratibial injecties 3. De radiografische gegevens voor ex vivo en in vivo werd verkregen met een Faxitron LX-60 bij 35 kV gedurende 8 seconden blootstelling. </li><li> Andere Imaging: Imaging modaliteiten wordt in zijn geheel gebaseerd op de specifieke onderzoek. Naast de hierboven beschreven werkwijzen, kunnen levende dieren beeldvorming op basis van 3D micro-tomografie (μCT), micro-positron emissie tomografie (μPET) en andere modaliteiten 10,11 waardevolle informatie. </li></ol> 6. Muis Sacrifice <ol><li> Elk model heeft een iets ander tijdsverloop. Met MDA-MB-231 cellen muizen meestal worden cachectische of dwarslaesie tussen 21 en 35 dagen en meestal rond dag 28 (IT geïnjecteerde muizen tussen 21-28 dagen). </li><li> Als meerdere muizen ontwikkelen laesies beginnen te breken door het corticale bot, paraplegic worden, of 10-20% van het lichaamsgewicht, alle muizen in onderzoek met ketamine / xylazine overdosering met cervicale dislocatie (of andere goedgekeurde methode IACUC) offeren verliezen. </li><li> Verwijder botten nodig voor verdere studie en opslaan in gebufferde 4% formaline. </li><li> Muizen met borst tumoren zijn een teken van een gemiste injectie en moeten worden uitgesloten van de studie. </li></ol> 7. Ex Vivo Analysis <ol><li> μCT: scannen in 70% EtOH maakt structurele en histologische parameters te meten op dezelfde bot specimen. </li><li> Contour en analyseren naar individuele experimenteel ontwerp en de uitrusting 10. Onze gegevens werden verkregen met een Scanco μCT 40 met behulp van 12 uM resolutie. </li><li> Histomorphometry: Proces exemplaren met behulp van bij voorkeur histologische methoden en kleuren met hematoxyline / eosine 7 </li></ol> 8. Representatieve resultaten Na intracardiale of intratibial inoculatie van tumorcellen (figuur 1) muizen worden wekelijks gecontroleerd door radiografie en fluorescentie (of luminescentie). Laesies gewoonlijk duidelijker worden door x-ray van week 2 en 3, terwijl ze zichtbaar door fluorescentie en luminescentie al week 2, afhankelijk van het model (Figuur 2). Laesies zichtbaar als een donkere gaten in het bot, en meer uitgesproken in de tijd (Figuur 3). Laesies werden gekwantificeerd met Metamorph analyse van röntgenfoto&#39;s en fluorescentie werd gekwantificeerd met behulp Maestro (CRI) beeldvorming acquisitie en analyse software. Als laesies beginnen te groeien, muizen vaak worden cachectische. Offer vereist wanneer muizen verloren 10-20% van hun aanvankelijke gewicht. De toestand van de<html> muizen kunnen snel veranderen en gecontroleerd worden meerdere keren per dag. Tussen 3-4 weken muizen begonnen een of beide achterpoten slepen en de hele studie opgeofferd. Beelden werden genomen vóór offeren. Na verdoving overdosis werd bloed verzameld om markers van botmetabolisme of andere factoren te meten. Na cervicale dislocatie, de huid werd ontdaan van de muis en botten uitgesneden en schoongemaakt ex vivo imaging (figuur 3) die visualisatie van tumorfoci zal ten minste 7 dagen eerder dan in vivo imaging technieken. Zodra beeldvorming werd voltooid botten werden geplaatst in het label cassettes en opgeslagen in formaline voor fixatie en verdere histologische verwerking of μCT analyse. Histomorfometrie werd uitgevoerd op de monsters naar de tumorlast en BV / TV geven nadat μCT werd uitgevoerd op een tibia om de hoeveelheid botafbraak (figuur 4) te kwantificeren. / 4260/4260fig1.jpg &quot;/&gt; Figuur 1. Juiste plaatsing van injectie. Ventrale radiografische weergave (A) van volwassen muis thorax geeft juiste plaatsing van de naald in de 4e intercostale ruimte en in de linker ventrikel van intracardiale inoculatie. Anatomische oriëntatiepunten worden weergegeven met horizontale stippellijnen op het borstbeen (een witte rand). Op de huid van de muis het borstbeen en xyphoid proces dienen als herkenningspunt, en de naald wordt ingebracht iets links van het borstbeen. Ventrale radiografische weergave (B) van volwassen muis been geeft juiste plaatsing van de naald in de proximale tibia, uitgelijnd tussen de condyli. Vanuit een laterale perspectief van de punt van de naald wordt geplaatst achter de tuberositas tibiae en diep om de epifysairschijven. Ideale locatie voor injectie wordt aangegeven door witte cirkel. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4260/4260fig2.jpg" /> Figuur 2. Tijdsverloop van bot metastase modellen. Progressie van ca.ncer geïnduceerde botziekte weergegeven met x-stralen en GFP + fluorescerende beelden van tumoren in vivo door intratibial injecties (A) en intracardiale injecties (B). <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/4260/4260fig3.jpg" /> Figuur 3. Tijdsverloop van intracardiale MDA-MB-231 model Bovenste rij:. Ex vivo beeld dat GFP-fluorescentie op dag 0, 14, 21 en 28 na intracardiale injectie van MDA-MB-231. Merk op dat de tumor foci op dag 14 zijn alleen zichtbaar in ex vivo na zachte weefsels te verwijderen. Onderste rij: Ex vivo radiografische beelden van dezelfde femora illustreren osteolytische botlaesies. Merk op dat botafbraak gewoonlijk niet zichtbaar tot 3 weken na injectie cardiale. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/4260/4260fig4.jpg" /> Figuur 4. Kwantificering van het bot metastatische progressie. GFP + tumor als gevisualiseerd door Maestro beeldvorming ex vivo van Tibiae van een niet-tumor dragende muizen (A) en een muis 4 weken na injectie van een intracardiale GFP expressie MDA-MB-231-subkloon (B). Tumorfoci correleren met gebieden van botafbraak zoals door Faxitron (D) ten opzichte van een bot zonder tumor (C). Bone structurele en minerale gegevens van microCT metingen wordt weergegeven als 3D-beelden van een gezonde bot (E) en een tumor dragende bot (F) als gebieden van botafbraak worden weergegeven als nietig gebied. Verdere bot en tumor detail gezien in H &amp; E gekleurde histologische secties (G &amp; H).

<ol><li>Sterling, J. A., Edwards, J. R., Martin, T. J., Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+biology+of+bone+metastasis%3A+how+the+skeleton+affects+tumor+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Advances in the biology of bone metastasis: how the skeleton affects tumor behavior.</a> Bone. 48, 6-15 (2011).</li>
<li>Yoneda, T., Sasaki, A., Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteolytic+bone+metastasis+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res.+Treat%22%5BJournal%5D)">Osteolytic bone metastasis in breast cancer.</a> Breast Cancer Res. Treat. 32, 73-84 (1994).</li>
<li>Johnson, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+promotion+of+Gli2-induced+expression+of+parathyroid+hormone-related+protein%2C+an+important+osteolytic+factor+in+bone+metastasis%2C+is+independent+of+canonical+Hedgehog+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">TGF-beta promotion of Gli2-induced expression of parathyroid hormone-related protein, an important osteolytic factor in bone metastasis, is independent of canonical Hedgehog signaling.</a> Cancer Res. 71, 822-831 (2011).</li>
<li>Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+TGF-beta+Responsiveness+in+Prostate+Stromal+Cells+Alters+Chemokine+Levels+and+Facilitates+the+Development+of+Mixed+Osteoblastic%2FOsteolytic+Bone+Lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Loss of TGF-beta Responsiveness in Prostate Stromal Cells Alters Chemokine Levels and Facilitates the Development of Mixed Osteoblastic/Osteolytic Bone Lesions.</a> Mol. Cancer Res. , (2012).</li>
<li>Yoneda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actions+of+bisphosphonate+on+bone+metastasis+in+animal+models+of+breast+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Actions of bisphosphonate on bone metastasis in animal models of breast carcinoma.</a> Cancer. 88, 2979-2988 (2000).</li>
<li>Rose, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoactivin+promotes+breast+cancer+metastasis+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Osteoactivin promotes breast cancer metastasis to bone.</a> Mol. Cancer Res. 5, 1001-1014 (2007).</li>
<li>Sterling, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hedgehog+signaling+molecule+Gli2+induces+parathyroid+hormone-related+peptide+expression+and+osteolysis+in+metastatic+human+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The hedgehog signaling molecule Gli2 induces parathyroid hormone-related peptide expression and osteolysis in metastatic human breast cancer cells.</a> Cancer Res. 66, 7548-7553 (2006).</li>
<li>Lu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VCAM-1+promotes+osteolytic+expansion+of+indolent+bone+micrometastasis+of+breast+cancer+by+engaging+alpha4beta1-positive+osteoclast+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">VCAM-1 promotes osteolytic expansion of indolent bone micrometastasis of breast cancer by engaging alpha4beta1-positive osteoclast progenitors.</a> Cancer Cell. 20, 701-714 (2011).</li>
<li>Oyajobi, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+myeloma+in+skeleton+of+mice+by+whole-body+optical+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Detection of myeloma in skeleton of mice by whole-body optical fluorescence imaging.</a> Mol. Cancer Ther. 6, 1701-1708 (2007).</li>
<li>Johnson, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+live+animal+micro-CT+allows+for+quantitative+analysis+of+tumor-induced+bone+destruction%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Longitudinal live animal micro-CT allows for quantitative analysis of tumor-induced bone destruction.</a> Bone. 48, 141-151 (2011).</li>
<li>Sterling, J., Johnson, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSterling%2C+J+%22Imaging+Techniques+for+the+Detection+and+Examination+of+Breast+Cancer+Metastasis+to+Bone%22">Imaging Techniques for the Detection and Examination of Breast Cancer Metastasis to Bone</a>. 46, Nova Science Publishers. (2011).</li>
<li>Steinbauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP-transfected+tumor+cells+are+useful+in+examining+early+metastasis+in+vivo%2C+but+immune+reaction+precludes+long-term+tumor+development+studies+in+immunocompetent+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">GFP-transfected tumor cells are useful in examining early metastasis in vivo, but immune reaction precludes long-term tumor development studies in immunocompetent mice.</a> Clin. Exp. Metastasis. 20, 135-141 (2003).</li>
<li>Oyajobi, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+effects+of+macrophage+inflammatory+protein-1alpha+on+osteolysis+and+tumor+burden+in+the+murine+5TGM1+model+of+myeloma+bone+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dual effects of macrophage inflammatory protein-1alpha on osteolysis and tumor burden in the murine 5TGM1 model of myeloma bone disease.</a> Blood. 102, 311-319 (2003).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Studies van tumor-geïnduceerde botziekte berusten op verschillende diermodellen waarvan de twee meest gebruikte zijn intracardiale en intratibial inentingen. In veel gevallen intracardiale is de beste optie voor het bestuderen van metastasen in het bot, maar het geeft niet het volledige metastatische proces, en dus uiervet pad of andere orthotope injecties moet idealiter worden gebruikt in de richting van dat doel. Tumorcellen niet gemakkelijk uitzaaien van de primaire locatie in de meeste studies met menselijke cellen,...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> MDA-MB-231 menselijke borstkankercellen </td><td> Oorspronkelijk ATCC-Intern gekloneerd en geselecteerd </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 11885 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech Inc </td><td> 21-040-CV </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Atlas Biologische </td><td> F-0050a </td></tr><tr><td> Trypsine </td><td> GIBCO </td><td> 15400 </td></tr><tr><td> Faxitron </td><td> Faxitron </td><td></td></tr><tr><td> Meester </td><td> CRi </td><td></td></tr><tr><td> μCT scanner </td><td> Scanco </td><td></td></tr><tr><td> Naakt athymische muizen </td><td> Harlan </td><td> Fox nu - / - </td></tr><tr><td> Insulinespuiten (300 ul, 28,5 g) </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309300 </td></tr><tr><td> IVIS </td><td> Caliper </td><td></td></tr><tr><td> Bestraalde knaagdierendieet </td><td> Teklad </td><td> 2920x </td></tr></tbody></table>

modellen van bot metastase

Models of Bone Metastasis

Botmetastasen schering en inslag in verscheidene maligniteiten, met inbegrip van borst, prostaat en long. Eenmaal in bot, tumoren zijn verantwoordelijk voor aanzienlijke morbiditeit en mortaliteit 1. Aldus bestaat er een grote behoefte om de moleculaire mechanismen die de inrichting, groei en activiteit van tumoren in het bot begrijpen. Verschillende in vivo modellen zijn opgericht om deze gebeurtenissen te bestuderen en elk heeft specifieke voordelen en beperkingen. De meest gebruikte model gebruikt intracardiale inoculatie van tumorcellen aan de arteriële bloedtoevoer athymische (naakt) BalbC muizen. Deze procedure kan worden toegepast op vele verschillende types tumoren (zoals PC-3 prostaatkanker, longcarcinoom en muis uiervet pad tumoren), maar in dit manuscript richten we ons op de borstkankermodel, MDA-MB-231. In dit model gebruiken we een zeer bot-selectieve kloon, oorspronkelijk afgeleid in de groep Dr Mundy&#39;s in San Antonio 2, dat hals inmiddels getransfecteerd voor GFP expressie en opnieuw gekloneerd door onze groep 3. Deze kloon is een bot uitgezaaide variant met een hoog osteotropism en zeer weinig metastasen in longen, lever of bijnieren. Terwijl intracardiale injecties worden meestal gebruikt voor onderzoek naar bot metastase 2, in bepaalde gevallen intratibial 4 of uiervet pad injecties zijn meer geschikt. Intracardiale injecties worden meestal uitgevoerd met menselijke tumorcellen met als doel de controle latere stadia van metastase, specifiek het vermogen van kankercellen om arresteren in botten, overleven, prolifereren en tumoren die zich ontwikkelen tot kanker geïnduceerde botziekte stellen. Intratibial injecties worden uitgevoerd als de nadruk op de relatie tussen kankercellen en bot na een tumor is uitgezaaid naar het bot, die ruwweg correleert met gevestigde gemetastaseerde botziekte. Geen van deze modellen recapituleert vroege stappen in het metastatische proces vóór embolie en vermeldingvan tumorcellen in de circulatie. Voor het controleren van de primaire tumorgroei of metastase van de primaire locatie aan het bot, dan uiervet pad inentingen zijn meestal de voorkeur, maar zeer weinig tumorcellijnen zal consequent aan het bot uitzaaien van de primaire site, met 4T1 bot-preferentiële klonen, een muis borstklier carcinoom, de uitzondering 5,6. Dit manuscript gegevens inoculatie procedures en hoogtepunten belangrijkste stappen in na inoculatie analyses. Specifiek omvat celkweek, tumorcel inoculatie procedures voor intracardiale en intratibial inentingen alsmede beknopte informatie over wekelijks gecontroleerd door x-ray, fluorescentie en histomorfometrische analyse.

Diermodellen worden vaak gebruikt om uitzaaiing studeren bot. In dit protocol beschrijven we twee gebruikelijke methoden van tumorinoculatie voor bot metastase studies en beschrijf kort enkele van de analyses gebruikt om toezicht te houden en te kwantificeren deze modellen.

Modellen van bot metastase

Botmetastasen komen veel voor bij verschillende maligniteiten, waaronder borst-, prostaat- en longkanker. Zodra tumoren zich in het bot hebben gevestigd, zijn zij verantwoordelijk voor ...

Het algemene doel van deze procedure is om tumorcellen op een zodanige wijze te injecteren dat tumorgroei in het bot en daaropvolgende botdestructie worden geïnduceerd. Dit wordt bereikt door tumorcellen eerst te resuspenderen in koude PBS en op ijs te plaatsen. Vervolgens wordt een passend aantal cellen geïnjecteerd in de linker hartventrikel of in de tibia van een geanestheseerde muis.Vervolgens worden de groei van de bottumor en de botparameters longitudinaal gevolgd via meerdere beeldvormingstechnieken. Ten slotte wordt een eindpuntkwantificering van de tumor- en botparameters uitgevoerd. Uiteindelijk wordt een combinatie van in vivo en ex vivo fluorescentie of luminescentie 2D-radiografie 3D ingezet.Micro-CT en histologie worden gebruikt om tumorgroei en veranderingen in de botmicro-omgeving op cellulair en structureel groeiniveau aan te tonen. Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van kankermetastasering, zoals welke factoren in het bot de metastatische kolonisatie van borst- en prostaatkanker mogelijk maken. De celvoorbereiding zal worden gedemonstreerd door Alisa Merkel, een onderzoeksassistent in mijn laboratorium, die de cellen minder dan een week onderhoudt.Kweek de GFP-gelabelde MDAMB 231-kloon in DMEM met 10% FBS en 0,1 mg/mL penicilline-streptomycine bij 37 °C in 5 tot 8% CO2. Pas aan wanneer de cellen een confluentie van 80 tot 90% bereiken en vervang het medium in een 1:10 verdunning. Om de cellen voor inoculatie voor te bereiden, worden ze bij 80 tot 90% confluentie getrypsiniseerd met 0,15% trypsine-EDTA met gebruik van 10 mL.Overbreng de cellen onmiddellijk naar een conische buis van 50 milliliter met ijskoud DMEM met 10% FBS en centrifugeer gedurende vijf minuten. Resuspendeer de pellet in een conische buis van 50 milliliter in 25 milliliter ijskoud PBS zonder calcium en magnesium en tel de cellen; pellet de cellen opnieuw en resuspendeer in ijskoud PBS op een concentratie van 10⁶ cellen per milliliter voor intracardiale inoculatie en 250.000 cellen per milliliter voor intratibiale injectie.Voor deze experimenten worden immuungecompromitteerde vrouwelijke muizen van vier tot zes weken oud gebruikt, die vijf tot 10 dagen voor de injectie een Tela 29 20 x dieet hebben gekregen. Nadat de muis in een kamer is geanestheseerd met 2,5% isofluorine, wordt de muis onder een geventileerde kap naar een neusmasker verplaatst en op de rug gepositioneerd. Gebruik een 10% povidonjodiumoplossing om de borst te wassen, gevolgd door 70% ethanol.Markeer de borst van de muis voor de injectie halverwege tussen de sternale inkeping en de bovenkant van het xiphoidale proces, en iets links van het sternum. Gebruik vervolgens een insulinespuit van 300 µL met een naald van 28 gauge en een halve inch. Trek een kleine luchtbel op om ruimte te creëren tussen de zuiger en de meniscus, en trek 100 µL cellen op terwijl u met één hand de huid van de muis strak houdt.Houd de naald rechtop; bij een succesvolle inbreng in de linker hartventrikel moet een duidelijk helderrode bloedpuls in de spuit zichtbaar zijn. Duw op deze diepte de zuiger van de spuit voorzichtig in zonder de naald significant te bewegen, om te voorkomen dat het hart wordt doorboord of dat er cellen in de borstholte lekken. Om het druppelen van cellen in de borstholte te verminderen, kan de zuiger iets worden omhooggetrokken om een kleine hoeveelheid negatieve druk te creëren.Trek vervolgens de naald direct uit de borstkas, waarbij u er zeker van bent dat de naald tijdens het verwijderen niet kantelt, aangezien dit het hartzakje kan scheuren en bloedingen kan veroorzaken. Oefen ongeveer één minuut lang een lichte druk uit op de injectieplaats om de bloeding te verminderen. Verplaats de muis terwijl u de neuskegel verwijdert naar een warmtemat tot het dier volledig bij bewustzijn is.Injecteer de muis vlak voor de intratibiale procedure met bup printex. Nadat de muis is geanestheseerd en in een neusconus is geplaatst, worden beide poten gereinigd met 10% povidonjodium, gevolgd door ethanol, met een beweging van vier vingers en de duim.Pak de malleolus lateralis, de malleolus medialis en de onderste helft van de tibia voorzichtig vast. Buig vervolgens het been zodanig dat de knie zichtbaar en toegankelijk is. Maak de huid nat met 70%ethanol om de zichtbaarheid van het onderliggende patellaligament te vergroten; dit zou zichtbaar moeten zijn als een duidelijke dikke witte lijn terwijl de enkel stevig wordt vastgehouden.Steek een naald van 28 gauge en een halve inch onder de patella, door het midden van het ligamentum patellae en in het gebied van de anterior intercondylaire inkeping aan de bovenzijde van de tibia. Oefen een gestage, stevige druk uit met een lichte boorbeweging om de naald voorzichtig door de groeischijf te leiden. Zodra de groeischijf van de tibia is doorboord, zal de naald aanzienlijk minder weerstand ondervinden.Beweeg de naald voorzichtig zijwaarts om er zeker van te zijn dat deze zich in de tibia en door de groeischijf bevindt. De beweging zal beperkt zijn als de naald op de juiste plaats in de tibia zit. Druk de zuiger langzaam in om 10 µL van de celoplossing te injecteren.Op dit punt mag er weinig tot geen weerstand voelbaar zijn. Trek vervolgens langzaam de naald eruit. Haal de muis uit de anesthesie en houd deze op een warmtemat tot het dier volledig is hersteld.Controleer de muis twee tot drie keer per week. Diverse beeldvormingstechnieken, zoals luciferase, GFP-fluorescentie en röntgenstraling, worden uitgevoerd op geanestheseerde muizen. De fluorescentie geeft de gebieden met tumor aan.Een estron-scan wordt gebruikt om laesies te lokaliseren. De laesies komen overeen met de fluorescentiebeelden. Verdere details over de beeldvormingstechnieken zijn te vinden in het geschreven gedeelte van dit protocol.21 tot 35 dagen na injectie. Offer de muizen op met een door de IACUC goedgekeurde methode en bewaar de botten in 4% Formaline. Voer ex vivo-analyses uit met micro-CT en histomorfometrie met hematoxine- en DSN-kleuring op de geïsoleerde botten. Details zijn te vinden in het geschreven protocol voor intracardiale of intratibiale inoculatie van tumorcellen.Muizen worden wekelijks gecontroleerd via radiografie en fluorescentie of luminescentie. Laesies worden normaal gesproken tussen week twee en drie zichtbaar op de röntgenfoto. Hoewel ze, afhankelijk van het model zoals hier getoond, al in week twee zichtbaar kunnen zijn via fluorescentie en luminescentie, zijn laesies zichtbaar als donkere gaten in het bot en kunnen deze na verloop van tijd prominenter worden. Laesies werden gekwantificeerd met behulp van metamorph-analyse van radiografieën en fluorescentie.Kwantificering is uitgevoerd met maestro-beeldverwervings- en analysesoftware. In deze figuur wordt botverlies gekwantificeerd met micro-CT-analyse. Botstructurele en minerale gegevens uit micro-CT-metingen zijn weergegeven als 3D-beelden van gezond bot en een tumorhoudend bot, waarbij gebieden met botdestructie als een leegte worden getoond.Vervolgens werd histomorfometrie uitgevoerd op de monsters om de tumorlast en de botvolumefractie (botvolume ten opzichte van weefselvolume) te bepalen. Bij het uitvoeren van deze procedures is het belangrijk om geduldig te zijn, elke muis zorgvuldig te positioneren en de muizen nauwlettend te volgen. Als ze beginnen te sterven, is dit waarschijnlijk te wijten aan celklontering en moet u onmiddellijk nieuwe cellen prepareren.Het ergste wat u kunt doen is de procedures overhaasten of gefrustreerd raken. Onthoud dat u met meer oefening en tijd beter en sneller zult worden. Na hun ontwikkeling maakten deze technieken de weg vrij voor kankeronderzoekers om botmetastasen in vivo te bestuderen.

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

In de pathogenese van bot metastase, angiogenese is een cruciaal proces en vormt derhalve een doel voor beeldvorming en therapie. Hier presenteren we een rat model van site-specifieke borstkanker botmetastase en beschrijven strategieën om niet-invasieve beeld...

Multi-modale beeldvorming van angiogenese in een Naakt ratmodel van borstkanker botmetastase Met behulp van Magnetic Resonance Imaging, Volumetrische computertomografie en Echografie

Dit orthotopisch model van menselijke prostaatkanker maakt kwantificering van tumorgrootte circulerende tumorcellen en de vorming van verschillende metastase naar de longen. Omdat de cellen van het belangrijkste orgaan moet ontsnappen, in de bloedsomloop, en implantaat in een tweede locatie, dit model effectief recapituleert het scenario bij de mens.

Een orthotope muizenmodel van menselijke prostaatkankercellen Metastasis

Protocollen worden beschreven voor het bestuderen van borstkanker celmigratie, proliferatie en kolonisatie in een menselijk botweefsel explantaatmodel systeem.

Methoden voor het kweken van menselijke dijbeen weefselexplantaten naar Breast Cancer Cell Kolonisatie van het gemetastaseerde Niche Bestudeer

Dit manuscript beschrijft de gedetailleerde procedure van intra-iliacale arteriële (IIA) injectie, een techniek om kankercellen specifiek af te leveren aan weefsels van de achterpoten, inclusief botten, om experimentele botmetastasen te creëren. Hoewel het oorspronkelijk werd vastgesteld met borsttumormodellen, kan dit protocol gemakkelijk worden uitgebreid naar andere soorten kanker.

Intra-iliaca Injectie voor Efficiënte en Selectieve Modellering van Microscopisch botmetastase

Directe inspuiting van kanker afkomstige extracellulaire blaasjes (EVs) leidt tot een herprogrammering van beenmerg, ter ondersteuning van de progressie van de tumor; het is echter onduidelijk welke cellen bemiddelen dit effect. Hierin beschrijven we een stapsgewijze protocol om te onderzoeken EV-gemedieerde tumor-mesenchymale stamcellen (MSC) interacties in vivo, onthullen een cruciale rol voor EV-opgeleide MSCs in metastase.

Een preklinische muismodel van osteosarcoom definiëren de extracellulaire vesikel-gemedieerde communicatie tussen Tumor en mesenchymale stamcellen

De ex vivo cultuur van botexplants kan een waardevol instrument zijn voor de studie van de botfysiologie en de mogelijke evaluatie van geneesmiddelen bij botremodellering en botziekten. Het gepresenteerde protocol beschrijft de voorbereiding en cultuur van calvarias geïsoleerd van pasgeboren muizen schedels, evenals de toepassingen ervan.

Het meten van bot remodelleren en recreëren van de Tumor-Bone Microenvironment Met behulp van Calvaria Co-cultuur en Histomorphometrie

Hier is het bot extracellulaire matrix (BEM) model voor Osteosarcoom (OS) gevestigde en getoond. Het kan worden gebruikt als een geschikte steiger voor nabootsen van primaire tumor groei in vitro en bieden een ideaal model voor het bestuderen van de histologische en cytogenic heterogeniteit van OS.

Driedimensionale bot extracellulaire Matrix Model voor Osteosarcoom

Intraveneuze injectie van kankercellen wordt vaak gebruikt in metastaseonderzoek, maar de gemetastaseerde tumorbelasting kan moeilijk te analyseren zijn. Hierin demonstreren we een staartaderinjectiemodel van metastase en nemen we een nieuwe benadering op om de resulterende gemetastaseerde longtumorbelasting te analyseren.

Pathologische analyse van longmetastase na laterale staartaderinjectie van tumorcellen

Botmetastasemodellen ontwikkelen metastase niet uniform of met een 100% incidentie. Directe intra-osseuze tumorcelinjectie kan leiden tot embolisatie van de long. We presenteren onze techniek voor het modelleren van primaire bottumoren en botmetastase met behulp van solide tumortransplantaatimplantatie in bot, wat leidt tot reproduceerbare transplantatie en groei.

Modellering van primaire bottumoren en botmetastase met implantatie van solide tumortransplantaten in bot

Het huidige protocol beschrijft intratibia osteosarcoom celinjectie om muismodellen te genereren met orthotopisch osteosarcoom en pulmonale metastase laesies.

Intratibiale osteosarcoomcelinjectie om orthotopisch osteosarcoom en longmetastase muismodellen te genereren

Hier presenteren we een protocol voor de intra-cardiale injectie van menselijke prostaatkankercellen om een muismodel met botmetastaselaesies te genereren.

Intra-cardiale injectie van menselijke prostaatkankercellen om een botmetastase xenograft muismodel te creëren

Leer methoden voor tumorinoculatie bij muizen om botmetastase van kanker te bestuderen. Dit protocol beschrijft injectietechnieken en beeldvorming voor het monitoren van tumorprogressie en botdestructie.

Modellen van bot metastase

Meer video's verkennen