RNA-seq Analyse van transcriptomen in trombine-behandelde en Control Human Pulmonary microvasculaire endotheelcellen
February 13th, 2013
Dit protocol geeft een volledige en gedetailleerde procedure voor RNA-seq, een krachtige volgende generatie DNA sequencing technologie, toepassing profiel transcriptomen in menselijke long microvasculaire endotheliale cellen met of zonder behandeling trombine. Dit protocol is generaliseerbaar verschillende cellen of weefsels die door verschillende reagentia of ziekten.
Het algemene doel van deze procedure is om een volledig en gedetailleerd proces te presenteren om RNA-Seq, een krachtige next-generation DNA-sequencing technologie, toe te passen voor het profileren van transcriptomen. Dit wordt bereikt door eerst totaal RNA te isoleren van humane pulmonaire microvasculaire endotheelcellen met of zonder trombinebehandeling en de RNA-kwaliteit te controleren. De tweede stap is om DNA-bibliotheken te construeren van die RNA-monsters.
Vereenvoudig de clustergeneratie met behulp van het cbot-instrument en voer de DNA-sequencingtaak uit op de HighSeq 1000. Vervolgens wordt data-analyse uitgevoerd om uiteindelijk differentieel tot expressie gebrachte gentranscripten te identificeren en weer te geven. De laatste stap is het valideren van RNA-seq-resultaten door RT qPCR. Het belangrijkste voordeel van IC ten opzichte van bestaande methoden zoals een DNA-microarray voor transcriptome-analyse is dat IC een compleet transcriptoom kan profileren, digitale gegevens kan leveren en niet afhankelijk is van enige bekende genexpressie in cellen.
Terwijl meting van het MRA-niveau een nuttig hulpmiddel is om te bepalen hoe de transcriptie van de machinerie van de cel wordt beïnvloed door externe signalen of hoe cellen verschillen tussen een gezondheidstoestand en een ziektetoestand. In dit protocol zullen we IC-analyse van transcriptomen in trobin-behandelde en controle humane pulmonaire microvasculaire Indo syn-cellen demonstreren. Dit protocol is gebaseerd op onze recent gepubliceerde studie waarin we met succes de eerste volledige transcriptome-analyse hebben uitgevoerd van humane pulmonaire microvasculaire endotheelcellen behandeld met trombine met behulp van RNA-Seq op de High SEQ 1000, een populair next-generation DNA-sequencingplatform. Mrs.
Suman Shaha zal DNA-sequencing demonstreren op het high SEQ 1000-instrument, evenals het RT-PCR-validatie-experiment. Met behulp van het VS seven RT-PCR-systeem zal Dr. Denova de trombinebehandeling van humane pulmonaire, microvasculaire endotheelcellen en isolatie van totaal cellulair RNA demonstreren. Mrs. Margaret Gibson zal het Experian-systeem demonstreren om de RNA-kwaliteit en DNA-bibliotheek te controleren, evenals clustergeneratie op de cbot.
En Dr. Dimitri Gregor zal data-analyse demonstreren. Om dit protocol te beginnen, kweekt u humane longmicrovasculaire endotheelcellen tot tussen 90 en 100% confluentie in zes-wellplaten in EGM twee-medium met 5% FBS-groeifactoren en antibiotica. Ververs het medium naar het hongermedium 30 minuten voorafgaand aan de behandeling met trombine.
Behandel de cellen na 30 minuten met 0,05 eenheden per milliliter trombine, of laat onbehandeld als controle. Incubeer de cellen gedurende zes uur bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Na een behandeling van zes uur.
Isoleer totaal RNA van de behandelde en controlecellen met behulp van de Nirvana-kit volgens de instructies van de fabrikant. Beoordeel de kwaliteit van het RNA met een Experian standaard sense eukaryotisch RNA-chip volgens het standaardprotocol op de Experian geautomatiseerde elektroforese-statie. Kwantificeer tenslotte het RNA met behulp van een standaard spectrofotometrische methode voor bibliotheekconstructie.
Gebruik één microgram hoogwaardig totaal RNA per monster als uitgangsmateriaal om de bibliotheek te construeren. Volg het standaardprotocol van de fabrikant. In dit protocol worden twee rondes van poly bevattende Mr.mRNA-selecties uitgevoerd.
Om onze RNA te verwijderen om onze RNA-sequencing te minimaliseren, beoordeel de kwaliteit van de bibliotheken met behulp van een Experian DNA one K-chip. Volgens het standaardprotocol op de Experian geautomatiseerde elektroforese-statie. Kwantificeer de bibliotheek met behulp van kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie.
Afgekort Q-R-T-P-C-R zoals beschreven in het geschreven protocol. Bij deze video, voer de Q-R-T-P-C-R uit volgens het cyber green MM-protocol en bereken de oorspronkelijke stockconcentratie van elke bibliotheek. Verdun de bibliotheekstocks tot 10 nanomolair en bewaar bij 20 graden Celsius.
Als u klaar bent om een flowcel te clusteren, ontdooit u de cbot-reagensplaat in een waterbad. CBOT is een instrument dat wordt gebruikt om het clustergeneratieproces te stroomlijnen. Na het wassen van het cbot-instrument, denatureer de bibliotheken door eerst 13 microliters van een XTE en zes microliters van 10 nanomolair te combineren.
Voeg vervolgens aan de zijkant van elke buis een microliter van een normale natriumhydroxide toe, vortex de buizen, centrifugeer en incubeer op kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Plaats vervolgens de gedenatureerde bibliotheken op ijs. Verdun vervolgens de gedenatureerde bibliotheken met voorgekoeld hybridisatiebuffer door 996 microliters buffer en 4,0 microliters gedenatureerde bibliotheek te combineren voor een uiteindelijke concentratie van 12 pico molair.
Plaats de gedenatureerde verdunde bibliotheken op. Draai vervolgens elke rij buizen van de cbot-plaat om, waarbij u ervoor zorgt dat alle reagentia zijn ontdooid. Nadat u de plaat hebt gecentrifugeerd, verwijdert u de folieafdichting van de rij natriumhydroxidebuizen en laadt u deze op de cbot-aliquot.
120 microliters van de verdunde gedenatureerde bibliotheken naar een strookbuis gelabeld van één tot acht. Voeg 1,2 microliters van de verdunde gedenatureerde PHI X controlebibliotheek toe aan elke buis als een spike-in controle. Na het vortexen en centrifugeren van de buizen, laadt u ze op de cbot in de juiste oriëntatie met buisnummer één naar rechts.
Laad een flowcel en stuurder op de cbot. Voltooi de flowcheck en begin de clusteringrun. Nadat de run is voltooid, controleert u de reagentialevering over alle banen. Houd notities bij van eventuele afwijkingen. Start de sequencingrun onmiddellijk of bewaar de flowcel in de verstrekte buis bij vier graden Celsius. Om te beginnen met sequencing.
Ontdooi de sequencing by synthesis-reagentia. Laad de reagentia op de juiste plekken op de reagentiatrays, zorg ervoor dat u de andere reagentia niet aanraakt. Nadat u de cleavagemix hebt aangeraakt, gebruikt u een niet-sequencing flowcel om de reagentialijnen twee keer grondig te primen. Reinig vervolgens de sequencing flowcel met 70% ethanol en Kim-doekjes, gevolgd door 7
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol presenteert een gedetailleerde procedure om RNA-seq, een krachtige volgende generatie DNA-sequencing technologie, toe te passen om transcriptomen te profileren in humane pulmonaire microvasculaire endotheelcellen met of zonder trombinebehandeling. De methode omvat RNA-isolatie, bibliotheekconstructie, sequencing en data-analyse.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Genomiek
- Celbiologie
Achtergrond
- RNA-seq is een volgende generatie sequencing technologie.
- Het maakt een uitgebreide transcriptome profilering mogelijk.
- Trombinewetering kan de genexpressie in endotheelcellen beïnvloeden.
- Deze methode kan worden toegepast op verschillende celtypen en condities.
Doel van de studie
- Om een gedetailleerd RNA-seq protocol voor endotheelcellen te bieden.
- Om differentieel uitgedrukte gentranscripten te identificeren.
- Om RNA-seq resultaten te valideren via RT-PCR.
Gebruikte methoden
- Isolatie van totaal RNA uit humane pulmonaire microvasculaire endotheelcellen.
- Kwaliteitscontrole van RNA-monsters.
- Constructie van DNA-bibliotheken van RNA-monsters.
- Sequencing met behulp van de HighSeq 1000 platform.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van differentieel uitgedrukte gentranscripten.
- Validatie van RNA-seq resultaten met behulp van RT-PCR.
- Demonstratie van RNA-seq voordelen boven traditionele methoden.
- Beschikbaarstelling van digitale data voor uitgebreide transcriptome-analyse.
Conclusies
- RNA-seq is een krachtig hulpmiddel voor transcriptome-analyse.
- Het protocol is toepasbaar op verschillende celtypen en condities.
- Het biedt een compleet profiel van genexpressie zonder voorafgaande genomische kennis.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
RNA-seq enables comprehensive transcriptome profiling in human pulmonary microvascular endothelial cells, supporting mechanistic de-risking and target validation in response to thrombin or other stimuli. This digital, unbiased approach enhances predictive confidence at the discovery and preclinical inflection points, facilitating risk-adjusted portfolio decisions. The protocol's adaptability across cell types and conditions positions it as a reusable enterprise capability for transcriptomic interrogation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of transcriptional responses to external signals, clarifying pathway activation and target engagement.
- Supports biological de-risking by identifying differentially expressed genes and novel isoforms in disease-relevant systems.
- Provides digital quantification of transcript abundance, strengthening predictive confidence for target selection.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated cellular models for downstream screening workflows.
- Delivers standardized, reproducible transcriptomic data for assay development and optimization.
- Enables quantitative assessment of gene expression changes, supporting reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns transcriptomic outputs with disease mechanisms, informing translational biomarker discovery.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by enabling cross-condition and cross-model comparisons.
- Reduces mechanistic ambiguity in preclinical models by providing comprehensive gene expression profiles.
Pipeline & Workflow Integration
This RNA-seq protocol integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting hypothesis testing and mechanistic de-risking across the R&D continuum.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven interrogation of gene expression changes following thrombin or other treatments.
- Screening: Provides reproducible, quantitative transcriptomic outputs for assay readiness and compound screening.
- Analytics: Delivers digital readouts and statistical outputs (e.g., FPKM, p-values) for robust condition comparison.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and disease relevance by profiling transcriptomes in health and disease states.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocol for diverse cell types, treatments, and disease models, maximizing R&D resource efficiency.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes transcriptome profiling with scalable, reproducible workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by providing robust molecular data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and preclinical programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA isolation, library construction, and next-generation sequencing instrumentation.
- Demands access to high-throughput sequencers (e.g., HiSeq 1000) and automated quality control systems.
- Necessitates standardized data analysis pipelines and statistical filtering (e.g., FPKM, p-value thresholds).
- Adaptable to various cell types, treatments, and sequencing platforms with minor protocol modifications.
- Dependent on rigorous RNA quality metrics (e.g., RQI ≥ 7) and cross-team data validation (e.g., RT-PCR).
