Met behulp van RNA-gemedieerde interferentie voerstrategie om te screenen op genen die betrokken zijn Lichaam Grootte verordening in de nematode C. elegans
13 februari 2013
We laten zien hoe u de RNAi voeden techniek te gebruiken om knock down doelwitgenen en score lichaamsgrootte fenotype in C. elegans. Deze methode kan worden gebruikt voor een grote scherm potentiële genetische componenten van belang, zoals die welke in lichaamsgrootte regulering door DBL-1/TGF-β signalering identificeren.
Deze video toont een procedure voor het identificeren van genen die de groei en lichaamsgrootte van elgan reguleren. Met behulp van RNA-interferentie of RNA-oog om kandidaatgenen in te schakelen, worden eerst platen met bacteriën voorbereid die dubbelstrengs RNA tot expressie brengen, dat de doelgenen aantast. Hermafrodieten in het vierde larvale stadium worden overgebracht naar de RNAi-platen.
Zodra ze het stadium van jonge volwassenen bereiken, worden ze overgebracht naar nieuwe RNAI-platen om eieren te leggen. Na enkele uren worden ze verwijderd, waardoor gesynchroniseerde populaties van embryo's achterblijven. In het gewenste ontwikkelingsstadium worden de nakomelingen verzameld en op dia's gemonteerd.
Ten slotte worden microscopische beelden van de wormen verkregen. Analyse van het beeld toont veranderingen in lichaamsgrootte veroorzaakt door geninactivatie. Hoewel deze methode kan worden gebruikt om regulerende factoren van de TGF beta-signaleringsroute te identificeren, kan deze ook worden toegepast op andere routes die post-embryonale ontwikkeling bij zee-elegantie reguleren, zoals de insuline-signaleringsroute.
Begin deze procedure door de doelgensequenties te klonen in vector L 4 4 4 0, een veelgebruikt worm-RNAi-plasmide. Transformeer het recombinante plasmide in de bacteriestam. HT een 15 DE drie cultuur. De getransformeerde bacteriën op LB-agarplaten met 25 microgram per milliliter carbonic en 12,5 microgram per milliliter tetracycline, neem vervolgens een enkele klon voor toekomstig gebruik.
Transformeer ondertussen de lege vector L 4 4 4 0 in de bacteriestam. HT een 15. Om als controle voor de experimenten te dienen, kweek de getransformeerde bacteriën in één milliliter LB-bouillon met 100 microgram per milliliter ampicilline overnacht bij 37 graden Celsius.
Tetracycline wordt niet toegevoegd omdat het de RNAI-efficiëntie verlaagt. Voeg nog eens vijf milliliter LB-bouillon toe met 100 microgram per milliliter ampicilline aan de overnachtelijke cultuur en incubeer vervolgens nog vier tot zes uur bij 37 graden Celsius. Zodra de cultuur klaar is, zaai 0,5 milliliter experimentele of controlebacteriën op de RNAI-wormplaten, gelabeld met de juiste klonnaam.
Voor elke voorwaarde moeten ten minste twee platen worden voorbereid. Incubeer de platen overnacht bij 37 graden Celsius. De volgende dag.
Er moet een laag bacteriën aanwezig zijn die RNAi met of zonder de doelgensequentie tot expressie brengen. De dieren zullen de bacteriën als voedselbron gebruiken. Zodra de RNAI-voedingsplaten klaar zijn, steriliseer het uiteinde van een platinadraad met een vlam.
Gebruik vervolgens de platinadraad om zes tot tien hermafrodieten in het vierde larvale stadium of L vier C elgan over te brengen naar elke RNAi-plaat. Laat de hermafrodieten overnacht bij 20 graden Celsius groeien. De volgende dag zullen de dieren jonge volwassenen zijn.
Breng ze over naar een nieuwe, geschikt gelabelde en voorbereide RNAI-plaat. Incubeer de platen bij 20 graden Celsius gedurende vier tot zes uur om de volwassenen de kans te geven eieren te leggen. Na de incubatie verwijdert u alle volwassenen van de plaat om de nakomelingen te synchroniseren.
Zodra de volwassenen zijn verwijderd, begint u met het tellen van de tijd. Dit is tijd nul. Incubeer de platen bij 20 graden Celsius om de dieren te laten groeien tot het gewenste ontwikkelingsstadium.
Hiervoor worden jonge volwassenen gekozen voor fenotypische analyse. Voor knockdowns die zich met een normale snelheid ontwikkelen, is een incubatie van 72 uur vereist. Houd er rekening mee dat verschillende genen de dierlijke ontwikkeling op verschillende manieren beïnvloeden, dus de incubatietijden moeten mogelijk worden aangepast.
Als de RNAi ervoor zorgt dat dieren met een andere snelheid groeien, kunnen jonge volwassenen worden geïdentificeerd als dieren die niet meer dan 24 uur na L vier zijn met voltooide VUL-ontwikkeling en twee tot zes embryo's in de baarmoeder, zoals hier getoond. Om andere ontwikkelingsstadia te identificeren, moet de onderzoeker de ontwikkeling van de gonaden en de VUL als richtlijn gebruiken. Zodra de dieren tot het juiste stadium zijn gegroeid, bereidt u zich voor om de lichaamsgrootte-fenotypen van de RNAi-behandelde wormen te scoren.
Plaats vervolgens twee lagen gekleurd etikettape op een glazen, één millimeter dikke monsterschuif, zoals hier getoond. Maak er twee van deze glazen schuifpjes van. Plaats vervolgens een nieuw glazen schuifpje tussen de twee schuifpjes met het tape en breng een druppel van 2% Agros gesmolten in water aan.
Druk in het midden van de nieuwe glazen schuifpje een tweede glazen schuifpje bovenop om een dunne agros-pad te maken. Zodra de agros is gestold, verwijdert u de bovenste glazen schuifpje. Schuif de schuifpjes met de agros-pad zijn klaar om wormen te laden.
Label de schuifpjes met de klonnaam. Voeg 10 microliter 25 millimolair natriumaziet toe aan de aros-pad. Gebruik vervolgens een platinadraad zoals eerder, om 30 tot 40 dieren over te brengen naar de natriumaziet-oplossing.
Om ze te immobiliseren, legt u een dekglas op de bovenkant. Doe dit voor zowel recombinante als lege L 4 4 4 0 dragende RNAi-behandelde dieren. Plaats vervolgens de micrometer-schuif onder de dissectiescoop met een 2,5 x objectieflens.
Gebruik Q Capture of vergelijkbare software om een afbeelding van de micrometerschuif op te nemen en opslaan. Plaats vervolgens de wormen onder de scope en neem afbeeldingen. Om de lichaamslengte te meten, opent u eerst de afbeelding van de micrometerschuif in Image Pro-software.
Klik vervolgens op meten en kies kalibratiekalibratie. Kies vervolgens de ruimtelijke kalibratiewizzard met geselecteerd de actieve afbeelding kalibreren. Klik op volgende.
Voer de naam in voor de kalibratie en zorg ervoor dat de ruimtelijke referentie-eenheden zijn ingesteld op micrometer. Schakel vervolgens de
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze video demonstreert een procedure voor het gebruik van RNA-interferentie (RNAi) om genen te identificeren die groei en lichaamsgrootte reguleren in C. elegans. De methode maakt grootschalige screening mogelijk om genetische componenten te ontdekken die betrokken zijn bij lichaamsgrootte regulatie via DBL-1/TGF-β-signalering.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Genetica
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- C. elegans is een modelorganisme voor het bestuderen van genetische regulatie.
- RNA-interferentie is een krachtig hulpmiddel voor gene knockdown.
- Lichaamsgrootte regulatie wordt beïnvloed door verschillende genetische factoren.
- DBL-1/TGF-β-signalering speelt een rol in groei en ontwikkeling.
Doel van het onderzoek
- Om de RNAi-voedingstechniek te demonstreren.
- Om genen te identificeren die de lichaamsgrootte in C. elegans beïnvloeden.
- Om grootschalige genetische screening mogelijk te maken.
Gebruikte methoden
- Bereiding van RNAi-platen met bacteriën die dubbelstrengs RNA tot expressie brengen.
- Overbrengen van hermafrodiets in het vierde larvale stadium naar RNAi-platen.
- Verzameling van gesynchroniseerde populaties embryo's na eierlegging.
- Plaatsen van nakomelingen op glijmiddel voor observatie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle knockdown van doelgenen met behulp van RNAi.
- Observatie van lichaamsgrootte-fenotypen in C. elegans.
- Identificatie van potentiële genetische componenten betrokken bij groei-regulatie.
- Demonstratie van de effectiviteit van RNAi in een ontwikkelingscontext.
Conclusies
- De RNAi-voedingstechniek is effectief voor gene knockdown in C. elegans.
- Deze methode kan worden gebruikt voor grootschalige genetische screening.
- De bevindingen dragen bij aan het begrijpen van de genetische regulatie van lichaamsgrootte.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This RNAi feeding strategy enables scalable, cost-effective screening for genes regulating body size in C. elegans, supporting target validation in developmental pathways. By linking phenotypic readouts to TGF-β signaling, it provides mechanistic de-risking for early discovery programs focused on growth regulation. The method’s reproducibility and minimal equipment needs make it suitable for academic-industrial collaboration in preclinical target identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by knocking down candidate genes to assess body size phenotypes.
- Operational Value: Uses RNAi hypersensitive strains like rrf-3 to enhance knockdown sensitivity and reduce false negatives.
- Predictive Value: Identifies TGF-β pathway components such as sma-3 and sma-6, supporting target confidence in growth regulation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces synchronized worm populations for consistent developmental staging and phenotypic scoring.
- Quantitative Output: Enables body length measurement via microscopy and image analysis, generating continuous data for statistical comparison.
- Scalability: Compatible with multi-well formats and bacterial feeding systems for medium-throughput screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Aligns with conserved TGF-β signaling pathways implicated in fibrosis, oncology, and metabolic disorders.
- Translational Continuity: Supports progression from target hit to preclinical validation by confirming phenotypic impact in a whole-organism context.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables go/no-go decisions based on body size penetrance and expressivity across genetic backgrounds.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification, where genetic hits are prioritized for pathway validation and mechanistic follow-up.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of gene function in body size regulation through loss-of-function phenotyping.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative body size readouts essential for assay standardization and hit confirmation.
- Analytics: Generates length measurements analyzed via mean, standard deviation, and Student’s T-test to evaluate statistical significance.
- Translational Research: Connects to preclinical work by validating hits in conserved pathways like TGF-β, which have mammalian orthologs.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable RNAi feeding platform applicable to other phenotypes such as motility, lifespan, or stress resistance.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking gene knockdown to defined phenotypic outcomes in a genetically tractable model.
- Operational Value: Standardizes worm handling, RNAi feeding, and imaging protocols across users and laboratories.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early-stage target triage using low-cost, high-information-content assays.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on phenotypic strength and pathway relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in C. elegans handling, RNAi techniques, and microscopic imaging.
- Depends on bacterial culture systems, RNAi plasmids, and temperature-controlled incubators.
- Necessitates standardization of worm staging, feeding duration, and phenotypic scoring across teams.
- Must account for variable RNAi efficiency across genetic backgrounds, as seen in lin-36 and rrf-3 strains.
- Limited to phenotypes observable in whole worms; not suitable for subcellular or biochemical readouts without adaptation.
