Name: Progenitor afgeleide oligodendrocyt Cultuur System van menselijke foetale hersenen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-20T11:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 26 s
Description: Ontdek een protocol voor het differentiëren van humane foetale neurale progenitorcellen naar oligodendrocyten zonder ondersteunende cellen. Deze methode genereert zuivere populaties voor onderzoek naar hersenziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd ondersteund door de Intramurale Research Program van de National Institutes of Health, NINDS. De auteurs willen graag alle leden van het Laboratorium voor Moleculaire Geneeskunde en Neuroscience, Rick Dreyfuss bedanken voor het helpen met microscopie en Pamela C. Zeven voor het helpen met de redactie.

Opmerking: routine kweken van neurale voorlopercellen en oligodendrocytic lineage cellen incubatie wordt uitgevoerd bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO2 atmosfeer. Elke 2 dagen wordt het medium vervangen met 50 tot 100% vers medium als cultuur 40-70% confluent. Op het moment van bijna confluentie worden de kweken doorgekweekt op 2-2.5e6/T75 kolf meestal wekelijks schema. 1. Voorbereiden van de Coated Flask <ol><li> Te bereiden beklede flessen 5 mg van poly-D-lysine (PDL) verdund in 100 ml gedeïoniseerd water (DI-water), smeer T75 flessen met 50 ug / ml van PDL bij kamertemperatuur (RT) in het donker. Na 1 ½ uur, zuigen de PDL en een keer spoel de kolven met DI-water. Laat de kolven drogen voordat enten van de cellen (tabel 1). </li></ol> 2. Vanaf Differentiatie van neurale progenitor cellen in Progenitor afgeleide Oligodendrocyten (BOB) Het protocol isolate menselijke CNS progenitorcellen beschreven in een eerdere publicatie en is geen onderdeel van dit protocol 1. Menselijke CNS progenitor cellen werden geïsoleerd uit de grote hersenen van een 8-week zwangerschap foetale hersenen, verkregen volgens NIH richtlijnen. <ol><li> Groeien multipotentiële populatie van neurale progenitorcellen op PDL beklede flessen in neurobasal medium aangevuld met 25 ng / ml bFGF en 20 ng / ml epidermale groeifactor (EGF) (Figuur 1A). Gebruik ze niet als hoger dan passage 11 (p11). </li><li> Beginnen de neurale stamcellen differentiëren wanneer de cultuur ongeveer 70% confluent. </li><li> Maak volledige differentiatie van oligodendrocyten medium met serum-vrij DMEM / HAMS F12 01:01 medium aangevuld met bovine serum albumine, L-glutamine, gentamicine, N2 componenten, T3, Shh, NT-3, bFGF en PDGF-AA (Tabel 1) . Dit medium wordt gedefinieerd als oligo medium met groeifactoren (oligo medium + GF). </li><li> Verwijder Progenitor media uit de kolven, eenmaal spoelen cellen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en oligo medium toe + GF (details beschreven in 2.3) tot oligodendrocyten differentiatie starten. Alleen cellen betrokken bij de oligodendrocytic lijn zal groeien (Figuur 1B). Cultuur de cellen in dit medium 3 weken. </li><li> Elke week, wanneer de cellen bij 90-95% confluentie passage met behulp trypsine (0,05%)-EDTA (0,1%) (4 ml voor een T75 kolf). Breng de hele medium van de cellen die moeten worden gepasseerd in een 50 ml conische buis, dit geconditioneerde medium wordt gebruikt om de trypsine te blussen. Zorg ervoor dat niet om uitdrogen van de cellen. Voeg dan trypsine. </li><li> Incubeer cellen in trypsine gedurende 5 min bij kamertemperatuur voorzichtig tikken de kolf meerdere malen cel onthechting helpen. </li><li> Quench de trypsine door het toevoegen van 4-5 ml van geconditioneerd medium aan de kolf met de vrijstaande cellen. </li><li> Breng het medium en de cellen dezelfde 50 ml conische buis. Centrifugeer het medium en de cellen bij 1200 rpm (~300 g) gedurende 5 min bij RT. </li><li> Zuig het supernatant, resuspendeer de celpellet voorzichtig kantelen van de buis en voeg verse oligo medium + GF. Voorzichtig pipet medium en cellen op en neer om een ​​uniforme celsuspensie te maken. </li><li> Tel de cellen en overdracht 2.5e6 in elke nieuwe PDL-coated T75 kolf. </li></ol> 3. Laatste stap in de differentiatie van oligodendrocyten <ol><li> Na 3 weken kweken in medium oligo + GF, wanneer de cellen bij 70-80% confluentie, start het uiteindelijke proces van differentiatie (figuur 1C). </li><li> Bereid medium op dezelfde wijze als de oligo medium + GF maar zonder toevoeging van de vier GF: Shh, NT-3, bFGF en PDGF-AA. Dit medium zonder de vier GF zal worden gedefinieerd als oligo medium - GF. </li><li> Zuig het medium oligo + GF uit de kolf eenmaal spoelen met PBS en dan een totaal volume van 16 ml medium, waarvan ¾ (12 ml) is oligo medium - GF en ¼ (4 ml) is PDN geconditioneerd medium, voor 6-10 Dagen). Het gebruik van geconditioneerde medium van PDN is niet kritisch voor het differentiatieproces of het overleven van de cellen. We in feite opgemerkt dat alleen direct contact van PDO met PDN cellen in co-cultuur experimenten effect van de lengte van de BOB overleving hadden. De overlevingstijd in oligo medium - GF kan worden verlengd tot twee of drie weken de PDO cellen samen gekweekt met cellen PDN. Het protocol voor de menselijke neurale stamcellen differentiëren in PDN wordt beschreven in een eerdere publicatie en het maakt geen deel uit van dit protocol 1. Groeifactor terugtrekking uit het kweekmedium resultaten geleidelijk gedifferentieerde kweken van cellen met meerdere processen (Figuur 1D). </li></ol> 4. Flow Cytometry Assay De flowcytometrie test vergelijkt de overname van oligodendrocyt markers tijdens de differentiatie proces in relatie met die van hun ouders bevolking. <ol><li> Gebruik neurale progenitors als controle. Seed PDO cellen op 2.5x10 6 cellen in twee T75 kolven bekleed met poly-D-lysine in oligo medium + GF. </li><li> Een week later, vervang medium met verse oligo medium + GF in flessen als controle cultuur voor levensvatbaarheid van de cellen, terwijl andere kolven had oligo medium - GF. </li><li> Om PDO cellen dissociëren in beide media gebruikt 20 U / ml papaïne en niet trypsine. Dit komt omdat papaïne een zachter effect op de cellen tijdens de dissociatie behoud van de cellulaire morfologie. </li><li> Voeg 5 ml Balanced Salt Solution Earle&#39;s (EBSS) een papaïne flesje. Plaats het flesje bij 37 ° C gedurende 10 minuten of totdat de papaïne volledig opgelost en de oplossing wordt helder. Dit is de papaïne oplossing gebruikt om de cellen te scheiden. </li><li> Voeg 0,5 ml van EBSS een desoxyribonuclease I (DNase) flacon (tabel 1). Meng voorzichtig. Voeg 0,25 ml van deze oplossing aan de flacon van opgeloste papaïne. Dit preparaat bevat een eindconcentratie van ongeveer 20 U / ml papaïne en 00,005% DNase. </li><li> Place papaïne oplossing (zoals hierboven beschreven) op de cellen en incubeer bij 37 ° C gedurende 15-30 min, volgen het losmaken van de cellen met behulp van een microscoop. Stop de reactie met 5 ml medium met of zonder GF en centrifugeer bij 1200 rpm gedurende 7 minuten. </li><li> Transfercel pellets van beide kolven in twee verschillende 5 ml polypropyleenbuisjes en wassen met normale fysiologische medium (NPM: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 10 mM Hepes en 10 mM glucose) aangevuld met 1 mg / ml runderserumalbumine (BSA + NPM). </li><li> Voer oppervlak immunokleuring bij 4 ° C gedurende 20 min met specifieke en adequate getitreerd primaire antilichamen voor A2B5, O4, GalC (tabel 2). </li><li> Was de cellen met NPM + BSA bij 4 ° C gedurende 5 min en incubeer met specifieke secundaire antilichamen bij 4 ° C gedurende 20 min (tabel 2). </li><li> Om intracellulaire antigenen waaronder nestine, gliale fibrillaire zure eiwit (GFAP), klasse III &amp; zijn vlekkenta,-tubuline en myeline basisch eiwit (MBP) (Tabel 2), vast cellen in 2% paraformaldehyde (PFA) gedurende 20 min bij kamertemperatuur en doorlaatbaar met koude 70% ethanol gedurende 15 min bij -20 ° C. </li><li> Was de cellen met 1x PBS en incubeer met specifieke secundaire antilichamen (Tabel 2). </li><li> Tussen intacte cellen en subcellulaire afval discrimineren tijdens flowcytometrieanalyse, vlek cellen met 4,6-diamidino-2-phenyllindole, dihydrochloride (DAPI) (Life Technologies, Grand Island, NY). </li><li> In het bovenstaande protocol optimaliseren, voerden we alle geschikte controle-experimenten om de specificiteit van elke immunoreagent bevestigen. Kort voor het direct gelabelde antilichamen, de juiste negatieve controle was een direct geconjugeerd antilichaam van hetzelfde isotype immunoglobuline klasse (of subklasse) en fluorochroom conjugaat als het primaire antilichaam (de isotype controle). Voor indirecte immunokleuring van primaire antilichamen, de juiste negatieve controle wals het secundaire antilichaam geconjugeerd aan het fluorochroom plaats die specifiek de immunoglobuline klasse (of subklasse) bij de gastheer waarin het primaire antilichaam werd gegenereerd gericht. Als primaire antilichamen van meerdere hosts (muis, konijn, kip) samen werden gebruikt, gebruikten we het secundaire antilichaam gericht het primaire antilichaam van elke host en elk secundair antilichaam gebruikt werd kenmerkend cross-geadsorbeerd tegen de Immunoglobulinen van de andere gastheren cross-minimaliseren hosten immunoreactiviteit. De positieve controles opgenomen direct of indirect immunokleuring van celpreparaten waarover de antigenen van interesse met behulp van directe of indirecte afweerreacties met de primaire antilichamen specifiek voor deze antigenen. De bovenstaande optimaliseringsmethoden uitgevoerd eenmaal voor elk type immunokleuring experimenten. Afweerreacties controle toonde geen significante cross-epitoop immunoreactiviteit tussen primaire en secundaire antilichamen. Flowcytometrie werd uitgevoerd op uniformeopgeschort fluorescent gelabelde cellen door een FACVantage SE cell sorter (BD Biosciences, San Jose, CA) uitgerust met drie lasers die golflengten afgestemd 488 nm, 647 nm verschaffen en een brede UV (351-364 nm) (figuur 2) . </li></ol> 5. Immunofluorescentietest Opmerking: Voor immunofluorescentie experimenten, BOB worden uitgeplaat in oligo medium + GF of oligo medium - GF op 2.5e5 in 6 well platen bekleed met PDL. De cellen gefixeerd in 2% PFA op verschillende tijdstippen na intrekking van groeifactoren. Het antilichaam vlek wordt uitgevoerd op plastic 6 well platen in plaats van dekglaasjes. <ol><li> Verwijder het afdrukmateriaal en voeg de 2% PFA. Incubeer gedurende 10 min bij RT. Gooi PFA. Was de cellen drie keer met PBS, 5 min per keer. Wees voorzichtig niet om uitdrogen van de cellen. </li><li> Permeabiliseren cellen voor intracellulaire markers van 0,25% triton oplossing in PBS gedurende 10 minuten bij RT. </li><li> Om niet-specifieke binding, blok cellen te voorkomen fof 10 min met HHG (1 mM HEPES buffer, 2% paardenserum en 10% geitenserum in Hanks gebalanceerde zoutoplossing). Verdun specifieke primaire antilichamen (Tabel 2) een vooraf bepaalde concentratie in HHG. Plaats verdunde antilichamen op cellen. Incubeer 1 uur bij kamertemperatuur op de shaker of bij 4 ° C overnacht. </li><li> Was de cellen drie keer met PBS, gedurende 5 minuten elke keer. Verdun geschikte secundaire antilichamen (Tabel 2) gekoppeld aan een fluorochroom een vooraf bepaalde concentratie in HHG. Plaats het mengsel van verdunde secundaire antilichamen op cellen. Incubate 1 uur bij kamertemperatuur op een schudder in het donker. </li><li> Was de cellen drie keer met PBS, gedurende 5 minuten elke keer. </li><li> Om te voorkomen dat fotobleken voeg 10 ul van Verleng Gold met DAPI aan de cellen en plaatst u een glas dekglaasje op de top van hen. Visualiseren gemerkte cellen met een Axiovert 200M fluorescentiemicroscoop (Zeiss, Thornwood, NY) (figuur 3). </li></ol>

<ol><li>Messam, C. A., Hou, J., Gronostajski, R. M., Major, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+pathway+of+human+brain+progenitor+cells+identified+by+JC+virus+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Lineage pathway of human brain progenitor cells identified by JC virus susceptibility.</a> Ann. Neurol. 53, 636-646 (2003).</li>
<li>Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((bFGF+regulates+the+proliferative+fate+of+unipotent+%28neuronal%29+and+bipotent+%28neuronal%2Fastroglial%29+EGF-generated+CNS+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells.</a> Neuron. 11, 951-966 (1993).</li>
<li>Johe, K. K., Hazel, T. G., Muller, T., Dugich-Djordjevic, M. M., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+factors+direct+the+differentiation+of+stem+cells+from+the+fetal+and+adult+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Single factors direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous system.</a> Genes Dev. 10, 3129-3140 (1996).</li>
<li>McKay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stem cells in the central nervous system.</a> Science. 276, 66-71 (1997).</li>
<li>Belachew, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+NG2+proteoglycan-expressing+progenitor+cells+are+intrinsically+multipotent+and+generate+functional+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Postnatal NG2 proteoglycan-expressing progenitor cells are intrinsically multipotent and generate functional neurons.</a> J. Cell Biol. 161, 169-186 (2003).</li>
<li>Almazan, G., McKay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oligodendrocyte+precursor+cell+line+from+rat+optic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">An oligodendrocyte precursor cell line from rat optic nerve.</a> Brain Res. 579, 234-245 (1992).</li>
<li>Filipovic, R., Zecevic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+role+of+minocycline+in+co-cultures+of+human+fetal+neurons+and+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective role of minocycline in co-cultures of human fetal neurons and microglia.</a> Exp. Neurol. 211, 41-51 (2008).</li>
<li>Goldman, S. A., Natesan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+niche-defying+feat%3A+induced+oligoneogenesis+in+the+adult+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A niche-defying feat: induced oligoneogenesis in the adult dentate gyrus.</a> Cell Stem Cell. 3, 125-126 (2008).</li>
<li>Nunes, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+isolation+of+multipotential+neural+progenitor+cells+from+the+subcortical+white+matter+of+the+adult+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain.</a> Nat. Med. 9, 439-447 (2003).</li>
<li>Lyssiotis, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+histone+deacetylase+activity+induces+developmental+plasticity+in+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Inhibition of histone deacetylase activity induces developmental plasticity in oligodendrocyte precursor cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 14982-14987 (2007).</li>
<li>Sim, F. J., Goldman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((White+matter+progenitor+cells+reside+in+an+oligodendrogenic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Ernst+Schering+Res.+Found+Workshop%22%5BJournal%5D)">White matter progenitor cells reside in an oligodendrogenic niche.</a> Ernst Schering Res. Found Workshop. , 61-81 (2005).</li>
<li>Raff, M. C., Miller, R. H., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glial+progenitor+cell+that+develops+in+vitro+into+an+astrocyte+or+an+oligodendrocyte+depending+on+culture+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium.</a> Nature. 303, 390-396 (1983).</li>
<li>Windrem, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+cells+derived+from+the+adult+human+subcortical+white+matter+disperse+and+differentiate+as+oligodendrocytes+within+demyelinated+lesions+of+the+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Progenitor cells derived from the adult human subcortical white matter disperse and differentiate as oligodendrocytes within demyelinated lesions of the rat brain.</a> J. Neurosci. Res. 69, 966-975 (2002).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nat. Protoc. 2, 1044-1051 (2007).</li>
<li>Armstrong, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+immature+oligodendrocyte+lineage+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells.</a> Methods. 16, 282-292 (1998).</li>
<li>Hu, B. Y., Du, Z. W., Li, X. J., Ayala, M., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+oligodendrocytes+from+embryonic+stem+cells%3A+conserved+SHH+signaling+networks+and+divergent+FGF+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Human oligodendrocytes from embryonic stem cells: conserved SHH signaling networks and divergent FGF effects.</a> Development. 136, 1443-1452 (2009).</li>
<li>Gard, A. L., Williams, W. C. 2nd, Burrell, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendroblasts+distinguished+from+O-2A+glial+progenitors+by+surface+phenotype+%28O4%2BGalC-%29+and+response+to+cytokines+using+signal+transducer+LIFR+beta%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Oligodendroblasts distinguished from O-2A glial progenitors by surface phenotype (O4+GalC-) and response to cytokines using signal transducer LIFR beta.</a> Dev. Biol. 167, 596-608 (1995).</li>
<li>Hu, B. Y., Du, Z. W., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+oligodendrocytes+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human oligodendrocytes from pluripotent stem cells.</a> Nat. Protoc. 4, 1614-1622 (2009).</li>
<li>Reubinoff, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitors+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Neural progenitors from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).</li>
<li>Pfeiffer, S. E., Warrington, A. E., Bansal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oligodendrocyte+and+its+many+cellular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The oligodendrocyte and its many cellular processes.</a> Trends Cell Biol. 3, 191-197 (1993).</li>
<li>Zhang, S. C., Ge, B., Duncan, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+human+oligodendroglial+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Tracing human oligodendroglial development in vitro.</a> J. Neurosci. Res. 59, 421-429 (2000).</li>
<li>Bradl, M., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocytes%3A+biology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocytes: biology and pathology.</a> Acta Neuropathol. 119, 37-53 (2010).</li>
<li>Chong, S. Y., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tapping+into+the+glial+reservoir%3A+cells+committed+to+remaining+uncommitted%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tapping into the glial reservoir: cells committed to remaining uncommitted.</a> J. Cell Biol. 188, 305-312 (2010).</li>
<li>Jakovcevski, I., Filipovic, R., Mo, Z., Rakic, S., Zecevic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte+development+and+the+onset+of+myelination+in+the+human+fetal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte development and the onset of myelination in the human fetal brain.</a> Front Neuroanat. 3, 5(2009).</li>
<li>Rao, R. C., Boyd, J., Padmanabhan, R., Chenoweth, J. G., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+serum-free+derivation+of+oligodendrocyte+precursors+from+neural+stem+cell-enriched+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Efficient serum-free derivation of oligodendrocyte precursors from neural stem cell-enriched cultures.</a> Stem Cells. 27, 116-125 (2009).</li>
<li>D'Intino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triiodothyronine+administration+ameliorates+the+demyelination%2Fremyelination+ratio+in+a+non-human+primate+model+of+multiple+sclerosis+by+correcting+tissue+hypothyroidism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroendocrinol%22%5BJournal%5D)">Triiodothyronine administration ameliorates the demyelination/remyelination ratio in a non-human primate model of multiple sclerosis by correcting tissue hypothyroidism.</a> J. Neuroendocrinol. 23, 778-790 (2011).</li>
<li>Cui, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fetal+oligodendrocyte+progenitor+cells+from+different+gestational+stages+exhibit+substantially+different+potential+to+myelinate%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Human fetal oligodendrocyte progenitor cells from different gestational stages exhibit substantially different potential to myelinate.</a> Stem Cells Dev. , (2012).</li>
<li>Messam, C. A., Hou, J., Major, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexpression+of+nestin+in+neural+and+glial+cells+in+the+developing+human+CNS+defined+by+a+human-specific+anti-nestin+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Coexpression of nestin in neural and glial cells in the developing human CNS defined by a human-specific anti-nestin antibody.</a> Exp. Neurol. 161, 585-596 (2000).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Dit protocol wordt beschreven hoe u foetale oligodendrocyten ontlenen primaire menselijke neurale stamcellen en karakteriseren hun fenotype met behulp van zowel flowcytometrie en immunofluorescentie kleuring. De uitbreiding en groei van neurale voorlopercellen uit foetale centrale zenuwstelsel is zeer goed beschreven 1-4. Echter, om voldoende menselijke oligodendrocyten in vitro experimenten blijft moeilijk, hoewel het mogelijk om voorlopers en gliale isoleren van volwassen menselijke witte stof <sup...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Eindconcentratie </td></tr><tr><td> DME / HAMS F12 01:01 </td><td> Omega Scientist </td><td> DM-251 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> Runderalbumine </td><td> Sigma </td><td> A9418 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Gentamicine </td><td> Kwaliteit Biologicals </td><td> 120-098-031 </td><td> 50 ug / ml </td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> Kwaliteit Biologicals </td><td> 118-084-061 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> T3 </td><td> Sigma </td><td> T2877 </td><td> 3 nM </td></tr><tr><td> N2 Componenten </td><td> Gibco BRL </td><td> 17502 </td><td> 1:100 </td></tr><tr><td> NT-3 </td><td> PeproTech Inc </td><td> 450-03 </td><td> 2 ng / ml </td></tr><tr><td> Shh </td><td> O &amp; O-systeem </td><td> 1314-SH/CF </td><td> 2 ng / ml </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> PeproTech Inc </td><td> 100-18B </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> PDGF-AA </td><td> PeproTech Inc </td><td> 100-13A </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> PDL </td><td> Sigma </td><td> P6407 </td><td> 50 ug / m </td></tr><tr><td> PFA </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 15712 </td><td> 2% </td></tr><tr><td> Trypsine </td><td> Kwaliteit Biologicals </td><td> 118-087-721 </td><td></td></tr><tr><td> Papaïne </td><td> Worthington </td><td> LK003178 </td><td> 20 U / ml </td></tr><tr><td> DNase flacons </td><td> Worthington </td><td> LK003172 </td><td> 0,005% </td></tr><tr><td> EBSS </td><td> Worthington </td><td> LK003188 </td><td></td></tr><tr><td> ProLong Gold metDAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabel 1. Reagentia. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Primaire Abs (alle bij 1 ug / ml) </td><td></td><td> Soorten Isotype </td><td> Bron </td><td> Secundaire Abs </td></tr><tr><td colspan="5"> Flow Cytometry </td></tr><tr><td> A2B5-Biotin </td><td> Muis </td><td> IgM </td><td> Gift J. Nielson </td><td> Streptavidine PETR, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> O4FITC </td><td> Muis </td><td> IgM </td><td> Geschenk van J. Nielson </td><td></td></tr><tr><td> A2B5 </td><td> Muis </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> O4 </td><td> Muis </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> GalC </td><td> Muis </td><td> IgG3 </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgG 3-PE, Zuid-Biotech, AL </td></tr><tr><td> MBP </td><td> Kip </td><td> IgY </td><td> Millipore, MA </td><td> dαck IgY-AMCA, Jackson Immu., PA </td></tr><tr><td> Nestin </td><td> Muis </td><td> IgG1 </td><td> Messam et al.. 2000 28 </td><td> gαm IgG 1-PECy5, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Konijn </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαrb IgG-PE, Jackson Immu, PA </td></tr><tr><td> βIII tubuline </td><td> Muis </td><td> IgG2 </td><td> Covance, CA </td><td> gαm IgG 2 a-PETR, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td colspan="6"> Immunocytochemie </td></tr><tr><td> βIII tubuline (1:1,500) </td><td> Muis </td><td> IgG2a </td><td> Covance, CA </td><td> gαm IgG2a-FITC, Invitrogen, CA (1:1,000) </td></tr><tr><td> GFAP (1:1,000) </td><td> Konijn </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαrb IgG-FITC, Jackson Immu, PA (1:500) </td></tr><tr><td> MBP (1:50) </td><td> Kip </td><td> IgY </td><td> Millipore, MA </td><td> dαck IgY-FITC, Jackson Immu, PA (1:100) </td></tr><tr><td> O4 (1:100) </td><td> Muis </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-AF546, Invitrogen, CA (1: 100) </td></tr><tr><td> GalC (1:10) </td><td> Konijn </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-AF750, Invitrogen, CA (1:100) </td></tr></tbody></table> . Tabel 2 Antilichamen (Abs) voor flowcytometrie en immunocytochemie assays antilichaamconjugaten: PE, fycoerythrine, PETR, fycoerythrine Texas Red, AMCA, amino-methyl-cumarine-acetaat; Cy, cyanine, FITC, fluoresceïne-isothiocyanaat Ig:. Immunoglobuline. . AF: Alexa Fluor; gαm: geit anti-muis; gαrb: geit anti-konijn; dαck: ezel anti-kip. </td></tr></tbody></table>

progenitor afgeleide oligodendrocyt cultuur system van menselijke foetale hersenen

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Differentiatie van humane neurale stamcellen in neuronale en gliale celtypen een model te bestuderen en vergelijken moleculaire regulatie van neurale cellijn ontwikkeling. In vitro expansie van neurale voorlopercellen uit foetale CZS-weefsel is goed gekarakteriseerd. Ondanks de identificatie en isolatie van gliale voorlopercellen uit volwassen menselijk subcorticale witte stof en ontwikkeling van verschillende kweekomstandigheden direct differentiatie van neurale stamcellen in myeline producerende oligodendrocyten, het verkrijgen van voldoende menselijke oligodendrocyten in vitro experimenten blijft moeilijk. Differentiatie van galactocerebroside + (GalC) en O4 + oligodendrocyt precursor of progenitorcellen (OPC) van neurale precursoren is gemeld met behulp van het tweede trimester foetale hersenen. Echter, deze cellen niet prolifereren in afwezigheid van steuncellen zoals astrocyten en neuronen en worden snel verloren tijd in cultuur. De noodzaak de een kweeksysteem te produceren cellen van de oligodendrocyten lineage geschikt voor in vitro experimenten. Kweek van primaire humane oligodendrocyten kan bijvoorbeeld een nuttig model voor de pathogenese van neurotrope ziekteverwekkers zoals het menselijk polyomavirus, JCV dat in vivo infecteert deze cellen te bestuderen. Deze gekweekte cellen kunnen ook modellen van andere demyeliniserende ziekten van het centrale zenuwstelsel (CNS). Primaire, foetale hersenen afgeleide, multipotentiële neurale progenitorcellen prolifereren in vitro terwijl de kunnen differentiëren tot neuronen (progenitor-afgeleide neuronen, PDN) en astrocyten (progenitor-afgeleide astrocyten, PDA) Dit onderzoek toont dat neurale stamcellen kunnen worden geïnduceerd om onderscheid te maken door veel van de stadia van oligodendrocytic afkomst ontwikkeling (progenitor-afgeleide oligodendrocyten, BOB). We cultuur neurale stamcellen in DMEM-F12 serumvrije media supaangevuld met basic fibroblast growth factor (bFGF), van bloedplaatjes afkomstige groeifactor (PDGF-AA), Sonic hedgehog (Shh), neurotrofische factor 3 (NT-3), N-2 en triiodothyronine (T3). De gekweekte cellen worden gepasseerd op 2.5e6 cellen per 75cm kolven ongeveer om de zeven dagen. Met deze omstandigheden is de meerderheid van de cellen in cultuur te behouden morfologie wordt gekenmerkt door een aantal processen en een automatische markers vooraf oligodendrocyt cellen, zoals A2B5 en O-4. Wanneer we de vier groeifactoren (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) verwijderen en toevoegen geconditioneerde media uit PDN, de cellen beginnen te meer processen en express markers specifiek voor oligodendrocyten differentiatie, als GalC en myeline verwerven basic protein (MBP). We fenotypische karakterisatie uitgevoerd met multicolor flowcytometrie unieke markers van oligodendrocyt identificeren.

Het is zeer belangrijk om de differentiatie starten vanaf een 70% -80% confluent neurale stamcellen kweek (Figuur 1A). Veel cellen zullen sterven na het wijzigen van het kweekmedium van stamvader tot oligo medium, omdat het voorziet in specifieke groeifactoren. Dit betekent dat de groei van neurale progenitorcellen niet gebonden aan een oligodendrocytic fenotype niet wordt ondersteund door het nieuwe medium (Figuur 1B). Incubatie in oligo medium + GF gedurende een week resulteerde in ee...

Primaire, menselijke foetale hersenen-afgeleide, multipotentiële progenitorcellen vermenigvuldigen<em&gt; In vitro</em&gt; Terwijl de kunnen differentiëren tot neuronen en astrocyten. Hieruit blijkt dat neurale stamcellen kunnen worden geïnduceerd door stadia van de oligodendrocytic lineage onderscheiden door conditionering met bepaalde groeifactoren.

Progenitor afgeleide oligodendrocyt Cultuur System van menselijke foetale hersenen

Differentiatie van humane neurale progenitorcellen tot neuronale en gliale celtypen biedt een model om de moleculaire regulatie van de ontwikkeling van neurale cellijnen te bestuderen en te vergelijken. De in vitro expansie van neurale progenitorcellen uit foetaal CZS-weefsel is goed gekarakteriseerd. Ondanks de identificatie en isolatie van gliale progenitorcellen uit adult humane subcorticale witte stof en de ontwikkeling van diverse kweekcondities om de differentiatie van foetale neurale progenitorcellen naar myeline-producerende oligodendrocyten te sturen, blijft het verkrijgen van voldoende humane oligodendrocyten voor in vitro experimenten moeilijk. De differentiatie van galactocerebroside+ (GalC) en O4+ oligodendrocyt-precursor- of progenitorcellen (OPC) uit neurale precursorcellen is gerapporteerd met gebruik van foetale hersenen uit het tweede trimester. Deze cellen prolifereren echter niet in afwezigheid van ondersteunende cellen, waaronder astrocyten en neuronen, en gaan in kweek snel verloren. Er is nog steeds behoefte aan een kweeksystem om cellen van de oligodendrocyt-lijn te produceren die geschikt zijn voor in vitro experimenten. De kweek van primaire humane oligodendrocyten zou bijvoorbeeld een nuttig model kunnen zijn om de pathogenese van neurotrope infectieuze agentia te bestuderen, zoals het humane polyomavirus, JCV, dat deze cellen in vivo infecteert. Deze gekweekte cellen zouden ook modellen kunnen bieden voor andere demyeliniserende ziekten van het centrale zenuwstelsel (CZS). Primaire, uit humane foetale hersenen afgeleide, multipotentiële neurale progenitorcellen prolifereren in vitro terwijl ze het vermogen behouden om te differentiëren tot neuronen (progenitor-afgeleide neuronen, PDN) en astrocyten (progenitor-afgeleide astrocyten, PDA). Deze studie laat zien dat neurale progenitorcellen kunnen worden geïnduceerd om te differentiëren door vele stadia van de ontwikkeling van de oligodendrocyt-lijn (progenitor-afgeleide oligodendrocyten, PDO). Wij kweken neurale progenitorcellen in serumvrij DMEM-F12 medium aangevuld met basic fibroblast growth factor (bFGF), platelet derived growth factor (PDGF-AA), Sonic hedgehog (Shh), neurotrophic factor 3 (NT-3), N-2 en trijoodthyronine (T3). De gekweekte cellen worden ongeveer elke zeven dagen gepasseerd bij 2,5e6 cellen per 75 cm² kolf. Onder deze condities behoudt de meerderheid van de cellen in kweek een morfologie die wordt gekenmerkt door weinig uitlopers en tot expressie zijnde markers van pre-oligodendrocyten, zoals A2B5 en O-4. Wanneer we de vier groeifactoren (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) verwijderen en geconditioneerd medium van PDN toevoegen, beginnen de cellen meer uitlopers te ontwikkelen en markers tot expressie te brengen die specifiek zijn voor oligodendrocyt-differentiatie, zoals GalC en myelin basic protein (MBP). We hebben fenotypische karakterisering uitgevoerd met behulp van multicolor flowcytometrie om unieke markers voor oligodendrocyten te identificeren.

Deze video demonstreert een methode voor de differentiatie van primaire neurale menselijke foetale progenitorcellen tot oligodendrocyten. Eerst worden neurale progenitorcellen gekweekt in progenitormedium tot een nagenoeg volledige confluentie. Het progenitormedium wordt vervolgens vervangen door oligodendrocytenmedium, aangevuld met groeifactoren die het differentiatieproces bevorderen. De cellen worden vervolgens gedurende drie weken gekweekt en uitgebreid.Het oligodendrocyte-medium aangevuld met groeifactoren wordt vervolgens vervangen door oligodendrocyte-medium zonder groeifactoren, en de cellen worden nog zes tot 10 dagen gekweekt totdat er fenotypische veranderingen via microscopie zichtbaar zijn. Differentiatie wordt vervolgens bevestigd met immunofluorescentiemicroscopie en flowcytometrie met behulp van antilichamen die specifiek zijn voor de oligodendrocyte-lijn. Uiteindelijk kunnen de succesvol gedifferentieerde oligodendrocyten worden gebruikt voor in vitro studies naar de biologie van oligodendrocyten en interacties met infectieuze agentia zoals het humane polyomavirus, JCV.Een van de werkelijke voordelen van de techniek die we in dit laboratorium hebben ontwikkeld, in vergelijking met wat reeds in de gepubliceerde literatuur staat, is dat oligodendrocyten in ons systeem gekweekt en gedifferentieerd kunnen worden zonder de noodzaak van ondersteunende cellen zoals astrocyten en neuronen. Een ander voordeel van ons protocol is naar onze mening dat het mogelijk maakt om een groot aantal van deze precursor-oligodendrocyten te kweken die markers zoals oh vier tot expressie brengen; deze kunnen gedurende vele weken in pathogenvrije cultuur worden gegroeid tot grote celpopulaties, terwijl hun fenotype behouden blijft. Het eindresultaat van de differentiatie levert ons een bijna zuivere populatie oligodendrocyten op.We kwamen eerst op het idee voor deze methode toen we de uitgebreide literatuur lazen over de in vitro differentiatie van oligodendrocyten in ratten- en muiscellen. Daarnaast verwijderden verschillende onderzoekers groeifactoren uit nauwe culturen om de differentiatie van de cellen te voltooien. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Alexa Bandon, een student in onze laboratoriumfaciliteit hier bij het N-I-N-D-S.Kweek ter voorbereiding op de differentiatie een multipotentiële populatie neurale progenitorcellen in met polylysine gecoate flessen in neuraal basaal medium, aangevuld met BFGF en EGF, en verwijder alle ongebruikte cellen. Start de differentiatie zodra de cultuur ongeveer 70 tot 80% confluent is. Hiervoor wordt het progenitor-medium uit de flessen geaspireerd.Spoel de cellen eenmaal met PBS en voeg vervolgens 12 milliliters oligo-medium met groeifactoren toe. Incubeer de cellen bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% koolstofdioxide. Na één week zullen de resterende cellen een smalle bipolaire morfologie vertonen.Zodra de gedifferentieerde cellen voor ten minste 70% confluent zijn, wordt het medium verwijderd en overgebracht naar een nieuwe conische buis van 50 milliliter. Bewaar het opgevangen geconditioneerde medium voor later gebruik. Voeg vervolgens snel vier milliliter 0,05%trypsine, 0,1%EDTA toe aan de cellen en incubeer deze gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Tik voorzichtig meerdere keren tegen de fles om de celdetachement te bevorderen. Stop na de incubatie de werking van de tripsin door vier tot vijf milliliter van het bewaarde geconditioneerde medium aan de fles toe te voegen. Breng vervolgens het medium en de cellen terug naar de 50 milliliter conische buis.Centrifuge vervolgens het medium en de cellen bij 310 RCF gedurende zeven minuten bij kamertemperatuur. Zodra de centrifugatie is voltooid, wordt het supernatant afgezogen. Resuspendeer de celpellet door voorzichtig tegen de buis te tikken en voeg vervolgens vers oligo-medium met groeifactoren toe.Pipette het medium en de cellen voorzichtig op en neer om een uniforme celsuspensie te maken. Tel de cellen met een hemocytometer. Breng vervolgens 2,5 miljoen cellen over naar nieuwe T 75-flasks gecoat met poly-D-lysine en plaats de cultuur in de incubator. Na drie weken, wanneer de cellen 80 tot 85% confluent zijn, wordt het oligo-medium met groeifactoren uit de flask geaspireerd.Spoel eenmaal met PBS en voeg vervolgens 12 milliliters oligo-medium zonder groeifactoren en vier milliliters ongeconditioneerd medium voor progenitor-afgeleide neuronen toe. Houd de cellen zes tot 10 dagen in dit medium, waarbij het medium om de dag wordt ververst. Onderzoek de cellen met fasecontrastmicroscopie om de differentiatie en confluëntie te beoordelen en vervang ten minste 50% van het medium na het wegnemen van de groeifactoren; de cellen zullen progressief meerdere uitlopers ontwikkelen, wat duidt op een succesvolle differentiatie van de cellen tot progenitor-afgeleide oligodendrocyten.Op dit punt kunnen de uit progenitorcellen afgeleide oligodendrocyten worden gebruikt voor flowcytometrie- of immunofluorescentie-experimenten, zoals beschreven in de volgende secties van deze video. De flowcytometrie-assay vergelijkt de acquisitie van oligodendrocyt-markers tijdens het differentieproces in relatie tot die van hun ouderpopulatie. Humane neuroprogenitorcellen worden als controles gebruikt. 2,5 miljoen uit progenitorcellen afgeleide oligodendrocyten in elk van twee T75-flesjes gecoat met poly-D-lysine in oligo-medium met groeifactoren, incubator 37 °C. Een week later wordt het medium in één flesje vervangen door vers oligo-medium met groeifactoren als controle voor de celviabiliteit.Vervang het medium in de tweede kolf door vers oligo-medium zonder groeifactoren. Kweek deze cellen tot maximaal 10 dagen; drie tot negen dagen na het verwijderen van de groeifactoren zullen de cellen meer processen gaan ontwikkelen die typisch zijn voor een oligodendrocytenfenotype. Om de uit progenitorcellen afgeleide oligodendrocyten te dissociëren, wordt het medium geaspireerd en worden 5,25 milliliter perian-oplossing aan elke kolf toegevoegd.Perian wordt in plaats van trypsine gebruikt omdat het een milder effect heeft op de cellen tijdens de dissociatie. Om de cellulaire morfologie te behouden, wordt er geïncubeerd bij 37 °C gedurende 15 tot 30 minuten. Controleer periodiek met een microscoop of de cellen loslaten.Zodra de cellen zijn losgekoppeld, voegt u vijf milliliter medium met of zonder groeifactoren toe om de reactie te stoppen. Verplaats vervolgens de inhoud van elke kolf naar een conische buis van 15 milliliter. Centrifugeer de buizen bij 310 RCF gedurende zeven minuten bij kamertemperatuur. Aspireer na de centrifugatie het supernatant en resuspendeer de celpellets in vier milliliter normaal fysiologisch medium, aangevuld met één milligram per milliliter runderserumalbumine of NPM plus BSA.Tel vervolgens de cellen zoals voorheen, en breng voor elke immuunkleuringconditie 1 miljoen cellen over in een polypropyleen buisje van vijf milliliter. Zorg ervoor dat alle passende controles worden meegenomen om de specificiteit van elk immuunreagens te bevestigen. Om vervolgens de immuunkleuring uit te voeren, worden de cellen eerst geïncubeerd met antilichamen tegen de oppervlakte-eiwitten A2B5, O4 en GalC. De cellen worden daarna gewassen om ongebonden primaire antilichamen te verwijderen en geïncubeerd met de passende fluorochroom-gelabelde secundaire antilichamen.De cellen worden vervolgens opnieuw gewassen om de secundaire antilichamen te verwijderen. Na fixatie met 2%paraldehyde en permeabilisatie met koude, 70%ethanol, worden de cellen gewassen en vervolgens geïncubeerd met antilichamen tegen nestine, gliaal fibrillair zuur eiwit, bèta-tubuline klasse drie en myelin basis proteïne om intracellulaire eiwitten te kleuren. Daarna worden de ongebonden primaire antilichamen weggewassen.De cellen worden geïncubeerd met de juiste fluorochroom-gelabelde secundaire antilichamen. Ten slotte, om tijdens de flowcytometrie-analyse onderscheid te maken tussen intacte cellen en subcellulair debris, worden de cellen behandeld met four six DIA medino. Two phenol Lind dihydrochloride of dappy. Voer de flowcytometrie uit op een instrument uitgerust met drie lasers, die excitatiegolflengten bieden afgestemd op 488 nanometers, 647 nanometers en een breed UV-spectrum. Ter voorbereiding op immunofluorescentiemicroscopie worden zes poly-D-lysine-gecoate slides geprepareerd.Zeswellplaten met 250.000 cellen van uit progenitorcellen afgeleide oligodendrocyten per well. Er zijn twee platen nodig voor elk tijdstip. Eén kweekt met groeifactoren en één zonder, wanneer de cellen 70 tot 80% confluent zijn.Zuig het medium met groeifactoren van de plaat af. Spoel één keer met PBS en voeg vervolgens 12 milliliters medium zonder groeifactoren toe. Voer vijf en negen dagen na het wegnemen van de groeifactoren immunokleuring uit als volgt: fixeer eerst de cellen met 2%PFA gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.Verwijder vervolgens de PFA en was de cellen drie keer met PBS, telkens gedurende vijf minuten. Behandel de cellen daarna met 0,25% triton en blokkeer de cellen vervolgens met 2% paardenserum en 10% geitenserum om aspecifieke binding te voorkomen. Incubeer de cellen na het blokkeren met antilichamen tegen beta drie tubuline, G-F-A-P-M-V-P oh four en gal C. Was vervolgens de ongebonden antilichamen van de cellen af en incubeer de cellen met de passende fluorochroomgelabelde secundaire antilichamen.Was de ongebonden secundaire antilichamen van de cellen af om fotobleken en vervaging te voorkomen. Monteer de celkern. De dekglasplaat met 10 µL Prolong Gold met DPI.Visualise gelabelde cellen met een fluorescentiemicroscoop en de juiste filterset om vast te stellen of humane, primaire neurale progenitorcellen kunnen differentiëren tot oligodendrocyten. Multipotente neurale progenitorcellen werden gekweekt zoals beschreven in deze video. Fenotypische veranderingen werden vervolgens gemonitord via flowcytometrie en immunofluorescentiemicroscopie.Zoals hier te zien is, drukt de meerderheid van de neurale progenitorcellen de neuro-epitheliale stamcelmarker nestine uit, terwijl slechts kleine subpopulaties lineage-beperkende markers tot expressie brengen, zoals de astrocytenmarker GFAP, de neuronale marker klasse III bèta-tubuline of de oligodendrocytenmarker OL4. Wanneer het kweekmedium werd vervangen door oligo-medium met groeifactoren en de cellen gedurende één week werden gekweekt, werd na twee weken een afname van de nestine-expressie en een toename van de A2B5-expressie waargenomen.De Nestine-expressie nam nog verder af en de expressie van de neurogliale precursor-marker A2B5 nam toe. Ook de expressie van een andere oligodendrocytenmarker, O4, nam toe twee dagen na het stopzetten van de groeifactor. De O4-expressie en de expressie van GALC, een late oligodendrocytenmarker, namen toe zes dagen na het stopzetten van de groeifactor. De co-expressie van O4 en GALC nam toe en was vergelijkbaar met de co-expressie van GALC en MBP.De multi-epitoop immuno-kleuring onthult dat 72% van de cellen in cultuur MBP tot expressie brachten. Aanvullend bewijs voor differentiatie van progenitor-afgeleide oligodendrocyten werd gekenmerkt met behulp van een immunofluorescentie-assay. Twee dagen na het weghalen van groeifactoren werd de expressie van MVP in het groen gedetecteerd.Dit nam toe op dag vijf en nam verder toe op dag negen. De lokalisatie van MVP in de gedifferentieerde oligodendrocyten is duidelijk. Samen wijzen deze gegevens erop dat humane foetale neurale progenitorcelculturen, verkregen met de beschreven methode, in staat zijn om in vitro te prolifereren terwijl ze het vermogen behouden om te differentiëren via de stadia van de oligodendrocytenlijnen.Na de ontwikkeling van dit protocol stelt de techniek onderzoekers in de vakgebieden ontwikkelingsbiologie, neurowetenschappen en virologie in staat om de biologie van het menselijk brein en ziekten die het menselijk brein beïnvloeden te onderzoeken, in het bijzonder die ziekten die resulteren in aandoeningen van de witte stof.

progenitor-derived-oligodendrocyte-culture-system-from-human-fetal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit artikel beschrijft methoden voor het afleiden van verrijkte populaties van muizen oligodendrocyt voorloper cellen (OPC's) in het primair cultuur, die een onderscheid te rijpen oligodendrocyten (OLS) te produceren. Daarnaast is dit rapport beschrijft technieken te produceren voor muriene myelinating co-culturen door zaaien muis OPC's op een bedje van neurieten muis dorsale wortel ganglion neuronen (DRGNs).

Afleiding van Verrijkt oligodendrocyt Culturen en oligodendrocyt / Neuron Myelinating co-culturen van Post-natale Murine Tissues

Dit protocol beschrijft de afleiding van gliale Beperkte Voorlopers uit foetaal ruggenmerg en onderhouden in vitro hetzij voor transplantatie of voor de studie van oligodendrocytic afstamming.

Afleiding van gliale Beperkte Voorlopers van de E13 muizen

This video demonstrates a detailed protocol for isolating the lateral ventricle walls from the adult mouse brain and performing enzymatic tissue dissociation to obtain single cells. These cells are then subjected to specific culture conditions that selectively enhance the proliferation of neural stem cells and promote their differentiation into co-cultures of oligodendrocytes and astrocytes.

Obtaining a Mixed Oligodendrocyte and Astrocyte Culture From Adult Mouse Neural Stem Cells

This video demonstrates the establishment of a co-culture of human induced neurons (iNs) and induced oligodendrocyte precursor cells (iOPCs). iNs are mixed with iOPCs in a co-culture and then incubated to support the maturation of both iNs into neurons and iOPCs into oligodendrocytes. Neurons form synaptic connections with other neurons and oligodendrocytes, while oligodendrocytes develop myelin sheaths around the neurons' axons.

A Co-culture Method to Model Neuron-Oligodendrocyte Interactions

This video demonstrates a technique for isolating and culturing oligodendrocyte precursor cells (OPCs) from the mouse pup brain cortex.

Isolating and Culturing Oligodendrocyte Precursor Cells from Mouse Pup Brain Cortex

Oligodendrocyten zijn de myeliniserende cellen van het centrale zenuwstelsel. Dit protocol beschrijft een methode voor het isoleren en kweken van hun precursoren, oligodendrocyten-voorlopercellen, uit rattencortex, evenals een snelle en betrouwbare kwantitatieve methode om oligodendrogenese in vitro te evalueren als reactie op experimentele factoren.

Voorbereiding van de Rat Oligodendrocyte Progenitor culturen en kwantificering van Oligodendrogenesis gebruik van Dual-infrarood fluorescentie Scanning

Hierin tonen we een efficiënte methode voor de zuivering van oligodendrocyten en de productie van oligodendrocyte-geconditioneerde medium dat kan worden gebruikt voor co-cultuur experimenten.

Generatie oligodendrocyten en oligodendrocyte-geconditioneerde medium voor co-cultuurexperimenten

Het gepresenteerde protocol beschrijft een methode voor een neuriet ontgroeiingstest en neurotoxiciteitsbeoordeling van kleine moleculen.

Een Neurite Outgrowth Assay and Neurotoxicity Assessment met Human Neural Progenitor Cell-Derived Neurons

De neuron-gliale interacties bij neurodegeneratie worden niet goed begrepen als gevolg van ontoereikende hulpmiddelen en methoden. Hier beschrijven we geoptimaliseerde protocollen om geïnduceerde neuronen, oligodendrocytenvoorlopercellen en oligodendrocyten te verkrijgen uit menselijke pluripotente stamcellen en geven we voorbeelden van de waarden van deze methoden bij het begrijpen van celtypespecifieke bijdragen bij de ziekte van Alzheimer.

Generatie van menselijke neuronen en oligodendrocyten uit pluripotente stamcellen voor het modelleren van neuron-oligodendrocyteninteracties

We beschrijven de productie van gemengde culturen van astrocyten en oligodendrocytenvoorlopercellen afgeleid van foetale of volwassen neurale stamcellen die differentiëren in volwassen oligodendrocyten, en in vitro modellering van schadelijke stimuli. De koppeling met een celgebaseerde high-content screeningtechniek bouwt een betrouwbaar en robuust screeningsysteem voor geneesmiddelen op.

High-Content Screening Differentiatie en Rijpingsanalyse van foetale en volwassen neurale stamcel-afgeleide oligodendrocyten precursor celculturen

We presenteren een protocol om een menselijke hersenorganoïde met residente microglia te genereren door geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC)-afgeleide hematopoëtische voorlopercellen (HPC's) op te nemen in de ontwikkeling van organoïden.

Afleiding van een organoïde van het menselijk brein met microglia-ontwikkeling

Ontdek een protocol voor het differentiëren van humane foetale neurale progenitorcellen naar oligodendrocyten zonder ondersteunende cellen. Deze methode genereert zuivere populaties voor onderzoek naar hersenziekten.

Progenitor afgeleide oligodendrocyt Cultuur System van menselijke foetale hersenen

Meer video's verkennen