Name: Ex vivo kweken van Whole, Het ontwikkelen van Drosophila Brains (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Leer ex vivo kweken van ontwikkelende Drosophila-hersenen voor neurowetenschappelijk onderzoek. Deze methode bootst in vivo ontwikkeling van de mushroom body na en maakt gedetailleerde analyse van dynamische ontwikkelingsprocessen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen alle leden van ons lab bedanken voor hun advies, nuttige discussies en commentaar op het manuscript. We zouden ook bijzonder graag Marta Koch en Bassem Hassan bedanken voor de uitstekende suggestie dat wij tot 1,5 uur APF wachten voordat het ontleden van hersenen voor het kweken van in remodeling experimenten. We danken ook de NHGRI imaging faciliteit voor het gebruik van hun confocale microscoop. Dit werk werd ondersteund door de basis Neuroscience Programma van de NINDS Intramurale Research Program, NIH (Z01 NS003106).

A. Bereiding van de Media <ol><li> Bereid complete media door filter-gesteriliseerd Schneider Drosophila media waaraan 10% foetaal runderserum en 1% penicilline / streptomycine. </li><li> De media moeten vers worden bereid per keer. Als alternatief kan een nieuwe hoeveelheid vooraf ingevroren media worden ontdooid voor elk gebruik. </li><li> Voorafgaand aan kweken voeg 10 ug / ml insuline en 2 ug / ml ecdyson de media. Drugs werden bereid zoals geconcentreerde voorraden en ingevroren in kleine fracties. Ontdooide porties waren niet ingevroren. </li><li> Alle werkoplossingen te handhaven op 25 ° C. </li></ol> Het kweken van larven Brains 1. Selectie en dissectie van larvale Brains <ol><li> Voeg 500 ul van media op een 12 mm Millicell celkweek insert. De hersenen ontleed zal worden geplaatst in deze inserts gemakkelijk immunokleuring te vergemakkelijken. </li><li> Voeg een kleine hoeveelheid bereid uit een ontleding horlogeglas. </li><li> Uzingen een kleine spatel, pick-up zwerven derde instar larven en plaats ze in het horlogeglas. (We veronderstellen dat de ex vivo kweekmethode zou even goed van toepassing zijn op de eerste of tweede instar larven, maar we hebben dit niet getest.) </li><li> Houd het achterste eind van de larve met een pincet voorzichtig het openstellen van de voorste einde met een tweede paar # 5 tang. </li><li> Snel ontleden van de hersenen, het bijhouden van de ventrale zenuw koord intact. </li></ol> 2. Ex vivo kweken van Ontleed larven Brains <ol><li> Met behulp van pre-wet pipetpunten, zorgvuldig over te dragen van de hersenen in de cel cultuur van inserts, vooraf gevuld met media. </li><li> Transfer hersenen, in media met een incubator bij 25 ° C tot de gewenste tijd-punt is bereikt. Deze methode werkt efficiënt voor maximaal 48 uur in de cultuur. </li><li> Vervang de media op 8 uur. Buiten dat, vervang dan de helft van de media om de 5-6 uur. </li></ol> 3. Farmacologische manipulatie vanLarvale Brains Deze methode van ex vivo kweken kan worden farmacologisch bevestigen genetische interacties eerder aangetoond in ons laboratorium 1. <ol><li> Voeg 100 uM roscovitine en 100 uM olomoucine aan geprepareerde media. </li><li> Overdracht ontleed hersenen van deze media. </li><li> Culture hersenen bij 25 ° C gedurende 24 uur. </li><li> Vervang de media op 8 uur. Buiten dat, vervang dan de helft van de media (met medicijnen) om de 5-6 uur. </li></ol> Het kweken van pop Brains 1. Selectie van Poppen voor Dissection <ol><li> Markeer witte poppen op flessen / flacons. </li><li> Kies alleen poppen die helemaal wit. Poppen met enige vorm van kleuring dient niet te worden opgenomen. </li><li> Deze fase is 0 uur Na puparium Vorming (APF). </li><li> Deze poppen klaar voor dissectie zijn 1,5 uur na markering. Deze stap is cruciaal om ervoor te zorgen dat de ontwikkeling snoeien vindt plaats in ex vivo </em&gt; cultuur. </li></ol> 2. Dissectie van Poppen <ol><li> Voeg 500 ul van media op een 12 mm Millicell celkweek insert. (De hersenen ontleed zal worden geplaatst in deze inserts gemakkelijk immunokleuring te vergemakkelijken). </li><li> Als de gewenste tijd-punt is bereikt, toe een kleine hoeveelheid bereid uit een ontleding horlogeglas. </li><li> Met behulp van een kleine, natte spatel, pick-up poppen die eerder gemarkeerd voor dissectie en plaats ze in het horlogeglas. </li><li> Houd het achterste einde van de poppen met een pincet, voorzichtig open het voorste uiteinde van de pop geval een tweede paar # 5 tang. </li><li> Snel ontleden van de hersenen, het bijhouden van de ventrale zenuw koord intact en de bijgevoegde. </li></ol> 3. Ex vivo kweken van Ontleed pop Brains <ol><li> Breng voorzichtig de hersenen in de cel cultuur van inserts, vooraf gevuld met media. </li><li> Transfer hersenen, in media met een incubator bij 25 ° C tot de gewenste tijd-point bereikt. We gebruikten deze methode voor maximaal 10 uur in de cultuur voor de getoonde experiment, maar het kan worden uitgebreid tot een langere periode van observatie en behandeling, indien nodig. </li><li> Voor tijdstippen langer dan 8 uur APF, vervang dan de media om de 5-6 uur. </li></ol> Vanaf deze stap op, het protocol ongewijzigd blijft voor zowel de larven en poppen. B. Bevestiging Ontleed Brains <ol><li> Nadat de gewenste tijd-punt is bereikt, verwijder media en voeg 500 pi 4% formaldehyde in 1x PBS met 0,5% Triton X-100 (PBST) gedurende 30 minuten vervangen verse formaldehyde na 15 minuten. </li><li> Zorg ervoor dat niet toe te staan ​​hersenen om te drogen bij het vervangen van media met een fixatief. </li><li> Was formaldehyde met vier 10 minuten wasbeurten van 1x PBS met 0,5% TritonX-100 (PBST). </li></ol> C. Kleuring Vaste Brains <ol><li> Na formaldehyde is gewassen, blokkeren hersenen gedurende 1 uur in een blokkeeroplossing van 1x PBS met 1% NormaalGeit Serum en 1% runds serum albumine. </li><li> Voeg primaire antilichamen in blokkeeroplossing gemaakt. </li><li> Incubeer hersenen overnacht bij 4 ° C. </li><li> De volgende ochtend, wassen primaire antilichamen met vier 10 minuten wasbeurten van PBST. </li><li> Voeg secundaire antilichamen in het blokkeren oplossing gemaakt. </li><li> Laat bij kamertemperatuur gedurende 4 uur. </li><li> Was secundaire antilichamen met vier 10 minuten wasbeurten van PBST. </li></ol> D. Montage gefixeerd en gekleurd Brains voor Microscopie <ol><li> Equilibreer hersenen in Vectashield montage media voor 1 uur. </li><li> Monteer hersenen op glasplaatjes met behulp van de Vectashield montage media. </li><li> Plaats glas chips aan weerszijden van de hersenen bij montage van de dekglas. Dit voorkomt de hersenen van dat onderdrukt, terwijl monster dun genoeg alle beeldvlakken scannen met een confocale microscoop. Brains waren ruwweg gericht op de montage te vergemakkelijken het bekijken van de kenmerken van belang. Indien nodig,hersenen beelden waren gedraaid met Imaris software om een ​​optimaal zicht voor de documentatie en de meting te verstrekken. </li><li> Dicht dekglaasjes met duidelijke nagellak. </li><li> Store glijdt weg van het licht. </li></ol> E. representatieve resultaten Figuur 1 toont een panel van derde larvale instar hersenen van (A) wild-type gemeten, en (B) vliegen een dominant-negatieve derivaat van Cdk5 (Cdk5DN) (Connell-Crowley et al., 2000). Drukken. Zowel express actine-GFP (groen) in MB gamma-neuronen. Zoals eerder beschreven (Trunova et al.., 2011), is er een regio in het proximale axonen van wild-type gamma-neuronen die niet op te hopen actine-GFP, dus weergegeven als een &quot;clear zone&quot; (A, beugel), en fasciclin 2 eiwit (rood) hoopt zich op in de axonen slechts tot de ventrale rand van deze zone (witte horizontale lijn). De stippellijn in het derde paneel van figuur 1 (A) geeft de positie van de MB markeren handelingin &quot;clear zone&quot; en de ventrale grens. In vliegen uiten Cdk5DN, de actine clear zone is afwezig (B) en Fasciclin 2 (FasII) immunoreactiviteit verspreidt dorsaal door middel van die regio. (Merk op dat de variabele aantal FasII-positieve axonen project horizontaal over de MB, deze niet relevant zijn voor het fenotype). Schaal balk vertegenwoordigt 20 urn. Met deze methode van ex vivo kweken we wild-type vliegen behandeld met een combinatie van roscovitine en olomoucine, farmacologische remmers van Cdk5 activiteit. Figuur 2 toont een panel van derde larvale instar hersenen van controle (A) en met geneesmiddel behandelde (B ) wild-type vliegen. Net als bij vliegen expressie van een dominant negatieve Cdk5 constructie, de hersenen behandeld met Cdk5-remmers gedurende 24 uur, tonen de karakteristieke verlies van actine heldere zone en de verschuiving in FasII grens (vierkante haakjes). Witte lijnen tonen positie van wild-type FasII grens. Schaal balk vertegenwoordigt 20 urn. Figure 3 toont een representatieve reeks van Drosophila mushroom bodies 0-10 uur APF, voorzien van membraan-gerichte mCD8-GFP (groen). Haakjes geven de kelk, dat wil zeggen de projecties van de dendritische MB. Voorafgaand aan de metamorfose, kan men zien MB axonen coursing dorso-ventraal in dikke bundels, evenals een &#39;waas&#39; van fluorescerende signaal als gevolg van de dichte dendritische Arbor (beugel). Paneel A toont hersenen ontleed op de aangegeven tijd. Let op het snoeien van dendrieten in de regio wordt aangegeven door de haakjes, zoals dat door het 6-8 uur APF, de waas van dendritische signaal is weg (hoewel het axonale signaal wordt niet beïnvloed). Brains in panel B werden ontleed om 0 uur APF, voordat de interne ecdyson spike (Truman en Riddiford, 2002), en gekweekte ex vivo zoals aangegeven. Deze tonen geen ontwikkeling snoeien van dendrieten, maar veeleer de dendritische signaal blijft op 10 uur APF. Om dit te omzeilen, worden poppen gemarkeerd om 0 uur APF, maar ontleed in 1,5 uur APF en gekweekte. Paneell C toont een representatieve reeks van deze Drosophila mushroom bodies 0-10 uur APF. Zoals in de niet-gekweekte monsters wordt dendritische signaal niet aantoonbaar met 8 uur APF. Schaal balk vertegenwoordigt 20 urn.

<ol><li>Trunova, S., Baek, B., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdk5+regulates+the+size+of+an+axon+initial+segment-like+compartment+in+mushroom+body+neurons+of+the+Drosophila+central+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cdk5 regulates the size of an axon initial segment-like compartment in mushroom body neurons of the Drosophila central brain.</a> J. Neurosci. 31 (29), 10451-10462 (2011).</li>
<li>Nakada, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+anchored+proteins+forms+membrane+diffusion+barriers+during+neuronal+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization.</a> Nat. Cell Biol. 5 (7), 626-632 (2003).</li>
<li>Schmid, G., Strosznajder, J. B., Wesierska-Gadek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+the+p53+tumor+suppressor+protein+family+and+Cdk5%3A+novel+therapeutic+approaches+for+the+treatment+of+neurodegenerative+disease+using+selective+Cdk+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Interplay between the p53 tumor suppressor protein family and Cdk5: novel therapeutic approaches for the treatment of neurodegenerative disease using selective Cdk inhibitors.</a> Mol Neurobiol. 34 (1), 27-50 (2006).</li>
<li>Kahsai, L., Zars, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+and+memory+in+Drosophila%3A+behavior%2C+genetics%2C+and+neural+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Learning and memory in Drosophila: behavior, genetics, and neural system.</a> Int. Rev. Neurobiol. 99, 139-167 (2011).</li>
<li>Lee, T., Lee, A., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+mushroom+bodies%3A+sequential+generation+of+three+distinct+types+of+neurons+from+a+neuroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast.</a> Development. 126, 4065-4076 (1999).</li>
<li>Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+pruning+during+Drosophila+metamorphosis%3A+evidence+for+local+degeneration+and+requirement+of+the+ubiquitin-proteasome+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system.</a> Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).</li>
<li>Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+requirement+of+the+USP%2FEcR-B+ecdysone+receptor+for+mushroom+body+neuronal+remodeling+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila.</a> Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).</li>
<li>Connell-Crowley, L., Le Gall, M., Vo, D. J., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cyclin-dependent+kinase+Cdk5+controls+multiple+aspects+of+axon+patterning+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The cyclin-dependent kinase Cdk5 controls multiple aspects of axon patterning in vivo.</a> Curr. Biol. 10 (10), 599-602 (2000).</li>
<li>Truman, J. W., Riddiford, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+insights+into+the+evolution+of+metamorphosis+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects.</a> Annu. Rev. Entomol. 47, 467-500 (2002).</li>
<li>Noguchi, T., Miller, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+actin+dynamics+in+individualization+during+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Development. 130, 1805-1816 (2003).</li>
<li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1%2Fdynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Mol. Biol. Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).</li>
<li>Brown, H. L. D., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+time-lapse+imaging+and+dominant+negative+receptors+to+dissect+the+steroid+receptor+control+of+neuronal+remodeling+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila.</a> Development. 133, 275-288 (2006).</li>
<li>Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Developing+and+Adult+Drosophila+Brains+and+Retinae+for+Live+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging.</a> J. Vis. Exp. (37), e1936(2010).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

<html> Chronische genetische manipulaties van weefsel structuur en functie, met inbegrip van mutaties en de expressie van transgenen, meestal produceren een combinatie van directe effecten en late indirecte gevolgen dat kan heel moeilijk zijn te scheiden. Als aanvulling op genetische methoden met de farmacologie kan vergemakkelijken ondervraging van de tijd natuurlijk achter een fenotype. Zo is dit een krachtige aanpak voor het ontleden van de bijdragen van verschillende cytoskelet componenten tijdens de spermatogenese i...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Eindconcentratie </td></tr><tr><td> Schneider Drosophila Media </td><td> Invitrogen </td><td> 21720-024 </td><td></td></tr><tr><td> Foetaal runderserum (warmte-geïnactiveerd) </td><td> Invitrogen </td><td> 10082-147 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Penicilline / streptomycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Insuline </td><td> Invitrogen </td><td> 12585-014 </td><td> 10μg/ml </td></tr><tr><td> Ecdyson </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H5142 </td><td> 2μg/ml </td></tr><tr><td> Roscovitine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R7772 </td><td> 100 urn </td></tr><tr><td> Olomoucine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O0886 </td><td> 100 urn </td></tr><tr><td> Normaal Geit Serum </td><td> Invitrogen </td><td> 50062Z </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Bovine serum albumine </td><td> Fisher Scientific </td><td> M9501 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Formaldehyde </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D4551 </td><td> 4% </td></tr><tr><td> Triton-X 100 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP151 </td><td> 0,5% </td></tr><tr><td> Fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing </td><td> Invitrogen </td><td> 70011-044 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Laboratories </td><td> H1000 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Millicell Cell Culture Inserts </td><td> Millipore </td><td> PI8P01250 </td><td></td></tr><tr><td> Multidish, 4 goed </td><td> Thermo Scientific </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 5 tang </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11251-20 </td><td></td></tr><tr><td> Microscoop Dia&#39;s </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544-7 </td><td></td></tr><tr><td> Afdekglas </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-548-5M </td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo kweken van whole, het ontwikkelen van drosophila brains

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

Wij beschrijven een werkwijze voor ex vivo kweken van Drosophila geheel hersenen. Dit kan gebruikt worden als een tegenhanger van chronische genetische manipulaties voor het onderzoeken van de celbiologie en de ontwikkeling van het centrum van hersenstructuren door toe te staan ​​acute farmacologische interventies en live beeldvorming van cellulaire processen. Als voorbeeld van de techniek vóór werken ons laboratorium 1 is gebleken dat een eerder opgenomen subcellulair compartiment ligt tussen het axonale en somatodendritisch compartimenten axonen van Drosophila centrale hersenen. De ontwikkeling van dit compartiment, aangeduid als axon eerste segment (AIS) 2 is getoond genetisch afhankelijk van de neuron-specifieke cycline afhankelijke kinase, Cdk5. We laten hier zien dat ex vivo behandeling van wild-type Drosophila larven hersenen met de Cdk5-specifieke farmacologische remmers roscovitine en olomoucine 3 acute veranderingen in het actine organisatie veroorzaakt, enin de lokalisatie van de cel-oppervlakte-eiwit Fasciclin 2, dat de veranderingen gezien in mutanten die Cdk5 activiteit missen genetisch na te bootsen. Een tweede voorbeeld van de ex vivo cultuur techniek is bedoeld voor herinrichting van de aansluitingen van de embryonale paddestoel lichaam (MB) gamma-neuronen tijdens metamorfose van larve tot volwassen. De paddestoel lichaam is het centrum van olfactorische leren en geheugen in de vlieg 4, en deze gamma-neuronen hun axonale en dendritische takken te snoeien tijdens de pop ontwikkeling en vervolgens weer uit te breiden takken op een later tijdstip bepaald aan de volwassen innervatie patroon 5 vast te stellen. Snoeien van deze neuronen van de MB is aangetoond gebeuren door plaatselijke degeneratie van neurite takken 6, door een mechanisme dat wordt geactiveerd door ecdyson een steroid hormoon, die op de ecdyson receptor B1 7 en is afhankelijk van de activiteit van de ubiquitine-proteasoom-systeem 6. Onze methode van ex vivo kweken kan be gebruikt om verder te ondervragen het mechanisme van ontwikkeling remodeling. We hebben gevonden dat in de ex vivo cultuur instelling gamma neuronen van de MB het proces van ontwikkeling snoeien samengevat een tijdsverloop vergelijkbaar met die in vivo. Het was echter van essentieel belang om tot 1,5 uur na puparium vorming wachten voordat explanteren van het weefsel, zodat de cellen onherstelbaar te zetten voor metamorfose, dissectie van dieren bij het begin van de verpopping leidde tot weinig of geen metamorfose in cultuur. Zo, met de juiste modificatie, kan de ex vivo cultuur aanpak worden toegepast om te studeren dynamische en steady-state aspecten van de centrale hersenen biologie.

Dit artikel beschrijft een werkwijze waarbij men kunnen nabootsen<em&gt; In vivo</em&gt; Ontwikkeling van de<em&gt; Drosophila</em&gt; Paddestoel lichaam in een<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultuur-systeem.

Ex vivo kweken van Whole, Het ontwikkelen van Drosophila Brains

Wij beschrijven een methode voor het ex vivo kweken van volledige Drosophila-hersenen. Dit kan worden gebruikt als tegenhanger voor chronische genetische manipulaties voor ...

Het algemene doel van deze procedure is het kweken van volledige ontwikkelende drosophila-hersenen, larvenhersenen en puppale hersenen in een ex vivo setting. Dit wordt bereikt door eerst drosophila, larven en pupae in het juiste stadium te identificeren. Vervolgens worden de hersenen snel gedissecteerd.Vervolgens worden de hersenen gedurende de vereiste periode gekweekt bij 25 °C. Ten slotte worden de gekweekte hersenen gefixeerd, gekleurd, gemonteerd en afgebeeld. Uiteindelijk tonen de resultaten aan dat het mogelijk is om de in vivo ontwikkeling van het oph-paddenstoellichaam na te bootsen via een ex vivo kweektechniek.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat we nu in vivo fenotypes in het mushroom body van Drosophila kunnen nabootsen in een ex vivo kweekomgeving, wat een analyse met hoge resolutie van de dynamiek van het ontwikkelingsproces mogelijk maakt om larvale hersenen te kweken. Voeg na het bereiden van vers, compleet medium met insuline en act Dyson 500 µL toe aan een 12 mm cellenkweekschaal met insert voor drugbehandeling. Bereid compleet medium voor met elk 100 µM Rosco battin en oli moin.Voeg met een kleine spatel een kl

ex-vivo-culturing-of-whole-developing-drosophila-brains

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Deze video toont de bereiding van primaire neuronale culturen uit de hersenen van laat stadium Drosophila poppen. Standpunten van levende culturen tonen neurietuitgroei en beeldvorming van calcium niveaus met behulp van Fura-2.

Primaire neuronale culturen uit de hersenen van laat stadium Drosophila Poppen

Deze video toont de procedure voor het isoleren van hele hersenen van volwassen Drosophila als voorbereiding voor het opnemen van enkele neuronen met behulp van standaard hele cel-technologie. Het bevat beelden van GFP gelabelde cellen en neuronen bekeken tijdens het opnemen.

Hele Cell Opnamen van Brain van Adult Drosophila

De voorbereiding van de ontwikkeling en Adult Drosophila Hersenen en retinae voor Live Imaging

Beschrijven we de procedure voor te bereiden...

Visualisatie van de embryonale zenuwstelsel in zijn geheel-mount Drosophila Embryo&#39;s

This video demonstrates a protocol to identify exogenous factors that initiate the reactivation of Drosophila brain neural stem cells from their quiescent state. Freshly hatched larvae are dissected to isolate their brains, which are then cultured in media with or without a test hormone to evaluate the hormone's potential to induce neural stem cell reactivation and proliferation.

Analyzing Neural Stem Cell Reactivation in Cultured Drosophila Brain Explants

Source: Ishimoto, H. et. al., Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila. J. Vis. Exp. (2018) This video demonstrates calcium imaging to study Drosophila brain responses to neuropeptides. Neurons expressing a fluorescent calcium indicator reveal intracellular calcium dynamics and functional responses to signaling molecules.

Ex Vivo Calcium Imaging to Study Drosophila Brain Responses to Neuropeptides

Dit protocol Gegevens een gestroomlijnde methode voor live cell imaging uitvoeren in het kader van een intact larvale hersenen. Live cell imaging benaderingen zijn van onschatbare waarde voor de studie van asymmetrische neurale stamcellen divisies evenals andere neurogene en ontwikkelingsprocessen, consequent blootleggen van mechanismen die eerder over het hoofd gezien.

Live-Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale neuroblasts

De volwassen Drosophila hersenen waardevol voor de studie van neuronale circuits, hogere hersenfuncties, en complexe aandoeningen. Een efficiënte methode om hele hersenweefsel van de kleine vlieg hoofd ontleden zal brain-based studies vergemakkelijken. Hier beschrijven we een eenvoudige, een-stap dissectie protocol van volwassen hersenen met goed bewaard gebleven morfologie.

Een eenvoudige één stap Dissection protocol voor Whole-mount voorbereiding van Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

Het doel van dit protocol is om de ex vivo Drosophila larvale hersenen cultuur, geoptimaliseerd voor het controleren van de circadiane moleculaire ritmes met langdurige fluorescentie time-lapse beeldvorming. De toepassing van deze methode op farmacologische testen wordt ook besproken.

Eencellige resolutie fluorescentie leven beeldvorming van Drosophila circadiane klokken in larvale hersenen cultuur

Dit witboek beschrijft een protocol voor ex vivo calcium beeldvorming van de hersenen van Drosophila . Bij deze methode, kunnen natuurlijke of synthetische verbindingen worden toegepast op de buffer voor het testen van hun vermogen om bepaalde neuronen in de hersenen activeren.

Ex Vivo Calcium Imaging voor het visualiseren van hersenen reacties op endocriene signalering in Drosophila

Er is een methode vastgesteld om rustige neurale stamcellen in gekweekte Drosophila-hersenexplantaten te reactiveren. Met behulp van deze methode kan de rol van systemische signalen worden losgekoppeld van weefselintrinsieke signalen in de regulatie van neurale stamcelrust, in- en uitgang.

Neurale stamcelreactivatie in gekweekte Drosophila-hersenexplantaten

Leer ex vivo kweken van ontwikkelende Drosophila-hersenen voor neurowetenschappelijk onderzoek. Deze methode bootst in vivo ontwikkeling van de mushroom body na en maakt gedetailleerde analyse van dynamische ontwikkelingsprocessen mogelijk.

Ex vivo kweken van Whole, Het ontwikkelen van Drosophila Brains

Meer video's verkennen