Bacteriële Detection & Identification gebruiken elektrochemische sensoren
23 april 2013
We beschrijven een elektrochemische sensor bepalingsmethode voor snelle bacteriële detectie en identificatie. De bepaling omvat een sensor-array gefunctionaliseerd met DNA oligonucleotide capture probes voor ribosomaal RNA (rRNA) species-specifieke sequenties. Sandwich hybridisatie van doelwit rRNA met de invangingsprobe en een mierikswortel peroxidase-linked DNA-oligonucleotide probe detector produceert een meetbare amperometrisch stroom.
Het algemene doel van het volgende experiment is om bacteriën te detecteren en identificeren met behulp van elektrochemische sensoren. Dit wordt bereikt door eerst de ribosomale RNA uit de bacteriën vrij te maken om hybridisatie met de geflumineerde detectorprobe mogelijk te maken. Als tweede stap wordt de detectorprobe gebonden ribosomale RNA toegevoegd aan de werkelektrode, waardoor hybridisatie met de captuurprobe op het sensoroppervlak mogelijk wordt. Vervolgens wordt het anti-fluoresceïne paardenradijs peroxidase-conjugaat toegestaan om te binden aan de geflumineerde detectorprobe.
Ten slotte kan in interferentie-stroom de intensiteit, die gecorreleerd is met het aantal captuurprobe ribosomale RNA-detectorprobe complexen op het sensoroppervlak, worden verkregen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven op kweekgebaseerde methoden is dat bacteriën in ongeveer 45 minuten kunnen worden gedetecteerd en geïdentificeerd, waardoor de nachtelijke wacht wordt vermeden. Voor een bacterie om een zichtbare kolonie op een EDGAR-plaat te vormen, zou toepassing van deze techniek de beheersing van infectieziekten verbeteren.
Omdat vroege detectie van bacteriële pathogenen essentieel is voor gerichte antibioticatherapie en verbeterde klinische resultaten. Hoewel deze methode nuttig is voor de diagnose van infectieziekten, kan deze ook worden toegepast op andere diagnostische problemen zoals immunodiagnostiek. Begin door de verwijde captuurprobe 10 minuten bij kamertemperatuur met hexaan di thiol te incuberen om ervoor te zorgen dat de thiolgroep op de captuurprobe wordt gereduceerd, wat resulteert in meer consistente resultaten.
Na de incubatie, breng een stroom stikstof aan om goud te dragen. 16 sensor array chips gedurende vijf seconden om eventuele vocht of deeltjes te verwijderen, kleine hoeveelheden vloeistof moeten zorgvuldig op de werkelektrode in de sensor array worden aangebracht. Visuele demonstratie van deze techniek is van cruciaal belang.
Aangezien het goed uitvoeren van de pipetteer- en was- en droogtechnieken de variabiliteit van chip tot chip aanzienlijk vermindert. Breng vervolgens zes microliter van de HDT verwijde captuurprobe mix aan op de werkelektrode van alle 16 sensoren van de sensor array en bewaar de sensorchips in een afgedekte petrischaal bij vier graden Celsius overnacht de volgende dag, was de sensorchips met gedeïoniseerd water gedurende twee tot drie seconden en droog vervolgens de chips onder een stroom stikstof gedurende vijf seconden. Breng nu zes microliter van attri hydrochloride natriumchloride, EDTA MERCAPTOETHANOL oplossing aan op de werkelektrode van alle 16 sensoren en incubeer de sensoren gedurende 50 minuten in een petrischaal bij kamertemperatuur.
Om de monsters voor de elektrochemische sensor assay voor te bereiden. Breng een milliliter bacteriecultuur in de log fase van groei over in een microcentrifugebuis en centrifugeer vervolgens de cellen gedurende vijf minuten bij 16.000 gs. Let op dat pathogene bacteriën in een bioveiligheidskap moeten worden behandeld.
Na het verwijderen van de snat, breng een pipettepunt met 10 microliter van een molaarse natriumhydroxideoplossing aan op de bodem van de microcentrifugebuis en pipet omhoog en omlaag een paar keer om het pellet grondig te hersuspenderen. Na het incuberen van de suspensie gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, voeg 50 microliter PBS met bovien serum albumine of BSA en een fluoresceïne gemodificeerd detectorprobe toe om het bacterielysaat te neutraliseren. Incubeer vervolgens het geneutraliseerde lysaat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
Begin met dit stap door de mercaptoethanoloplossing van een van de voorbereide sensorchips met gedeïoniseerd water gedurende twee tot drie seconden te wassen. Na het drogen van de chip zoals zojuist is aangetoond, breng vier microliter van het geneutraliseerde bacterielysaat aan op de werkelektroden. 14 van de sensoren.
Breng vervolgens vier microliter van de verbindingsoligoligonucleotide in de PBS plus BSA plus fluoresceïne gemodificeerd detectorprobe aan op de twee positieve controlesensoren. Breng vervolgens na het incuberen van het lysaat en de positieve controlesensoren gedurende 15 minuten, het hele sensorchip zoals voorheen aan en droog het aan. Breng nu vier microliter anti-fluoresceïne paardenradijs peroxidase of HRP in PBS met caseïne aan op de werkelektroden van alle 16 sensoren.
Na een incubatie van 15 minuten, was en droog de sensorchip. Breng vervolgens een filmwel sticker aan op het oppervlak van de sensorchip en laad de chip in de sensorchip montage pipet 50 microliter TMB-substraat op alle 16 sensoren en sluit de sensorchip montage. Gebruik ten slotte een Helios chiplezer om pyrometrie en cyclische telemetriemetingen voor alle 16 sensoren te verkrijgen.
De zojuist beschreven elektrochemische assay is gestructureerd vergelijkbaar met een sandwich, Eliza, zoals getoond in deze figuur, wordt doelribosomale RNA hybridisatie met captuur- en detectorprobes ontwikkeld door een redoxreactie gekatalyseerd door HRP geconjugeerd aan anti-fluoresceïne antilichaamfragmenten die de drie pine fluoresceïne binding op de detectorprobe binden. Een belangrijk onderdeel van de gevoeligheid van de assay is de oppervlaktechemie van de gouden elektrode. De gouden elektrode is bedekt met mercaptoethanol en hine ol en is gefunctionaliseerd door de toevoeging van verwijde captuurprobes.
De sandwich hybridisatie van het doelribosomale RNA met de captuurprobe en de fluoresceïne gelabelde detectorprobe resulteert in een complex dat wordt gedetecteerd door toevoeging van het anti-fluoresceïne paardenradijs peroxidase-conjugaat en het TMB-substraat. De M parametrische stroom wordt gegenereerd door de redoxcyclus die het gevolg is van de oxidatie van de TMB door paardenradijs peroxidase en de reductie van de TMB door de elektronen van de elektrode. De hier gedemonstreerde assays maken gebruik van een gene fluidic 16 sensor array chip.
Elke sensor in de array bevat drie elektroden, werk-, referentie- en hulp, die contactpunten hebben aan de rand van de chip. De chiplezer heeft pogo-pins die verbinding maken met elk van de contactpunten. De chiplezer dient als een interface voor de sensorarray met een potentiometer die wordt bestuurd door een computeralgoritme.
Hier worden voorbeelden van een elektrochemische sensor stroom doorstroming getoond. De stroom doorstroming in de sensoren is kunstmatig hoog in de sensoren gedurende de eerste paar seconden nada
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een elektrochemische sensor-assaymethode voor de snelle detectie en identificatie van bacteriën. De methode maakt gebruik van een sensorarray die is gefunctionaliseerd met DNA-oligonucleotide-capturesondes die zich richten op specifieke ribosomaal RNA-sequenties.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Elektrochemie
- Microbiologie
- Sensortechnologie
Achtergrond
- Traditionele op kweek gebaseerde methoden voor bacteriële detectie kunnen meer dan 24 uur duren.
- Snelle detectietechnieken zijn essentieel voor een effectieve beheersing van infectieziekten.
- Elektrochemische sensoren vormen een veelbelovend alternatief voor snelle identificatie.
- Ribosomaal RNA is een belangrijk doelwit voor soortspecifieke detectie.
Doel van de studie
- Om een snelle assay te ontwikkelen voor bacteriële detectie met behulp van elektrochemische sensoren.
- Om de snelheid van bacteriële identificatie te verbeteren in vergelijking met conventionele methoden.
- Om ribosomaal RNA te gebruiken als target voor specifieke detectie.
Gebruikte methoden
- Vrijmaken van ribosomaal RNA uit bacteriën voor hybridisatie.
- Gebruik van een gefluoreerde detectoresonde voor binding met ribosomaal RNA.
- Hybridisatie van RNA gebonden aan de detectoresonde met vangsondes op het sensoroppervlak.
- Meting van de ampérometrische stroom om de detectie te kwantificeren.
Belangrijkste Resultaten
- De assay maakt bacteriële detectie en identificatie mogelijk in ongeveer 45 minuten.
- De amperometrische stroomintensiteit correleert met de hoeveelheid gevangen doel-RNA.
- Deze methode vermindert de tijd die nodig is voor bacteriële identificatie aanzienlijk.
- Mogelijke toepassingen omvatten een verbeterde beheersing van infectieziekten.
Conclusies
- De elektrochemische sensorassay is een snelle en effectieve methode voor de detectie van bacteriën.
- Deze techniek kan de klinische diagnostiek en het beheer van infectieziekten verbeteren.
- Toekomstige studies kunnen het bereik van detecteerbare bacteriële soorten uitbreiden.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Snelle bacteriële detectie en identificatie binnen 45 minuten pakt een kritiek knelpunt aan in het beheer van infectieziekten, waardoor tijdige therapeutische beslissingen mogelijk worden. Deze elektrochemische sensorbenadering ondersteunt doelwitvalidatie door soortspecifieke ribosomale RNA-detectie te bieden met kwantitatieve amperometrische uitlezingen. De methode verhoogt het voorspellende vertrouwen in vroege ontdekking door de afhankelijkheid van trage cultuurgebaseerde assays te verminderen en de reproduceerbaarheid van de assay over een array van 16 sensoren te verbeteren.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk via specifieke ribosomaal RNA-hybridisatie en verduidelijking van signaalpaden.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door functionele doelwitvalidatie te bieden via sandwich-hybridisatie van capture- en detectorprobes.
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen voor portefeuilletriage door kwantitatieve stroommetingen te leveren die gecorreleerd zijn met de target RNA-concentratie.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream-workflows via consistente functionalisatie van het sensoroppervlak met gedilateerde capture-probes.
- Operationele waarde: Pakt assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid aan via interne kalibratie met gebruik van bridging-oligonucleotide-controles om chip-tot-chip-variabiliteit te minimaliseren.
- Wetenschappelijke waarde: Benadrukt de screening-gereedheid en het hergebruik van het platform door parallelle verwerking van 16 sensoren op een gene-fluidic array voor betrouwbare evaluatie van verbindingen of monsters.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Bespreekt de relevantie voor ziekten door detectie van pathogenen in de urinewegen, zoals E. coli en Klebsiella, in lijn met translationele toepassingen van biomarkers.
- Operationele waarde: Beschrijft de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door het mogelijk maken van snelle meting van de fenotypische respons op antibiotica voor het bepalen van de optimale therapie.
- Wetenschappelijke waarde: Richt zich op voorspellende risicovermindering door elektrochemische uitlezingen te koppelen aan bacteriële identificatie, ter ondersteuning van beslissingen over risico-gecorrigeerde voortgang.
Integratie van Pipeline & Workflow
Positioneert de methode binnen de vroege ontdekkingsfase tot aan de identificatie van leads, ter ondersteuning van hypothesetoetsing en biologische risicoreductie via specifieke rRNA-detectie.
- Ontdekkingsbiologie: Legt uit hoe de methode hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking ondersteunt via soortspecifieke ribosomaal RNA-hybridisatie.
- Screening: Beschrijft de assay-gereedheid en reproduceerbaarheid via kwantitatieve amperometrische stroommetingen en interne kalibratiecontroles.
- Analytica: Benadrukt metingen en statistische outputs die vergelijking van condities over sensorarrays mogelijk maken, inclusief de correlatie van signaalintensiteit met de targetconcentratie.
- Translationeel onderzoek: Verbindt de methode met preklinische continuïteit door middel van fenotypische responsmetingen op antibiotica voor therapie-optimalisatie.
- Hergebruik in de praktijk: Presenteert de methode als een herbruikbare capaciteit via het 16-sensor array-chipformaat, wat parallelle assays en cross-platform standaardisatie mogelijk maakt.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid, doelwitvalidatie en vermindering van mechanistische ambiguïteit bij de detectie van bacteriën.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid door het ontwerp van sensorarrays en kalibratiecontroles.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een laat stadium dankzij snelle identificatie.
- Impact op de portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van detectietijden van 45 minuten.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in elektrochemie, moleculaire biologie en de oppervlaktechemie van sensoren voor de functionalisering van probes en de uitvoering van de assay.
- Vereist instrumentatie, waaronder een potentiostaat, een reader voor sensor-arraychips en fluïdische handlingssystemen voor een precieze toediening van reagentia.
- Vraagt om cross-team standaardisatie in probe-ontwerp, immobilisatieprotocollen en data-interpretatie tussen de groepen microbiologie en assay-ontwikkeling.
- Omvat aanpassingsoverwegingen voor verschillende bacteriële targets door het herontwerpen van de sequenties van de capture- en detectorprobes op basis van rRNA-variabiliteit.
- Omvat praktische beperkingen, zoals de noodzaak van stappen voor bacteriële lysis en RNA-vrijgave, waarvoor biosafety-insluiting vereist kan zijn voor pathogene monsters.
