Name: Met behulp van RNA-gemedieerde interferentie voerstrategie om te screenen op genen die betrokken zijn Lichaam Grootte verordening in de nematode C. elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Leer de RNAi-voedingsmethode om genen te identificeren die lichaamsgrootte reguleren in C. elegans. Deze techniek maakt grootschalige screening mogelijk voor ontwikkelingsbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken James Clark voor het verstrekken van gegevens van dieren bij verschillende ontwikkelingsstadia tijdstippen. C. elegans stammen in deze studie werden verkregen van het Caenorhabditis Genetics Center, die wordt ondersteund door de NIH National Center for Research Resources (NCRR). Dit werk werd ondersteund door CIRG 1817 van CUNY naar JL en CSD, en door NIH 1R15GM073678-01 en 1R15GM097692-01 tot CSD Wij danken dr. William J Rice, Dr Nathalia Holtzman, en Melissa Silvestrini voor commentaar op het manuscript. Dit werk werd uitgevoerd in gedeeltelijke vervulling van de vereisten voor een PhD-graad van de Graduate Center van de City University van New York (S. Xiong).

1. Het voorbereiden van RNAi voeden Platen uitvoeren Target gensequentie <ol><li> Bij gebruik van in de handel verkrijgbare RNAi bibliotheken (bijv. vanuit de Bron BioScience LifeSciences), ga dan verder met stap 1.4. U kunt ook klonen target-gen-sequenties in vector L4440, een veelgebruikte worm RNAi plasmide 8, door standaard klonen protocol. </li><li> Transformeren het recombinant plasmide in bacteriële stam HT115 (DE3) kweken ervan op LB-agarplaten met 25 mg / ml carbenicilline en 12,5 pg / ml tetracycline en kies een enkele kloon voor toekomstig gebruik. </li><li> Ondertussen transformeren de lege vector L4440 in bacteriële stam HT115 gebruikt als controle voor de experimenten. </li><li> Cultuur zowel recombinant en lege L4440-dragende bacteriën in 1 ml LB-bouillon met 100 ug / ml ampicilline overnacht bij 37 ° C. Tetracycline is niet te wijten aan het feit dat het rendement af RNAi toegevoegd. </li><li> Voeg een 5 ml LB-bouillon met 100 ug / ml ampicilline overnacht in de culture, incubeer een 4-6 uur bij 37 ° C. </li><li> Zaad 0,5 ml recombinant of lege L4440-dragende bacteriecultuur op de RNAi worm platen. Label alle platen met kloon naam. </li><li> Markeer de platen en incubeer overnacht bij 37 ° C tot bacteriedek groeien, zijn de RNAi platen met of zonder doelgen sequentie. Minstens 2 platen moeten worden voorbereid voor elke conditie. </li></ol> 2. Cultuur Worms op de RNAi Feeding Platen <ol><li> Flame steriliseren de punt van een platina draad worm keuze. Gebruik de worm pakken op te halen zes-tien vierde larvestadium is gekomen (L4) hermafrodieten aan elk RNAi plaat die ofwel recombinant of lege L4440 bevat; zullen de dieren de bacterie te gebruiken als een bron van voedsel. </li><li> Laat hermafrodieten groeien bij 20 ° C (standaard kweekomstandigheid voor C. elegans) nacht, zullen ze jongvolwassenen de volgende dag. </li><li> Overdracht 6 tot 10 jonge volwassenen in een nieuwe navenant gelabeld en bereid RNAi plaat. </li><li> Laat devolwassenen leggen eieren voor 4-6 uur, en verwijder vervolgens alle volwassenen van de plaat, deze stap is het synchroniseren van de nakomelingen. Zodra de moeders worden verwijderd, start de tijd te tellen. Dit tijdstip nul. </li><li> Incubeer de platen bij 20 ° C te laten dieren groeien op specifieke ontwikkelingsfase, in dit protocol, kiezen we jonge volwassenen voor fenotypische analyse. Voor knockdowns die zich ontwikkelen in een normaal tempo, 72 uur incubatie is voldoende voor dieren te worden jonge volwassenen. Echter, verschillende genen beïnvloeden dierlijke ontwikkeling anders. Als RNAi veroorzaakt dieren om te groeien in een ander tempo, kunnen jonge volwassenen worden geïdentificeerd als die niet meer dan 24 uur voorbij L4 met afgerond vulva ontwikkeling en 2-6 embryo&#39;s in de baarmoeder (indien vruchtbaar). Om andere ontwikkelingsstadia te identificeren, moet de onderzoeker gonadale en vulva ontwikkeling gebruiken als een gids. </li></ol> 3. Score Lichaam Grootte fenotypen van RNAi behandeld Worms <ol><li> Worden twee lagen gekleurde label tapes op een glasplaatje. Maak twee van dese glazen dia&#39;s. Dan, plaats een nieuw glasplaatje in tussen de twee dia&#39;s met tape. Smelt 2% agarose in water, een druppel naar het centrum van de nieuwe glasplaatje, vandaar de tweede glaasje druk op de top van een dunne laag van 2% agarose zoals eerder beschreven negen maken. </li><li> Zodra agarose is gestold, verwijder de bovenste glasplaatje, de dia met agarose pad is klaar om wormen te laden. Label dia met kloon naam. </li><li> Voeg 10 ul 25 mM NaN 3 om de agarose pad; halen 30 tot 40 dieren in het NaN 3 oplossing om ze te immobiliseren, dan dekglaasje op de top; herhaling voor zowel recombinant en lege L4440-dragende RNAi-behandelde dieren. </li><li> Afbeelding van de wormen onder dissectiemicroscoop met 2.5x objectief, hier hebben we Leica digitale camera met ondersteunende software Qcapture. </li><li> Voor het kalibreren, eerst een opname van een standaard micrometer heerser. Vervolgens opent u de afbeelding in Image-Pro software, klik op &quot;maatregel&quot; en kies &quot;kalibratie&quot; en kies&quot;Ruimtelijke kalibratie wizard&quot;. Met &quot;het kalibreren van de actieve afbeelding&quot; geselecteerd, klikt u op &quot;volgende&quot;. Voer de naam voor de kalibratie en ervoor te zorgen dat de ruimtelijke referentie-eenheden zijn ingesteld op micrometer. Controleer vervolgens de &quot;een verwijzing kalibratie&quot; knop en klik op &quot;volgende&quot;. Klik op &quot;draw referentielijn.&quot; Een verwijzing schaal balk verschijnt. Plaats de schaalbalk aan de uiteinden van de micrometer overeenkomen, dan blijkt dat de verwijzing 1.000 eenheden aangeeft. Klik op &quot;OK&quot;, &quot;Volgende&quot; en &quot;Voltooien&quot;. </li><li> Zodra de software is gekalibreerd, opent een worm beeld. Selecteer vervolgens onder de &quot;maatregel&quot; menu, selecteer &quot;kalibratie&quot; en klik vervolgens op &quot;select ruimtelijke&quot;. In het pull down menu, selecteer de bestandsnaam gemaakt voor de micrometer kalibratie. Vervolgens onder de &quot;maatregel&quot; menu, selecteer &quot;metingen.&quot; In het venster dat opent, selecteert u de gratis-draw tool en trek een lijn door het midden van het dierlijk lichaam van kop tot staart met computermuis (figuur 1). De lengte zal worden gerapporteerd in het venster. Nuje hebt twee groepen gegevens: lichaamslengte van dieren die zijn behandeld met target-gen RNAi en controle dieren behandeld met lege L4440 vector. </li><li> Exporteer de lengte metingen naar een Microsoft Excel-bestand, of een andere geschikte statistische software. Analyseren van de gegevens door het berekenen van het gemiddelde en standaardafwijking voor elk monster. Vergelijk monsters met Student&#39;s t-test. </li></ol>

<ol><li>Melnyk, C. W., Molnar, A., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+and+systemic+movement+of+RNA+silencing+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals.</a> Embo J. 30, 3553-3563 (2011).</li>
<li>Wall, N. R., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNA%3A+can+RNA+interference+be+exploited+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Small RNA: can RNA interference be exploited for therapy.</a> Lancet. 362, 1401-1403 (2003).</li>
<li>Kalantidis, K., Schumacher, H. T., Alexiadis, T., Helm, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+silencing+movement+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">RNA silencing movement in plants.</a> Biol. Cell. 100, 13-26 (2008).</li>
<li>Shim, M. S., Kwon, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+targeted+delivery+of+siRNA+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Febs.+J%22%5BJournal%5D)">Efficient and targeted delivery of siRNA in vivo.</a> Febs. J. 277, 4814-4827 (2010).</li>
<li>Amarzguioui, M., Rossi, J. J., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+for+chemically+synthesized+siRNA+and+vector-mediated+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi.</a> FEBS Lett. 579, 5974-5981 (2005).</li>
<li>Kamath, R. S., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30, 313-321 (2003).</li>
<li>Savage-Dunn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screen+for+small+body+size+mutants+in+C.+elegans+reveals+many+TGFb+pathway+components%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFb pathway components.</a> Genesis. 35, 239-247 (2003).</li>
<li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+interference+by+ingested+dsRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854(1998).</li>
<li>Sulston, J. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-embryonic+cell+lineages+of+the+nematode%2C+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).</li>
<li>Wang, J., Tokarz, R., Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+TGF%CE%B2+signal+transducers+in+the+hypodermis+regulates+body+size+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The expression of TGFβ signal transducers in the hypodermis regulates body size in C. elegans.</a> Development. 129, 4989-4998 (2002).</li>
<li>Liang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+schnurri+homolog+sma-9+mediates+stage-+and+cell+type-specific+responses+to+DBL-1+BMP-related+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling.</a> Development. 130, 6453-6464 (2003).</li>
<li>Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">TGF-β signaling.</a> WormBook. , 1-12 (2005).</li>
<li>Simmer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+putative+RNA-directed+RNA+polymerase+RRF-3+makes+C.+elegans+hypersensitive+to+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi.</a> Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+misexpression+of+germline+P+granules+and+enhanced+RNA+interference+in+retinoblastoma+pathway+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants.</a> Nature. 436, 593-597 (2005).</li>
<li>De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evo-devo%3A+variations+on+ancestral+themes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Evo-devo: variations on ancestral themes.</a> Cell. 132, 185-195 (2008).</li>
<li>Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ingestion+of+bacterially+expressed+dsRNAs+can+produce+specific+and+potent+genetic+interference+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 263, 103-112 (2001).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

In dit protocol beschrijven we onze methode voor de identificatie van lichaamsgrootte defectieve mutanten van C. elegans door RNAi voeden. Deze methode is van toepassing op de identificatie van TGF-β uitschakeling. Aangezien dergelijke onderdelen worden geconserveerd door evolutie 15, zoals schermen relevant zijn voor het ophelderen van de moleculaire mechanismen van TGF-β signalering in alle metazoa. Een belangrijke overweging bij het ontwerpen van een dergelijk scherm is de uitgangsstam. We hebben ...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> RNAi worm platen 17,7 g Worm Medium Mix 60 g Agar Voeg H 2 O tot 3 liter. Autoclaveren. Voeg 3 ml 1M IPTG (steriel) en 3 ml 25 mg / ml carbenicilline (steriel) giet in 60 mm petrischalen. Worm platen 17,7 g Worm Medium Mix 0,6 g streptomycinesulfaat 60 g Agar Voeg H 2 O tot 3 liter. Autoclaveren. Giet het mengsel in 60 mm petrischalen. Worm Medium Mix 55 g Tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g Bacto Peptone 800 mg cholesterol 200 g NaCl Meng grondig en zorgt ervoor dat brokken voorkomen, dit poedervormig mengsel kan worden opgeslagen gedurende vele maanden voor gebruik. 2% agarose 0,5 g Agarose Advertentied 25 ml dH 2 O. Hitte in de magnetron totdat het is opgelost. 1M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 2 g IPTG Los IN10 ml dH 2 O 1M NaN 3 6,5 g NaN3 Voeg dH 2 O tot 100 ml 25 mM NaN3 2,5 ml 1M NaN 3 Voeg dH 2 O tot 100 ml Caenorhabditis elegans van Caenorhabditis Genetics Center L4440 plasmide (draagt ​​ampicilline-resistentiegen) Bacteriënstam HT115 (DE3) (bevat IPTG induceerbare T7 polymerase, deficiënt voor RNAse III-gen (a dsRNAse) waarop ook tetracycline-resistentiegen) 16 60 mm Petrischalen 100 mm Petrischalen 14 ml ronde bodem Falcon kweekbuisjes objectglaasjes dekglaasjes 1 tot 20 ul pipet 20 tot 200 ul pipet 200-1000 ulpipet 1 tot 200 ul pipet tips 200-1000 ul pipet tips 1,5 ml Eppendorf buisjes platina draad worm pick </td></tr></tbody></table>

met behulp van rna-gemedieerde interferentie voerstrategie om te screenen op genen die betrokken zijn lichaam grootte verordening in de nematode<em&gt; c. elegans</em

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Dubbelstrengs RNA-gemedieerde interferentie (RNAi) is een effectieve strategie om knock down doelwit genexpressie 1-3. Het is toegepast op vele modelsystemen zoals planten, invertebraten en vertebraten. Er zijn verschillende methoden om RNAi bereiken in vivo 4,5. Bijvoorbeeld, het doelwitgen kan worden omgezet in een RNAi vector, en vervolgens permanent of tijdelijk omgezet in cellijnen of primaire cellen gen knockdown effecten te bereiken, als alternatief gesynthetiseerde dubbelstrengs oligonucleotiden van specifieke doelgenen (RNAi oligos) kan tijdelijk worden omgezet in cellijnen of primaire cellen doelgenen zwijgen, of gesynthetiseerde dubbelstrengs RNA moleculen worden gemicroinjecteerd in een organisme. Aangezien de nematode C. elegans gebruikt bacteriën als een bron van voedsel, het voeden van de dieren met bacteriën die dubbel-strengs RNA tegen target genen biedt een levensvatbare strategie 6. Hier presenteren we een RNAi voedenmethode om lichaamsgrootte fenotype scoren. Lichaamsgrootte in C. elegans wordt primair gereguleerd door de TGF-β - zoals ligand DBL-1, zodat deze test is geschikt voor identificatie van TGF-β signaleringscomponenten 7. We verschillende stammen gebruikt, waaronder twee RNAi overgevoelig stammen aan de RNAi voeden experimenten te herhalen. Onze resultaten laten zien dat RRF-3 stam gaf ons de beste verwachte RNAi fenotype. De methode is eenvoudig uit te voeren, reproduceerbare en gemakkelijk gekwantificeerd. Verder is onze protocol minimaliseert het gebruik van gespecialiseerde apparatuur, dus het is geschikt voor kleinere laboratoria of aan degenen met voornamelijk undergraduate instellingen.

In ons onderzoek richten we ons op de lichaamsgrootte regulering door de DBL-1/TGF-β pad. Het verlies van functie van de DBL-1-route resulteert in kleine lichaamsgewicht, met een kortere lengte vergeleken met wild-type dieren 7,10,11. Zo schermen voor C. elegans lichaamsgrootte mutanten kunnen identificeren TGF-β signalering componenten en modificatoren. DBL-1-signalering wordt gemedieerd door een geconserveerd TGF-β signaaltransductieroute die celoppervlak receptoren en intracellulaire Smad signaal ...

We laten zien hoe u de RNAi voeden techniek te gebruiken om knock down doelwitgenen en score lichaamsgrootte fenotype in<em&gt; C. elegans</em&gt;. Deze methode kan worden gebruikt voor een grote scherm potentiële genetische componenten van belang, zoals die welke in lichaamsgrootte regulering door DBL-1/TGF-β signalering identificeren.

Met behulp van RNA-gemedieerde interferentie voerstrategie om te screenen op genen die betrokken zijn Lichaam Grootte verordening in de nematode<em&gt; C. elegans</em

Interferentie door dubbelstrengs RNA (RNAi) is een effectieve strategie om de expressie van doelgenen te reduceren1-3. Het is toegepast in veel modelsystemen ...

Deze video demonstreert een procedure voor het identificeren van genen die de groei en lichaamsgrootte van C. elegans reguleren. Voor het inactiveren van kandidaatgenen met behulp van RNA-interferentie (RNAi) worden eerst platen voorbereid met bacteriën die dubbelstrengs RNA tot expressie brengen dat gericht is op de genen van belang. Hermafrodieten in het vierde larvale stadium worden vervolgens overgebracht naar de RNAi-platen.Zodra ze het stadium van jongvolwassene bereiken, worden ze overgebracht naar nieuwe RNAI-plaatjes om eitjes te leggen. Na enkele uren worden ze verwijderd, waardoor gesynchroniseerde populaties embryo's achterblijven. In het gewenste ontwikkelingsstadium wordt het nageslacht verzameld en op objectglazen gemonteerd.Ten slotte worden microscopische beelden van de wormen verkregen. Analyse van het beeld toont veranderingen in de lichaamsgrootte aan die zijn veroorzaakt door geninactivatie. Hoewel deze methode kan worden gebruikt om regulatoren van het TGF beta-signaleringspad te identificeren, kan deze ook worden toegepast op andere signaleringspaden die de postembryonale ontwikkeling bij Caenorhabditis elegans reguleren, zoals het insulinesignaleringspad.Begin deze procedure door de doelgensequenties te kloneren in vector L 4 4 4 0 A, een veelgebruikt worm RNAi-plasmide, en transformeer het recombinante plasmide in de bacteriële stam HT one 15 DE three culture. Kweek de getransformeerde bacteriën op LB-agarplaten met 25 µg/mL carbenicilline en 12,5 µg/mL tetracycline, en selecteer vervolgens een enkele kloon voor toekomstig gebruik.Transformeer ondertussen de lege vector L 4 4 4 0 in de bacteriële stam HT one 15. Om deze als controle voor de experimenten te gebruiken, worden de getransformeerde bacteriën gedurende één nacht bij 37 °C gekweekt in één milliliter LB-bouillon met 100 µg/mL ampicilline.Tetracycline wordt niet toegevoegd omdat dit de RNAI-efficiëntie verlaagt. Voeg nog vijf milliliter LB-bouillon met 100 µg/mL ampicilline toe aan de overnight-kweek en incubeer deze vervolgens nog vier tot zes uur bij 37 °C. Zodra de kweek gereed is, wordt 0,5 milliliter van de experimentele of controlebacteriën geënt op de RNAI-wormplaten die zijn gelabeld met de overeenkomstige kloonnaam.Er moeten minstens twee platen per conditie worden voorbereid. Incubeer de platen overnacht bij 37 °C. De volgende dag.Er moet een bacteriegaz aanwezig zijn dat RNAi tot expressie brengt, met of zonder de doelgensequentie. De dieren zullen de bacteriën als voedselbron gebruiken. Zodra de RNAI-voedingsplaten gereed zijn, wordt de punt van een platina draad door middel van vlamsterilisatie gesteriliseerd.Gebruik vervolgens de platina draad om zes tot tien C. elegans hermaphrodieten in het vierde larvale stadium of L4 naar elke RNAi-plaat over te brengen. Laat de hermaphrodieten gedurende de nacht groeien bij 20 °C. De volgende dag zullen de dieren jonge volwassenen zijn.Breng ze over naar een nieuwe, op de juiste wijze gelabelde en geprepareerde RNAI-plaat. Incubeer de platen bij 20 °C gedurende vier tot zes uur zodat de volwassenen eitjes kunnen leggen. Verwijder na de incubatie alle volwassenen van de plaat om de nakomelingen te synchroniseren.Zodra de volwassen dieren zijn verwijderd, begint de tijdmeting. Dit is tijd nul. Incubeer de platen bij 20 °C om de dieren te laten groeien tot het gewenste ontwikkelingsstadium.Hier worden jonge volwassen dieren geselecteerd voor fenotypische analyse. Voor knockdowns die zich in een normaal tempo ontwikkelen, is een incubatie van 72 uur vereist. Houd er rekening mee dat verschillende genen de ontwikkeling van het dier op verschillende manieren beïnvloeden, waardoor de incubatietijden mogelijk moeten worden aangepast.Als de RNAi ervoor zorgt dat de dieren met een andere snelheid groeien, kunnen jonge volwassenen worden geïdentificeerd als dieren die niet meer dan 24 uur na het L4-stadium zijn, met een voltooide VUL-ontwikkeling en twee tot zes embryo's in de uterus, zoals hier wordt getoond. Om andere ontwikkelingsstadia te identificeren, dient de onderzoeker de gonadale en VUL-ontwikkeling als leidraad te gebruiken. Zodra de dieren het juiste stadium hebben bereikt, kan men zich voorbereiden op het scoren van de fenotypen van de lichaamsgrootte van de met RNAi behandelde wormen.Plak vervolgens twee lagen gekleurde labeltape op een glazen objectglas van één millimeter dik, zoals hier getoond. Maak twee van deze objectglazen. Plaats daarna een nieuw objectglas tussen de twee glazen met de tape en breng een druppel 2% Agros gesmolten in water aan.Druk in het midden van het nieuwe glazen dekglas een tweede glazen dekglas bovenop om een dunne agros-pad te maken. Zodra de agros is gestold, verwijdert u het bovenste glas. Het glazen dekglas met de agros-pad is nu klaar voor het aanbrengen van de wormen.Label het objectglas met de naam van de kloon. Voeg 10 µL 25 mM natriumazide toe aan het aros-kussen. Breng vervolgens, zoals eerder gedaan met een platina draad, 30 tot 40 dieren over naar de natriumazide-oplossing.Om ze te immobiliseren, plaatst u er een dekglas bovenop. Doe dit voor zowel de recombinante als de lege L 4 4 4 0 RNAi-behandelde dieren. Plaats vervolgens de micrometerglaasje onder de dissectiemicroscoop met een 2,5 x objectief.Leg met Q Capture of vergelijkbare software een afbeelding van de micrometerliniaal vast en sla deze op. Plaats vervolgens de wormen onder de microscoop en maak afbeeldingen. Om eerst de lichaamslengte te meten, opent u de afbeelding van de micrometerliniaal in de Image Pro-software.Klik vervolgens op measure en kies calibration. Selecteer daarna de spatial Calibration wizard met de optie calibrate the active image geselecteerd. Klik op next.Voer de naam voor de kalibratie in en zorg ervoor dat de eenheden voor de ruimtelijke referentie op microns zijn ingesteld. Vink vervolgens de knop 'Referentiekalibratie maken' aan en klik op Volgende. Klik op 'Referentielijn tekenen'.Er verschijnt een referentieschaalbalk. Verplaats de schaalbalk zodat deze overeenkomt met de uiteinden van de micrometer. Geef vervolgens aan dat de referentie 1000 eenheden representeert.Klik op ok. Vervolgens op volgende en voltooien. Zodra de software is gekalibreerd, opent u een afbeelding van een worm.Select vervolgens onder het menu 'measure' de optie 'calibration' en klik daarna op 'select spatial'. Selecteer in het vervolgkeuzemenu de bestandsnaam die is aangemaakt voor de micrometerkalibratie. Selecteer vervolgens onder het menu 'measure' de optie 'measurements' in het venster dat wordt geopend.Selecteer het instrument voor vrije tekening en trek met de computermuis een lijn door het midden van het lichaam van het dier, van kop tot staart. De lengte wordt in het venster weergegeven. Herhaal dit proces voor alle dieren in het veld.Exporteer de lengtemetingen naar een Microsoft Excel-bestand of een andere geschikte statistische software. Analyseer de gegevens door het gemiddelde en de standaarddeviatie voor elk monster te berekenen. Vergelijk vervolgens de resultaten voor elke groep met behulp van een student t-toets.Het eiwit DBL one uit de transforming growth factor bèta of TGF-bèta SUPERFAMILIE is vereist voor de activering van het TGF-bèta-pad. Als reactie op signaalactivering transloceren intracellulaire smad-signaaltransductoren naar de nucleus en initiëren zij gentranscriptie. Zie dat organismen waarin het TGF-bèta-pad is verstoord een kleinere lichaamsomvang hebben, waaronder een kortere lichaamslengte dan wild-type dieren.Zo worden screenings voor C. elegans uitgevoerd. Mutanten met een afwijkende lichaamsgrootte zijn in staat om TGF-beta-signaleringscomponenten en modifiers te identificeren om de effectiviteit van RNAi via voeding te testen voor de identificatie van lichaamsgrootte-mutanten. RNAi werd gebruikt om DBL-1-routecomponenten SMA-3 en SMA-6 uit te schakelen in vier verschillende stammen van C. elegans.De geteste C. elegans-stammen omvatten twee die hypersensitief zijn voor RNAi, namelijk Lin-15 B en RF3, evenals de standaard wildtype-stam N2 en de LIN-36-stam, waarvan de RNAi-gevoeligheid vergelijkbaar is met die van N2, zoals hier wordt getoond. Wanneer de expressie van SMA-3 of SMA-6 werd verstoord, vertoonden de dieren een significant kortere lichaamslengte dan de controledieren, behalve bij SMA-6 RNAi in Lin-36. Achtergrond in RF3.De lichaamslengtes van jonge volwassenen na RNAi-behandeling waren 84 tot 95% van die van de vector alleen. In A one Lin 15 B waren de lichaamslengtes van jonge volwassenen na RNAi 68 tot 86% van die van de controledieren. De A one lin 15 B-stam produceert echter weinig nakomelingen.Dit maakt ze ongeschikt voor screening op grote schaal. Daarom wordt het gebruik van de RF three-stam aanbevolen voor deze technieken. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe genen die de groei en lichaamsgrootte reguleren kunnen worden geïdentificeerd met behulp van de RNI-interferentietechniek.

using-rna-mediated-interference-feeding-strategy-to-screen-for-genes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Neurexins en neuroligins zijn membraan-neuron hechting eiwitten die een essentiële rol in synaptische differentiatie en transmissie uit te voeren. Neuroligin gebrekkige mutanten...

Osmotische Vermijden in Caenorhabditis elegans: Synaptic Functie van twee genen, orthologen van de Mens NRXN1 En NLGN1, Als kandidaten voor Autisme

We beschrijven een gevoelig methode om postembryonic regulatoren van eiwit expressie en lokalisatie...

RNAi screening Postembryonic fenotypes Leg in C. elegans</em

We beschrijven een protocol met behulp...

Kwantitatieve en geautomatiseerde high-throughput genoomwijde RNAi schermen in C. elegans</em

RNAi is een krachtig genetisch hulpmiddel dat beschikbaar is voor onderzoekers van C. elegans.  Deze video introduceert een methode om meer wormen met RNAi te behandelen dan plaatvoeding door gebruik te maken van vloeibare kweekomstandigheden.

RNAi-voeding in vloeibare cultuur: een methode met hoge doorvoer om genexpressie in C. elegans neer te slaan

Terwijl dsRNA voeden in C. elegans is een krachtig hulpmiddel om gen-functie, de huidige protocollen voor grootschalige voeden schermen resulteren in variabele knockdown efficiëntie te beoordelen. We beschrijven een verbeterde protocol voor het uitvoeren van grootschalige RNAi voeden schermen die resulteert in een hoogst doeltreffend en reproduceerbare neerhalen van genexpressie.

Grootschalige Gene Knockdown in<em&gt; C. elegans</em&gt; Met behulp van dsRNA Feeding bibliotheken Robuuste verlies-van-functie Fenotypes Genereer

C. elegans heeft zich ontpopt als een nieuwe genetische model om gastheer-pathogeen interacties te bestuderen. Hier beschrijven we een protocol te infecteren C. elegans met Salmonella typhimurium combinatie met een dubbele streng RNAi interferentie techniek om de rol van ontvangende genen bij afweer tegen Salmonella infectie onderzocht.

Een protocol te infecteren<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Met<em&gt; Salmonella typhimurium</em

Hier beschrijven we protocollen die specifiek zijn ontworpen om morfogenetische defecten te monitoren die optreden tijdens de vroege en late fasen van embryonale verlenging van de rondworm Caenorhabditis elegans. Uiteindelijk zijn deze protocollen ontworpen om genen te identificeren die deze fasen reguleren en om hun differentiële vereisten langs de antero-posterior as van het embryo te karakteriseren.

Novel Metrics te karakteriseren Embryonale Verlenging van de nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Dit protocol laat zien hoe een eiwit nucleaire translocatie onder hittestress bijhouden met behulp van een groene fluorescentie proteïne (GFP) fusieproteïne als merkstof en 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kleuring. De DAPI kleuring protocol is snel en behoudt de GFP en eiwit subcellular localisatie-signalen.

Opsporen van Eiwit Subcellular Localisatie door Green fluorescentie eiwit Tagging en 4', 6-Diamidino-2-phenylindole vlekken in Caenorhabditis elegans

Om chaperonne-chaperonne- en chaperonne-substraatinteracties te bestuderen, voeren we synthetische interactiescreenings uit in Caenorhabditis elegans met behulp van RNA-interferentie in combinatie met milde mutaties of overexpressie van chaperonnes en monitoren we weefselspecifieke eiwitdisfunctie op organismaal niveau.

Caenorhabditis elegans gebruiken om te screenen op weefselspecifieke chaperonne-interacties

Caenorhabditis elegans dienen als een uitstekend modelsysteem met robuuste en goedkope methoden voor het onderzoeken van de gezondheid, levensduur en veerkracht tegen stress.

Onderzoek naar goedkope methoden om levensduur en gezondheid te meten in Caenorhabditis elegans

Leer de RNAi-voedingsmethode om genen te identificeren die lichaamsgrootte reguleren in C. elegans. Deze techniek maakt grootschalige screening mogelijk voor ontwikkelingsbiologisch onderzoek.

Met behulp van RNA-gemedieerde interferentie voerstrategie om te screenen op genen die betrokken zijn Lichaam Grootte verordening in de nematode C. elegans (Video) | JoVE Journal

Met behulp van RNA-gemedieerde interferentie voerstrategie om te screenen op genen die betrokken zijn Lichaam Grootte verordening in de nematode

Meer video's verkennen