Productie en gebruik van Piggy-back Multibarrel Elektroden voor

Deze procedure is gericht op de ionaforetische toediening van farmacologische agentia aan microcircuits in de hersenen, terwijl tegelijkertijd de neurale activiteit wordt geregistreerd. Trek eerst een glazen elektrode met een enkel uiteinde voor single-cell registratie en buig de punt. Trek daarnaast een glazen elektrode met meerdere uiteinden en breek de punt tot de gewenste diameter.

Ga nu over tot het assembleren van de twee elektroden. Uiteindelijk wordt de geproduceerde elektrode gebruikt voor extracellulaire in vivo registraties, waarbij indien gewenst farmacologische agentia ontisch kunnen worden toegepast om neurale microcircuits te manipuleren. Hallo, mijn naam is Dr. Achim Klu, en ons laboratorium zal u vandaag laten zien hoe u piggyback multi-barrel elektroden produceert.

Deze elektroden kunnen worden gebruikt om ionofoor neurale agonisten en antagonisten in de micro-omgeving van een neuron te brengen, en zo de neurale circuits van een neuron in vivo te manipuleren. Hallo, ik ben Dr. An Zillow. Ik ben postdoc in het lab van Dr. Ah him Crow en ik zal vandaag de procedure demonstreren. Gebruik voor een enkelkanaalselektrode een enkelkanaals glazen capillair met filament en trek de tip tot een diameter van ongeveer 1 tot 2 µm en een schaftlengte van 10 tot 12 mm.

Verifieer sporadisch de weerstand van de getrokken elektrode door deze te vullen met drie molaire natriumchloride en te testen met een standaard O-meter in 0,9% saline. Zodra de elektrode is gevuld met zoutoplossing, droogt de oplossing snel uit, waardoor de elektrode onbruikbaar wordt. Voer deze test daarom slechts incidenteel uit.

Selecteer enkele elektroden die niet zullen worden gebruikt voor de piggyback-productie. Om een volledige multi-barrel elektrode te maken, trekt u het glas tot een pipetpunt van ongeveer 10 micrometers totale diameter of minder. Een elektrode met een correct getrokken punt is cruciaal voor het succes.

Naast het feit dat de punt lang en dun moet zijn, moet deze nog steeds stevig zijn en gemakkelijk kunnen worden afgebroken tot de gewenste puntdiameter. De punt wordt in de volgende stap afgebroken tot de juiste diameter. De exacte puntgrootte is tijdens het poolproces dus minder kritisch dan de algemene vorm van de elektrodepunt, die lang en relatief dun moet zijn.

Houd nu de enkelkanaalselektrode onder een hoek van ongeveer 45 graden, met de punt naar beneden gericht, en beweeg deze relatief snel door de vlam. Zorg dat de vlam het glas smelt bij het overgangsgebied op ongeveer 10 millimeter afstand van de elektrodepunt om deze ongeveer 20 graden te buigen. Plaats de meerkanaalselektrode in een bedje boetseerklei op een objectglas en plaats deze vervolgens in de microscoopstatieven.

Diahouder Gebruik de XY-manipulatoren van de microscooptafel om de elektrodepunt voorzichtig tegen het stuk plexiglas te bewegen. Observeer het breken van de punt via de oculairs van de microscoop. De opstelling van de elektrode-assemblage wordt hier getoond.

De multi-barrel elektrode is op een glazen objectglaasje op de microscooptafel geplaatst. De single-barrel elektrode wordt vastgehouden door een handmatige multi-as manipulator, waardoor de gebruiker de single-barrel pipet met grote precisie op de multi-barrel pipet kan laten zakken. Laat de single-barrel elektrode direct in de groef van de multi-barrel elektrode zakken, die wordt gevormd door de rangschikking van de vijf barrels, zodanig dat de tip ongeveer 5 tot 10 µm voorbij de tip van de multi-barrel tip steekt.

Lijm de schachten van de twee elektroden aan elkaar met cyanoacrylaat. Begin bij de positie die het verst van de tips verwijderd is en beweeg langzaam een tandenstoker met een lijmdruppel langs de elektroschachten richting de elektrodetips. Het aanbrengen van lijm te dicht bij de elektrodetips zal de tips verstoppen en de elektrode ten minste gedeeltelijk onbruikbaar maken.

Meng een kleine hoeveelheid tandheelkundig cement. Laat dit ongeveer 15 minuten drogen. Verwijder vervolgens voorzichtig de voltooide piggyback-elektrode.

Verwijder eerst de houder van de micromanipulator en koppel deze vervolgens los van het objectglas. Bereid vlak voor het gebruik van de elektrode het terugvullen van elk vat met het desbetreffende geneesmiddel voor. Vul de vier buitenste vaten van de configuratie met vijf vaten met vier naar keuze geselecteerde geneesmiddelen en vul het middelste vat met 3 M natriumchloride als balancerend vat.

Vul vervolgens de enkelvoudige recordelektrode met drie molair natriumchloride. Zet nu de ionferesemodules aan en test alle barrels. De elektrode-testfunctie van elke pompmodule helpt bepalen of de elektrodebarrel functioneel is voor diepe hersenregistraties.

Een voltooide vijf-loops elektrode die samen met een enkele-loops registreerelektrode is geassembleerd, heeft een lange schacht van ongeveer zeven millimeter. Meerdere synaptische agonisten en antagonisten worden gewoonlijk gebruikt bij iontoforese om glycine-inhibitie te blokkeren met middelen zoals glycine-receptorantagonisten. Trick nine hydrochloride verhoogt doorgaans de vuring in neuronen.

Deze voorbeeldgegevens meten de functie van de ontladingssnelheid van auditieve neuronen ten opzichte van de intensiteit, en tonen responsen op sinusvormige geluidsstimuli van toenemende intensiteit die aan de oren van het dier zijn toegediend. Hardere geluiden resulteerden in hogere spike-snelheden vóór de toepassing van strikte negen. De snelheid-intensiteitsfunctie van de neuronen vertoont lage spike-snelheden.

Het aanbrengen van een initiële iontoforese-stroom van 15 nano amps stimuleert een lichte toename in de uitstroomstroom. Progressief hogere uitstroomstromen blokkeren progressief meer glycine-receptoren bij het neuron, wat resulteert in progressief hogere vuurfrequenties. Bij een stroom van 45 nano amps lijken alle glycine-receptoren van dat neuron te worden geblokkeerd door stricninehydrochloride.

Elke verdere verhoging van de uitstroomstroom en het vrijgeven van nog striktere hoeveelheden leidde niet tot een verdere verandering. De functiewaarde van de ontladingssnelheid van de neuronen na beëindiging van de iontoforese vertoont een volledig herstel van de neurale responsen naar de basislijn na ongeveer 25 minuten. Dit herstelproces is afhankelijk van het type en de hoeveelheid uitgestoten geneesmiddel.

Het is belangrijk om te onthouden dat het toegediende geneesmiddel zal diffunderen naar de omgeving van de registratieplaats en mogelijk ook receptoren bij naburige neuronen kan blokkeren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een registratie-elektrode kunt combineren met een multi-barrel drug-elektrode om diepe hersenregistraties met weinig ruis te verkrijgen, samen met een tijdgestuurde toediening van maximaal vier farmacologische middelen.