Imaging pHluorin-tagged Receptor invoegen in op het plasmamembraan in primaire gekweekte muis neuronen
November 20th, 2012
Tagging door de extracellulaire domeinen van membraanreceptoren met superecliptic pHluorin, en imaging deze fusie-receptoren in gekweekte muis neuronen, kunnen we direct visualiseren individuele vesiculaire inbrengen gebeurtenissen van de receptoren aan het plasmamembraan. Deze techniek zal instrumenteel ophelderen van de moleculaire mechanismen voor insertie receptor naar de plasmamembraan.
Het algemene doel van het volgende experiment is om neuronale receptoren te visualiseren terwijl ze in de plasmamembraan worden ingebracht in gekweekte primaire muizenneuronen. Om dit te doen worden muizen-GL verkregen uit de cerebrale cortex van embryonale of neonatale muizen en gekweekt op semi-permeabele met collageen beklede kweekinserts. De gliacellen worden gesuspendeerd boven primaire embryonale hippocampale neuronen op dekglasjes.
Na zeven dagen conditionering worden de neuronen getransfecteerd met een super ecliptische fluorine-getagde dopamine D-twee receptor. De getagde receptor lokaliseert zich in intracellulaire vesikel, maar blijft niet-fluorescent in de zure omgeving van de vesikel. Wanneer de vesikel echter versmelt met de plasmamembraan, wordt het Florin blootgesteld aan de neutrale pH van de extracellulaire omgeving en fluoresceert helder, waardoor detectie mogelijk is door totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van membraaneiwittransport, waardoor we het transport van alle membraaneiwitten die kunnen worden gelabeld met fluorine kunnen visualiseren, zoals glutamaatreceptoren en gpro-gekoppelde receptoren. De procedure wordt vandaag samen met mij gedemonstreerd door droger te fokken en, en we één, twee andere leden van onze onderzoeksgroep. De dag voor het dissectieprocedure worden T 75 flessen met collageenoplossing rechtop gezet en overnacht gedroogd. Op de dag van de gliacellenkweek wordt het gliacellenmedium minimaal 30 minuten in een waterbad van 37 graden Celsius opgewarmd. Na euthanasie worden de cerebrale cortices van embryonale of neonatale muizen onder een dissectiemicroscoop gedissecteerd.
Plaats de verwijderde cortices in een 15 milliliter conische buis gevuld met ijs, koud, kunstmatig hersenvocht, of A CSF. Verwijder vervolgens alle oplossingen behalve twee milliliter van de A CSF en voeg 100 microliter pepaanoplossing en 20 microliter 1%DNAs.Een toe. Plaats de buis in een waterbad van 37 graden Celsius en laat het weefsel 20 minuten verteren.
Na de vertering wordt het hersenweefsel voorzichtig gewassen door de propaanoplossing voorzichtig te verwijderen en 10 milliliter voorverwarmd gliacellenmedium toe te voegen. Zorg ervoor dat u het weefsel niet verstoort. Verwijder zoveel mogelijk gliacellenmedium.
Voeg twee milliliter vers gliacellenmedium toe en gebruik een met vuur gepolijste glazen pastpijp om te triëren totdat het weefsel niet meer zichtbaar is. Vermijd het vormen van bellen zodra het weefsel volledig is gedissocieerd. Voeg nog eens acht milliliter vers gliacellenmedium toe en pipet de suspensie door een 70 micron celstrainer.
Verzamel de doorstroming in een 50 milliliter conische buis. Breng de gedissocieerde cellen van twee tot drie embryo's over in een met collageen beklede T 75 fles en kweek ze's nachts bij 37 graden Celsius in een weefselkweekincubator. De volgende dag zuigt u het medium af. Spoel de cellen eenmaal af met 10 milliliter PBS.
Voeg vervolgens 10 tot 15 milliliter vers gliacellenmedium toe aan elke fles. Kweek de culturen gedurende 10 tot 12 dagen en ververs het medium elke drie tot vier dagen. Zodra confluent, spoel de gliacellen af met PBS.
Voeg vervolgens vijf milliliter 0,05% tripsine toe aan de fles en laat de cellen vijf minuten bij 37 graden Celsius loslaten. Na de korte incubatie voegt u gliacellenmedium toe en pipetteert u om de GL los te maken van de bodem van de fles. Verdeel de cellen in twee nieuwe met collageen beklede T 75 flessen.
Zodra deze confluent zijn, wordt tripsine toegepast zoals hiervoor en worden de inhoud van elke fles gezaaid in zes welplaten met met collageen beklede kweekinserts. Geplaatst over twee milliliter gliacellenmedium, de cellen gedurende een tot zeven dagen. Deze gliacellenkweekinserts zullen worden gebruikt om de neuronale culturen te conditioneren.
Voeg vier milliliter kweekmedium toe aan elke wel van een zes welplaat met schoongemaakte met polylysine beklede dekglasjes en plaats de plaat 's nachts in een incubator van 37 graden Celsius. Deze stap verhoogt de kans op neuronaal overleven, waarschijnlijk door resterende polylysine de volgende dag te verwijderen. Verwijder het kweekmedium en vervang het door twee milliliter vers kweekmedium.
Medium bevattend 2% van het medium. Supplement B 27 voor de kweek van hippocampale neuronen Onder een dissectiemicroscoop worden de hippocampi gedissecteerd uit het hersenweefsel van vier E 15 tot 18 embryonale muizen. Plaats de hippocampi in een 15 milliliter conische buis met ijskoud dissectiebuffer.
Vervolgens wordt het striatum gedissecteerd uit het hersenweefsel van drie E 15 tot 18 embryonale muizen en worden ze in een aparte 15 milliliter conische buis met ijskoud dissectiebuffer geplaatst. Verteer het weefsel met pepaan zoals hiervoor. Gebruik vervolgens een hemocytometer.
Bepaal het aantal cellen in elke neuronale suspensie en zaai. Elke dekglas met 0,4 maal 10 tot de zesde cellen en kweek ze 's nachts in een incubator van 37 graden Celsius. Om de gliacellenkweekinserts voor te bereiden op het conditioneren van de neuronale culturen, zuigt u het medium van de gliacellenkweekinserts en het bord af en vervangt u het door twee milliliter vers kweekmedium.
Het volgende dag plaatst u de dekglasjes met de neuronen in elke wel van de schaal onder de gliacellenkweekinserts. Blijf incuberen bij 37 graden Celsius elke drie tot vier dagen. Vervang de helft van het medium met vers, voorverwarmd voedingsmedium bevattend B 27 totdat ze klaar zijn voor transfectie en beeldvormingsexperimenten.
Neuronen worden op dag zeven getransfecteerd en op dag acht van de kweek geïmager. Consistente neuronale kweek is de sleutel tot succesvolle live beeldvormingsexperimenten. Deze figuur toont muizenhippocampale neuronen gekweekt volgens dit protocol van 11 dagen in vitro tot 18 dagen in vitro.
Uit de beelden blijkt dat de neuronen uitgebreide processen hebben ontwikkeld en dat de dendritische processen dicht bezaaid zijn met dendritische stekels. Aanwijzingen dat deze neuronen gezond zijn in cultuur voor
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie toont een techniek voor het visualiseren van de invoeging van neuronale receptoren in het plasmamembraan van gekweekte primaire muisneuronen. Door gebruik te maken van een super ecliptic pHluorin getagde dopamine D2 receptor, kunnen onderzoekers de fluorescentie veranderingen observeren die optreden tijdens receptor invoeging.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Het begrijpen van receptor invoeging is cruciaal voor het verduidelijken van neuronale signaalmechanismen.
- Vorige methoden ontbraken de mogelijkheid om individuele receptor invoegingsgebeurtenissen te visualiseren.
- Fluorescente tagging maakt real-time observatie van receptor dynamica mogelijk.
- Primaire muisneuronen bieden een relevante biologische context voor het bestuderen van receptorgedrag.
Doel van het onderzoek
- Om de invoeging van dopamine D2 receptoren in het plasmamembraan te visualiseren.
- Om een methode te ontwikkelen die real-time beeldvorming van receptor dynamica mogelijk maakt.
- Om de begrip van de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij receptor trafficking te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Isolatie van gliacellen uit de hersenschors van embryonale of neonatale muizen.
- Kweek van gliacellen op semi-permeabele collageen-gecoate inzetstukken boven primaire hippocampus neuronen.
- Transfectie van neuronen met een super ecliptic pHluorin getagde dopamine D2 receptor.
- Gebruik van totale interne reflectie fluorescentie microscopie om receptor invoegingsgebeurtenissen te detecteren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van receptor invoegingsgebeurtenissen in real-time.
- Fluorescentie werd alleen waargenomen wanneer receptoren fuseerden met het plasmamembraan.
- De techniek biedt inzichten in de dynamica van receptor trafficking.
- Receptor invoeging werd bevestigd door de verandering in fluorescentie intensiteit.
Conclusies
- Deze methode maakt directe observatie van receptor dynamica in levende neuronen mogelijk.
- Bevindingen dragen bij aan het begrip van neuronale signaalgeving en receptorgedrag.
- De techniek kan worden toegepast om andere membraaneiwitten en hun dynamica te bestuderen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Visualizing real-time receptor insertion into the plasma membrane addresses a critical gap in target validation by enabling direct observation of membrane protein dynamics in live neurons. This approach supports mechanistic de-risking in early discovery by providing quantitative, spatially resolved data on receptor trafficking kinetics. The method enhances predictive confidence in lead identification for CNS targets by linking molecular behavior to functional outcomes in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by directly visualizing receptor insertion events in primary neurons.
- Operational Value: Provides a disease-relevant system for assessing target engagement and trafficking dynamics without fixation artifacts.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by correlating receptor trafficking with neuronal signaling readiness.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts that distinguish plasma membrane from intracellular receptor pools.
- Operational Value: Enables assay standardization through TIRF-based detection of single-molecule insertion events.
- Scalability: Supports platform reuse for screening compounds that modulate receptor trafficking in neuronal cultures.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Uses primary cultured mouse neurons as a disease-relevant system for studying receptor trafficking mechanisms.
- Mechanistic De-risking: Links receptor insertion dynamics to neuronal maturation and synaptic readiness.
- Preclinical Model: Establishes a reproducible system for evaluating target behavior prior to in vivo validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification by providing real-time, quantitative data on receptor trafficking in a neuronal context.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing receptor insertion as a functional readout of target engagement.
- Screening: Enables assay readiness through reproducible detection of single-vesicle fusion events using TIRF microscopy.
- Analytics: Delivers quantitative dependent variable measurements (fluorescence intensity over time) that enable comparison of trafficking conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by using primary neurons to model human neuronal receptor behavior.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable to any extracellularly tagged membrane protein.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in receptor trafficking.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through quantitative, single-molecule sensitivity imaging.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing direct visualization of target behavior in live neurons.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS targets based on validated trafficking dynamics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary neuronal culture, transfection, and TIRF microscopy.
- Depends on access to total internal reflection fluorescence microscopy systems with appropriate laser and EM-CCD camera specifications.
- Necessitates cross-team standardization for consistent glial-neuronal co-culture conditions and transfection efficiency.
- Involves adaptation considerations when extending to other membrane proteins with varying extracellular domain accessibility.
- Limited by the requirement for extracellular domain tagging compatibility with superecliptic pHluorin.
