Name: Imaging pHluorin-tagged Receptor invoegen in op het plasmamembraan in primaire gekweekte muis neuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Leer de visualisatie van receptorinsertie in het plasmamembraan van primaire gekweekte muishippocampusneuronen met behulp van pHluorin-tagged dopamine D2-receptoren en TIRF-microscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door het opstarten van fondsen van The Jackson Laboratory.

1. Het voorbereiden van de Muis van Glia Cultuur voor Neuronale Cultuur Conditioning <ol><li> T75 flessen zijn bedekt met collageen oplossing (1:3 verdunning van Purecol in DDH 2 O). De kolven zijn verticale stand geplaatst en te drogen &#39;s nachts in een weefselkweek kap. </li><li> Dissectie buffer (aCSF: 119 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 30 mM dextrose, 25 mM HEPES, pH 7,4, zonder calcium) en glia media (DMEM aangevuld met 10% FBS, 10 eenheden / ml penicilline, 10 ug / ml streptomycine en Glutamax) bereid en bewaard bij 4 ° C tot aan gebruik. </li><li> Op de dag van glia cultuur, de glia media verwarmd gedurende ten minste 30 minuten in een 37 ° C waterbad voor dissectie van muizenhersenen. Embryonale of neonatale muizen worden gedood door snelle onthoofding. Cerebrale cortex worden ontleed onder een dissectie microscoop. </li><li> Ontleed Hersenweefsel verteerd papaïne oplossing (100 ml papaïne en 20 pi 1% DNase I in 2 ml dissectie buffer) bij 37 ° C for 20 min. </li><li> Na papaïnedigestie zijn hersenweefsel gespoeld met 10 ml voorverwarmde glia media. Verse media glia (2 ml) wordt vervolgens toegevoegd aan de geknipte hersenweefsel en de weefsels worden gewreven met een vuur gepolijste glazen Pasteur pipet. </li><li> Verse media glia (8 ml) wordt toegevoegd aan het gedissocieerde weefsel. Een 70 urn cel-zeef wordt gebruikt om de gedissocieerde weefselsuspensie filteren. Cellen worden vervolgens gezaaid in T75 kolven (meestal 2-3 embryo kan zaad een T75 kolf) en geplaatst in een 37 ° C celkweek incubator. </li><li> De volgende dag, wordt het papier uit de T75 kolven opgezogen. De kolven worden gespoeld met 10 ml PBS. Verse media glia (10-15 ml) wordt vervolgens toegevoegd aan elke kolf. </li><li> Binnen 10-12 dagen, moet glia in de T75 flessen worden confluent. Gliale cellen gespoeld met PBS en 5 ml 0,05% trypsine toegevoegd aan elke T75 fles. </li><li> Na trypsine incubatie bij 37 ° C gedurende 5 min, gliale cellen gedissocieerd en gliacellen van elkaar T75 kolf in tweeverschillende collageen gecoate T75 kolven. </li><li> Cultuur inserts (Millipore PICM03050) worden bereid door ze in 6-well platen, coaten met collageen en luchtdrogende overnight. Glia media (2 ml per stuk) te plaatsen onder elke cultuur insert. </li><li> Glia van confluente T75 kolven worden getrypsiniseerd en geënt op de cultuur inserts (een T75 kolf per 6-well plaat, elke 2 ml insert). Deze inserts glia cultuur wordt gebruikt wordt om het neuronale kweken. </li></ol> 2. Neuronale Cultuur <ol><li> Het glas dekglaasjes voor neuronale cultuur zijn gereinigd door ze in 70% HNO 3 ten minste girale. Dekglaasjes worden vervolgens gewassen met 2 O ddH ten minste 3 keer, en gedroogd in een oven Isotemp (&gt; 200 ° C) geroerd. </li><li> Schoongemaakt dekglaasjes worden in een 6-well plaat, een dekglaasje per putje. Dekglaasjes worden bekleed met poly-L-lysine (2 ml, 0,1% in 100 mM boorzuur, pH = 8,5) gedurende de nacht in een 37 ° C incubator. </li><li> Depoly-L-lysine oplossing uit de dekglaasjes en dekglaasjes worden 3 keer gewassen met geautoclaveerd ddH 2 O. Dekglaasjes worden dan geïncubeerd in een 37 ° C incubator overnacht in uitplaatmedia (Neurobasal aangevuld met 5% hitte-geïnactiveerd paardenserum, 10 eenheden / ml penicilline, 10 ug / ml streptomycine, Glutamax, 2% B27 supplement wordt toegevoegd aan het medium plating op de dag wordt gebruikt). </li><li> De volgende dag, de uitplaatmedia verwijderd en 2 ml vers uitplaatmedia met B-27 toegevoegd aan elk putje dat een dekglaasje bedekt is. </li><li> Zwangere muizen (E15-18) geëuthanaseerd met CO2 en embryonale muizen worden gedood door onthoofding. De hippocampus of striatum wordt geprepareerd uit het hersenweefsel en geplaatst in een 15 ml conische buis met ijskoude buffer dissectie voor cultuur van hippocampale neuronen of striatale medium spiny neuronen respectievelijk. </li><li> Ontleed hersenweefsel kunnen worden gescheiden in papaïne zoals beschreven in stap 1.4) en 1.5). </li><li> Fadat dissociatie wordt het aantal cellen in elke neuronale suspensie geteld met een hemocytometer. Neuronen worden vervolgens gezaaid op elke dekglaasje bij een dichtheid van 0,4 x 10 6 cellen per putje van een 6-well plaat en gekweekt in een 37 ° C incubator overnacht (neuronen DIV 0). </li><li> Om glia cultuur inzetstukken voor te bereiden voor het conditioneren van de neuronale culturen, wordt de glia media verwijderd van de glia cultuur inzetstukken en vers plating medium wordt toegevoegd (2 ml in de invoeg-en 2 ml onder de insert). </li><li> De volgende dag (DIV 1), zijn dekglaasjes met neuronen geplaatst onder de glia cultuur inserts, een dekglaasje in elk putje. </li><li> Neuronen worden gevoed met het halve volume verse voorverwarmde voeding media (met B-27) elke 3-4 dagen tot ze klaar voor transfectie en imaging experimenten. </li></ol> 3. Transfectie <ol><li> Neuronale transfectie wordt uitgevoerd met Lipofectamine 2000. Voor elke neuronale cultuur (de ene cultuur per dekglaasje), 2 piLipofectamine 2000 en 1 ug DNA gebruikt. Verse Neurobasal medium zonder supplement wordt gebruikt om Lipofectamine en DNA te verdunnen. </li><li> DNA en Lipofectamine geïncubeerd gedurende 20 min bij kamertemperatuur na het mengen. </li><li> Sla 1 ml van de media van onder elke glia cultuur insert, en 1 ml van binnen elke insert, en breng de media om een ​​conische buis. Voeg hetzelfde volume van het voeden van de media + B27 om de opgeslagen medium en incubeer bij 37 ° C. Dit medium wordt gebruikt voor neuronale cultuur na transfectie. </li><li> Na de 20-min Lipofectamine / DNA incubatie worden glia cultuur inserts tijdelijk verwijderd uit de 6-well platen. De 200 pi Lipofectamine / DNA mengsel toegevoegd aan elke dekglaasje met neuronen. De glia cultuur inserts worden vervolgens teruggestuurd naar elk putje boven de neuronen. Opwekken van luchtbellen onder het membraan van de cultuur inserts worden vermeden. Neuronen worden geïncubeerd met de Lipofectamine / DNA mengsel bij 37 ° C gedurende 2-4 uur. </li><li> Na ee 2-4 uur incubatieperiode worden glia inserts weer verwijderd. Het kweekmedium met de Lipofectamine / DNA mengsel wordt uit elk putje verwijderd. De media opgeslagen in stap 3.3) wordt toegevoegd aan neuronen (2 ml per well). Glia cultuur inserts worden geretourneerd aan elk putje en glia medium van elk inzetstuk is verwijderd, en 2 ml van de media uit stap 3.3) wordt toegevoegd aan elk insert. </li><li> Neuronen gekweekt voor een extra 24-72 uur om expressie van cDNA getransfecteerd voordat TIRF beeldvorming wordt uitgevoerd op deze neuronen. </li></ol> 4. TIRF Imaging <ol><li> Kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF: 119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 30 mM glucose, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 25 mM HEPES, pH = 7,4) wordt gebruikt voor live-imaging experimenten. Ons TIRF imaging-systeem is op maat set-up met een 100-mW cyaan laser voor excitatie, en een Electron vermenigvuldigen Charge Coupled Device (EMCCD) camera voor een detector. </li><li> Voorafgaand aan beeldvorming experimenten wordt de aCSF gewaarschuwd in een 37 &amp; deg; C waterbad gedurende ten minste 30 minuten. De verwarming insert voor levende beeldvorming op de microscooptafel en de verwarming insert, laser en camera worden verwarmd gedurende ten minste 30 minuten voor aanvang van de imaging experimenten. </li><li> Een dekglaasje met getransfecteerde neuronen wordt geassembleerd in de live-imaging kamer. De voorverwarmde aCSF geplaatst in de kamer nadat de kamer is gemonteerd, deze stap worden zo snel als mogelijk. </li><li> Zodra de kamer rust op de verwarming insert op de microscoop fase worden getransfecteerde neuronen geïdentificeerd visueel onder epi-fluorescentie imaging mode. </li><li> Na gezonde getransfecteerde neuronen geïdentificeerd (zie figuren 1 en 2), we voeren gewoonlijk 1 minuut foto-bleach tot bestaande pHluorin fluorescentie regulering van de plasmamembraan, zoals pHluorin-receptoren op het plasmamembraan zeer hoge fluorescentie niveaus wanneer TIRF imaging wordt gestart, die interfereert met visualisatie van afzonderlijke insertion evenementen. </li><li> Na photobleach wordt de versterkingsinstelling van de elektronenvermenigvuldiger de EMCCD camera op maximum en opname uitgevoerd gedurende 1 min bij 10 Hz. </li><li> Elke opname bevat 600 beelden. Individuele inbrengen gebeurtenissen worden geïdentificeerd door het spelen van de opname terug met behulp van ImageJ. Individuele inbrengen gebeurtenissen worden geanalyseerd handmatig met ImageJ. </li></ol> 5. Representatieve resultaten Consistente neuronale cultuur is de sleutel tot succesvolle live-imaging experimenten. Figuur 1 toont de muis hippocampale neuronen gekweekt met behulp van ons protocol van DIV 11 tot 18 DIV. Het is duidelijk uit de beelden die de neuronen hebben uitgebreide processen ontwikkeld en dat de dendritische processen dicht zijn bedekt met dendritische spines, aanwijzingen dat deze neuronen zijn gezond in cultuur. Onze cultuur protocol kan ook gebruikt worden voor andere types van neuronen in de hersenen. Zo hebben we onlangs gebruikt dit protocol om cultuurstriatale medium spiny neuronen in een studie om dopamine D2 receptor (DRD2) inbrengen onderzoeken in gekweekte muis striatale medium spiny neuronen 9. Figuur 2 toont de muis striatale medium spiny neuronen gekweekt met behulp van ons protocol bij DIV 8. We hebben ook met succes uitgevoerd TIRF beeldvorming van superecliptic pHluorin-gelabeld DRD2s in dit type neuron. Figuur 3 toont expressie van pHluorin-gelabeld DRD2 (pH-DRD2) in een medium doornige neuronen en visualisatie van pH-DRD2 insertie in deze neuron. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig1.jpg" /> Figuur 1. Mouse hippocampus culture met behulp van de interface kweekmethode. DIV: dagen in vitro, de dag van de cultuur wordt beschouwd als DIV 0. Van de beelden, is het duidelijk dat hippocampale neuronen mature in dit type cultuur tussen 11 en DIV DIV 15. Bij DIV 11 en 13, zijn neuronale dendrieten bedekt met filipodia en onvolwassen stekels. Bij DIV 15 en18, zijn neuronale dendrieten bedekt met grote stekels, een indicatie van meer volwassen neuronen. Links panelen: laag vergroting beelden van de muis hippocampale neuronen op verschillende leeftijden. Rechts panelen: sterk vergrotende afbeeldingen (inzoomen op de neuronale dendrieten van het linkervenster) van neuronale dendritische processen met dendritische spines op verschillende leeftijden. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig2.jpg" /> Figuur 2. Mouse striatale medium spiny neuron cultuur met behulp van de interface kweekmethode. Neuronen in de beelden zijn op DIV 8. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig3.jpg" /> Figuur 3. Een muis striatale medium spiny neuron getransfecteerd met super ecliptica pHluorin-gelabeld dopamine D2 receptor (pH-DRD2). Afbeelding links is maximale intensiteit projectie van een time-lapse-opname (600 afbeeldingen, 100 msec per beeld). Witte pijlen geven individuele vesiculaire insertie van pH-DRD2. Dit beeld blijft inbrengen informatie in het xy dimensie, maar verliest de tijd informatie. Beeld aan de rechterkant toont yt maximale intensiteit projectie, waarbij de XYT stapel 90 graden gedraaid rond de y-as en de maximum pixel op elke x-as lijn geprojecteerd op een y-as pixel. Deze afbeelding behoudt inbrengen informatie langs de as yt maar verliest de x-as informatie.

<ol><li>Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylation+by+DHHC5%2F8+targets+GRIP1+to+dendritic+endosomes+to+regulate+AMPA-R+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Palmitoylation by DHHC5/8 targets GRIP1 to dendritic endosomes to regulate AMPA-R trafficking.</a> Neuron. 73, 482-496 (2012).</li>
<li>Anggono, V., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+AMPA+receptor+trafficking+and+synaptic%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic.</a> Curr. Opin. Neurobiol. , (2012).</li>
<li>Makuch, L., Volk, L., Anggono, V., Johnson, R. C., Yu, Y., Duning, K., Kremerskothen, J., Xia, J., Takamiya, K., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+AMPA+receptor+function+by+the+human+memory-associated+gene+KIBRA%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regulation of AMPA receptor function by the human memory-associated gene KIBRA.</a> Neuron. 71, 1022-1029 (2011).</li>
<li>Thomas, G. M., Lin, D. T., Nuriya, M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+bi-directional+regulation+of+AMPA+receptor+phosphorylation+and+trafficking+by+JNK%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Rapid and bi-directional regulation of AMPA receptor phosphorylation and trafficking by JNK.</a> EMBO J. 27, 361-372 (2008).</li>
<li>Lin, D. T., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PICK1+and+phosphorylation+of+the+glutamate+receptor+2+%28GluR2%29+AMPA+receptor+subunit+regulates+GluR2+recycling+after+NMDA+receptor-induced+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">PICK1 and phosphorylation of the glutamate receptor 2 (GluR2) AMPA receptor subunit regulates GluR2 recycling after NMDA receptor-induced internalization.</a> J. Neurosci. 27, 13903-13908 (2007).</li>
<li>Hayashi, T., Rumbaugh, G., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+AMPA+receptor+subunit+trafficking+by+palmitoylation+of+two+distinct+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of AMPA receptor subunit trafficking by palmitoylation of two distinct sites.</a> Neuron. 47, 709-723 (2005).</li>
<li>Lin, D. T., Makino, Y., Sharma, K., Hayashi, T., Neve, R., Takamiya, K., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+AMPA+receptor+extrasynaptic+insertion+by+4.1N%2C+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Regulation of AMPA receptor extrasynaptic insertion by 4.1N, phosphorylation.</a> 12, 879-887 (2009).</li>
<li>Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+insertion+of+the+AMPA+receptor+GluA2+subunit+is+regulated+by+NSF+binding+and+Q%2FR+editing+of+the+ion+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 11080-11085 (2010).</li>
<li>Li, Y., Roy, B. D., Wang, W., Zhang, L., Zhang, L. F., Sampson, S. B., Yang, Y. P., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Two+Functionally+Distinct+Endosomal+Recycling+Pathways+for+Dopamine+D2+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification of Two Functionally Distinct Endosomal Recycling Pathways for Dopamine D2 Receptor.</a> Journal of Neuroscience. , (2012).</li>
<li>Yu, Y. J., Dhavan, R., Chevalier, M. W., Yudowski, G. A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+delivery+of+internalized+signaling+receptors+to+the+somatodendritic+surface+by+sequence-specific+local+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rapid delivery of internalized signaling receptors to the somatodendritic surface by sequence-specific local insertion.</a> J. Neurosci. 30, 11703-11714 (2010).</li>
<li>Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+modes+of+regulated+receptor+insertion+to+the+somatodendritic+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct modes of regulated receptor insertion to the somatodendritic plasma membrane.</a> Nat. Neurosci. 9, 622-627 (2006).</li>
<li>Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., Leonoudakis, D., Panicker, S., Thorn, K. S., Beattie, E. C., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+discrete+exocytic+events+mediating+surface+delivery+of+AMPA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors.</a> J. Neurosci. 27, 11112-11121 (2007).</li>
<li>Ashby, M. C., De La Rue, S. A., Ralph, G. S., Uney, J., Collingridge, G. L., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+AMPA+receptors+%28AMPARs%29+from+synapses+is+preceded+by+transient+endocytosis+of+extrasynaptic+AMPARs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Removal of AMPA receptors (AMPARs) from synapses is preceded by transient endocytosis of extrasynaptic AMPARs.</a> J. Neurosci. 24 (AMPARs), 5172-5176 (2004).</li>
<li>Kopec, C. D., Real, E., Kessels, H. W., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GluR1+links+structural+and+functional+plasticity+at+excitatory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GluR1 links structural and functional plasticity at excitatory synapses.</a> J. Neurosci. 27, 13706-13718 (2007).</li>
<li>Makino, H., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+receptor+incorporation+into+synapses+during+LTP%3A+the+role+of+lateral+movement+and+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis.</a> Neuron. 64, 381-390 (2009).</li>
<li>Makino, H., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+versus+global+synaptic+plasticity+on+dendrites+controlled+by+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized versus global synaptic plasticity on dendrites controlled by experience.</a> Neuron. 72, 1001-1011 (2011).</li>
<li>Wang, Z., Edwards, J. G., Riley, N., Provance, D. W., Karcher, R., Li, X. D., Davison, I. G., Ikebe, M., Mercer, J. A., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+Vb+mobilizes+recycling+endosomes+and+AMPA+receptors+for+postsynaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Myosin Vb mobilizes recycling endosomes and AMPA receptors for postsynaptic plasticity.</a> Cell. 135, 535-548 (2008).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+receptor+trafficking+by+using+alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Om onbekende redenen, de muis neuronen zijn altijd moeilijker te cultuur dan rat neuronen. In onze ervaring, een mengcultuur van neuronen en glia werkt goed voor primaire gekweekte muis neuronen. Een dergelijke mengcultuur is niet geschikt voor TIRF imaging experimenten, zoals in type cultuur neuronen en hun processen trendmatig bovenop gliacellen, situeren de neuronale somata en dendritische processen buiten het bereik van TIRF microscopie. Derhalve een lagere dichtheid neuronale cultuur met weinig glia op het dekglaas...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Naam van de Reagens</strong</td&gt;<td<strong&gt; Bedrijf</strong</td&gt;<td<strong&gt; Catalogus Nummer</strong</td&gt;<td<strong&gt; Opmerkingen</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Gezuiverd bovine collageenoplossing (Purecol)</td&gt;<td&gt; Geavanceerd Biomatrix</td&gt;<td&gt; 5005-B</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Balanced Salt Hank&#39;s Solution (HBSS)</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 14185-045</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Penicilline-streptomycine (Pen Strep)</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 15140-122</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Natriumpyruvaat</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 11360-070</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM High Glucose</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 10313-021</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Foetaal runderserum (FBS)</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Glutamax</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 35050-061</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Papaïne</td&gt;<td&gt; Worthington Biochemical Corp</td&gt;<td&gt; LS003126</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Deoxyribonuclease I van runderpancreas (DNase I)</td&gt;<td&gt; SIGMA</td&gt;<td&gt; DN25-10MG</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Dulbecco&#39;s fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS)</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 14190-144</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 0,05% trypsine</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 25300-054</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Poly-l-lysine hydrobromide</td&gt;<td&gt; SIGMA</td&gt;<td&gt; P2636-1G</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Boorzuur</td&gt;<td&gt; Fisher-Wetenschappelijke</td&gt;<td&gt; BP 168 tot 500</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Neurobasal Medium</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 21103-049</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; B-27 serumvrij Supplement</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 17504-044</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Warmte inactief paardenserum</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 26050-070</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Lipofectamine 2000</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11668 019</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; HEPES</td&gt;<td&gt; Fisher-Wetenschappelijke</td&gt;<td&gt; BP310-500</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cultuur invoegen</td&gt;<td&gt; Millipore</td&gt;<td&gt; PICM03050</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

imaging phluorin-tagged receptor invoegen in op het plasmamembraan in primaire gekweekte muis neuronen

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

Een beter begrip van de mechanismen die receptor handel tussen de plasmamembraan (PM) en intracellulaire compartimenten vereist een experimentele benadering met een uitstekende ruimtelijke en temporele resoluties. Bovendien moeten deze benadering ook de mogelijkheid aan receptoren gelokaliseerd op de PM dan in intracellulaire compartimenten onderscheiden. Vooral detecteren receptoren in een vesicle heeft uitstekende detectiegevoeligheid, aangezien elke vesicle draagt ​​slechts een klein aantal receptoren. Standaardbenaderingen voor de behandeling receptor handel zijn oppervlak biotinylering gevolgd door biochemische detectie, die zowel de vereiste ruimtelijke en temporele resolutie mist en fluorescentiemicroscopie onderzoek immunolabeled oppervlakte receptoren, die chemische fixatie van cellen vereist en daardoor ontbreekt voldoende tijdsresolutie 1-6. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben wij en anderen ontwikkeld en gebruikt een nieuwe stragie waarmee visualisatie van de dynamische invoeging van receptoren in de PM met uitstekende ruimtelijke en temporele resolutie 7-17. De aanpak omvat tagging van een pH-gevoelige GFP, de superecliptic pHluorin 18, de N-terminale extracellulaire domein van de receptoren. Superecliptic pHluorin heeft de unieke eigenschap dat bij neutrale pH fluorescerende en niet-fluorescerende bij zure pH (pH &lt;6,0). Dus de gelabelde receptoren niet fluorescerende wanneer binnen de zure lumen van intracellulair verkeer blaasjes of endosomale compartimenten en zij gemakkelijk zichtbaar wanneer blootgesteld aan de extracellulaire neutrale pH omgeving op het buitenoppervlak van de PM. Onze strategie laat hiermee ons PM oppervlakte receptoren onderscheiden van die in intracellulair verkeer blaasjes. Om voldoende ruimtelijke en temporele resolutie, en de gevoeligheid vereist om dynamische handel receotiren bereiken gebruikten we totale interne weerspiegelenion fluorescentiemicroscopie (TIRFM), waardoor we de optimale ruimtelijke resolutie van optische beeldvorming (~ 170 nm) bereiken, tijdsresolutie van de video-rate microscopie (30 frames / sec), en de gevoeligheid te detecteren fluorescentie van een GFP molecule. Door beeldvorming pHluorin-gelabeld receptoren onder TIRFM, waren we in staat om direct te visualiseren individuele receptor inbrengen gebeurtenissen in de PM in gekweekte neuronen. Deze imaging benadering kan mogelijk worden toegepast op elk membraan proteïne met een extracellulair domein dat kan worden gelabeld met superecliptic pHluorin, en dissectie van de belangrijkste gedetailleerde mechanismen voor het inbrengen van verschillende membraaneiwitten (receptoren, ionenkanalen, transporters, enz.), zodat de PM.

Tagging door de extracellulaire domeinen van membraanreceptoren met superecliptic pHluorin, en imaging deze fusie-receptoren in gekweekte muis neuronen, kunnen we direct visualiseren individuele vesiculaire inbrengen gebeurtenissen van de receptoren aan het plasmamembraan. Deze techniek zal instrumenteel ophelderen van de moleculaire mechanismen voor insertie receptor naar de plasmamembraan.

Imaging pHluorin-tagged Receptor invoegen in op het plasmamembraan in primaire gekweekte muis neuronen

Een beter begrip van de mechanismen die het transport van receptoren tussen het plasmamembraan (PM) en intracellulaire compartimenten reguleren, vereist een ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om neuronale receptoren te visualiseren terwijl deze worden ingebouwd in het plasmamembraan van gecultiveerde primaire muisneuronen. Hiervoor worden muis-GL verkregen uit de cerebrale cortex van embryonale of neonatale muizen en gekweekt op semi-permeabele, met collageen gecoate cultuurinserts. De gliale culturen worden boven primaire embryonale hippocampale neuronen op dekglasplaatjes gesuspendeerd.Na zeven dagen conditionering worden de neuronen vervolgens getransfecteerd met een dopamine D2-receptor gelabeld met super ecliptic fluorine. De gelabelde receptor lokaliseert naar intracellulaire blaasjes, maar blijft niet-fluorescerend binnen de zure omgeving van de blaasjes. Wanneer het blaasje echter fuseert met het plasmamembraan, wordt het fluorine blootgesteld aan de neutrale pH van de extracellulaire omgeving en fluoresceert het helder, wat detectie via total internal reflection fluorescence microscopy mogelijk maakt.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van membraaneiwittransport, waardoor we het transport van alle membraaneiwitten kunnen visualiseren die met fluoroforen gelabeld kunnen worden, zoals glutamaatreceptoren en G-eiwitgekoppelde receptoren. De procedure wordt vandaag samen met mij gedemonstreerd door breeding dry and, and we one, twee andere leden van onze onderzoeksgroep. De dag vóór de dissectieprocedure worden T 75-flesjes met collageenoplossing rechtop gezet en gedurende de nacht gedroogd. Op de dag van de gliale cultuur wordt het gliale medium gedurende ten minste 30 minuten opgewarmd in een waterbad van 37 °C. Na euthanasie worden de cerebrale cortices van embryonale of neonatale muizen onder een dissectiemicroscoop gedissecteerd.Plaats de verwijderde cortices in een conische buis van 15 milliliter gevuld met ijskoud, kunstmatig cerebrospinaal vocht, of A CSF. Verwijder vervolgens alle A CSF behalve twee milliliters en voeg 100 microliters pepane-oplossing en 20 microliters 1%DNAs.One toe. Plaats de buis in een waterbad van 37 degrees Celsius en laat het weefsel 20 minuten verteren.Was na de digestie de hersenweefsels zorgvuldig door de propanoplossing voorzichtig te verwijderen en 10 milliliters voorverwarmd gliaal medium toe te voegen. Verwijder vervolgens zoveel mogelijk van het gliaal medium, waarbij u erop let het weefsel niet te verstoren.Voeg twee milliliter vers gliaal medium toe en pipetteer, met behulp van een vuurgepolijste glazen pipette, driemaal tot het weefsel niet langer zichtbaar is. Vermijd de vorming van bellen zodra het weefsel volledig is gedissocieerd. Voeg nog eens acht milliliter vers gliaal medium toe en pipetteer de suspensie door een 70 micron cell strainer.Vang de doorstroom op in een conische buis van 50 milliliter. Breng de gedissocieerde cellen van twee tot drie embryo's over naar een collageen-gecoate T 75-fles en kweek deze gedurende de nacht bij 37 graden Celsius in een weefselkweekincubator; aspireer de volgende dag het medium. Spoel de cellen eenmaal met 10 milliliter PBS.Voeg vervolgens 10 tot 15 milliliters vers glia-medium toe aan elke kolf. Incubeer de culturen gedurende 10 tot 12 dagen en ververs het medium elke drie tot vier dagen. Zodra de cellen confluent zijn, spoel je de gliale cellen af met PBS.Voeg vervolgens vijf milliliter 0,05% tripsin toe aan de kolf en laat de cellen vijf minuten lang loslaten bij 37 °C. Voeg na deze korte incubatie gliaal medium toe en pipetteer om de GL van de bodem van de kolf los te maken. Verdeel de cellen over twee nieuwe met collageen gecoate T 75 kolven.Zodra deze confluentie bereiken, worden ze zoals voorheen getrypsiniseerd en wordt de inhoud van elke kolf gezaaid in zeswellplaten die cultuurinserts bevatten die zijn gecoat met collageen. Plaats deze over twee milliliters gliaal medium en kweek de cellen gedurende één tot zeven dagen. Deze gliale cultuurinserts zullen worden gebruikt om de neuronale culturen te conditioneren.Voeg vier milliliters platingmedium toe aan elke put van een sixwellplaat met gereinigde, met polylysine gecoate dekglasjes en plaats de plaat gedurende de nacht in een incubator van 37 °C. Deze stap verhoogt de kans op overleving van neuronen, hoogstwaarschijnlijk door het verwijderen van residuen van polylysine op de volgende dag. Verwijder het platingmedium en vervang dit door twee milliliters vers platingmedium.Medium met 2% van het medium. Supplement B 27 voor de kweek van hippocampale neuronen. Disseceer onder een dissectiemicroscoop de hippocampi uit het hersenweefsel van vier embryonale muizen van E 15 tot 18. Plaats de hippocampi in een conische buis van 15 milliliter met ijskoud dissectiebuffer.Dissekeer vervolgens het striatum uit het hersenweefsel van drie embryonale muizen van E 15 tot 18 en plaats deze in een aparte conische buis van 15 milliliter met ijskoud dissectiebuffer. Verteer het weefsel met pepsine zoals eerder beschreven. Gebruik vervolgens een hemocytometer.Bepaal het aantal cellen in elke neuronale suspensie en zaai deze uit. Plaats 0,4 × 10⁶ cellen op elk dekglas en kweek deze gedurende één nacht in een incubator bij 37 °C. Om de gliale cultuurinserts voor te bereiden voor de conditionering van de neuronale culturen, wordt het medium uit de gliale cultuurinserts en de plaat geaspireerd en vervangen door 2 mL vers plating-medium.Plaats de volgende dag de dekglasjes met de neuronen in elke put van de schaal onder de gliale cultuurinserts in het medium. Zet de incubatie voort bij 37 °C. Vervang elke drie tot vier dagen de helft van het medium door vers, voorverwarmd voedingsmedium met B 27 totdat ze klaar zijn voor transfectie- en imagingexperimenten.Neuronen worden op dag zeven getransfecteerd en op dag acht van de kweek geïmageerd. Een consistente neuronencultuur is essentieel voor succesvolle live-imaging-experimenten. Deze figuur toont muis-hippocampale neuronen die volgens dit protocol zijn gekweekt van 11 dagen in vitro tot 18 dagen in vitro.Uit de afbeeldingen is duidelijk dat de neuronen uitgebreide uitlopers hebben ontwikkeld en dat de dendritische processen dicht bezet zijn met dendritische stekels. Indicaties dat deze neuronen gezond zijn in cultuur voor elke neuronale cultuur. Combineer 2 µL lipectomy met 2001 µg DNA dat codeert voor de dopamine D2-receptor getagd met super ecliptic Florin.Meng en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder tijdens de incubatie één milliliter van het medium van onderen en één milliliter van binnenuit elke glia-cultuurinsert en breng deze over naar dezelfde conische buis. Voeg vervolgens hetzelfde volume voedingsmedium met B 27 toe aan het bewaarde medium en incubeer bij 37 °C.Dit medium zal worden gebruikt voor neuronale kweek na transfectie, nadat de incubatie van het DNA met lipofectamine gedurende 20 minuten is voltooid. Verwijder de gliale kweekinserts uit de zes-wells platen. Voeg de 200 µL lipofectamine-DNA mengsel toe aan elk dekglas met neuronen.Voorkom dat er bellen ontstaan onder het membraan van de cultuur. Plaats de gliale cultuurinserts terug en incubeer gedurende twee tot vier uur bij 37 °C. Verwijder na de incubatie de gliale inserts opnieuw en aspireer de transfectie-oplossing uit elke well; voeg vervolgens de eerder bewaarde 2 mL medium toe aan de neuronen en plaats de gliale cultuurinserts terug.Verwijder ten slotte het glia-medium uit elke insert en voeg twee milliliter van het bewaarde medium toe aan elke cultuur. Laat de cellen nog 24 tot 72 uur incuberen om expressie van het getransfecteerde CD NA mogelijk te maken. Het TIRF-beeldvormingssysteem dat in deze video wordt gebruikt, is een op maat gemaakte opstelling met een cyaan laser van 100 milliwatt voor excitatie en een electron multiplying charge coupled device-camera als detector. Warm 30 minuten voor aanvang van de beeldvorming de A CSF op tot 37 °C in een waterbad. Zet daarnaast de laser, de camera en de verwarmingsinsert aan en plaats de verwarmingsinsert op de microscooptafel.Plaats een dekglas met getransfecteerde neuronen in een live-imagingkamer en voeg snel voorverwarmde A CSF toe. Plaats de kamer op de verwarmingsinzet op de microscooptafel in de epifluorescentie-imagingmodus en identificeer de getransfecteerde neuronen. Fotobleek vervolgens de neuronen gedurende één minuut in de TIRF-imagingmodus om eventuele bestaande fluorescente signalen op het plasmamembraan te elimineren.Stel vervolgens de gain-instelling van de elektronenvermenigvuldiger op de E-M-C-C-D-camera in op maximaal en begin met het maken van beelden gedurende één minuut bij 10 hertz. Elke opname zal 600 beelden bevatten zodra alle beeldvorming is voltooid. Analyseer de gegevens met Image J om de membraaninsertie van de dopamine D2-receptor te bepalen.Een medium spiny neuron uit de nucleus accumbens van een muis werd getransfecteerd met super-elliptisch fluorine-gelabelde dopamine D2-receptor (PDR D2). Vervolgens werd live TIRF-imaging uitgevoerd, waarbij 600 beelden werden opgenomen met een snelheid van één beeld per 100 milliseconden. Deze afbeelding toont de maximale intensiteitsprojectie van de time-lapse opname; witte pijltjes geven aan waar individuele blaasjes die pH D2 bevatten zijn gefuseerd met het plasmamembraan.Deze afbeelding toont de YT-maximale intensiteitsprojectie, waarbij de XYT-stack 90 graden is gedraaid rond de Y-as en de maximale pixel op elke X-aslijn wordt geprojecteerd op een enkele y-aspixel. Om informatie te geven over de tijdlijn van insertie, tonen deze gegevens aan dat deze methode succesvol kan worden ingezet om de regulatie van de insertie van receptoren in het plasmamembraan van gekweekte muisneuronen na hun ontwikkeling te onderzoeken. Deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van neuronale receptortransport om de regulatie van andere neurono-plasmamembraanreceptoren, kanalen en transporters te verkennen.

imaging-phluorin-tagged-receptor-insertion-to-plasma-membrane-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn om te ontleden, transfecteren via elektroporatie en cultuur muis hippocampus en corticale neuronen. Op korte termijn culturen kan worden gebruikt voor studies van axon uitgroei en begeleiding, terwijl de lange-termijn culturen kunnen worden gebruikt voor onderzoek naar synaptogenese en dendritische rug analyse.

Nucleofection en Primaire Cultuur van de embryonale Mouse hippocampus en de corticale neuronen

Dit rapport beschrijft het gebruik van live cell imaging en photobleach technieken om de oppervlakte-expressie, transportroutes en handel in kinetiek van exogeen uitgedrukt, pH-gevoelige GFP-gelabelde eiwitten in de plasmamembraan van neuronen te bepalen.

Laterale diffusie en Exocytose van membraaneiwitten in gekweekte zenuwcellen gemeten met behulp van Fluorescence Recovery en fluorescentie-verlies fotobleken

Source: Schönherr, S., et. al. Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the immunolabelling of freeze-fractured replicas of mouse brain tissue for electron microscopy. The fractured and coated replicas are digested to expose receptors. Primary and gold-tagged secondary antibodies are added to label specific neuronal membrane receptors. The replica...

Immunolabeling of Neuronal Membrane Proteins in a Freeze-fractured Specimen of Mouse Brain Tissue

Source: Lacin, E., et al. Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates a technique for imaging neurotransmitter release in vivo using cell-based neurotransmitter fluorescent engineered reporters (CNiFERs), specialized reporter cells pre-injected into the mouse cortex. Positioned under a two-photon microscope, the mouse allows visualization of...

Imaging Neurotransmitter Release Using Cell-Based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters

Hier wordt een procedure gepresenteerd om selectief een neuronaal eiwit te activeren met een korte lichtpuls door genetisch een foto-reactieve onnatuurlijke aminozuur te coderen in een doelneuronaal eiwit dat tot expressie wordt gebracht in neuronen in cultuur of in vivo.

Optische controle van een neuronaal proteïne met behulp van een genetisch gecodeerde Onnatuurlijke aminozuren in neuronen

Labelen van de extracellulaire domein van een membraaneiwit met een pH-gevoelige fluorofoor, superecliptic pHluorin (SEP), maakt lokalisatie, expressie en mensenhandel worden bepaald. Imaging september-gemerkte eiwitten met totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM) maakt de kwantificering van eiwitniveaus in de perifere ER en plasmamembraan.

Gebruik makend van pHluorin-gelabeld receptoren Monitor subcellulaire lokalisatie en handel

Hier wordt een protocol bij het onderzoeken van de vroege effecten van amyloid-β (Aβ) in de hersenen gepresenteerd.  Dit toont aan dat Aβ clathrin-gemedieerde endocytose en ineenstorting van axonale groei kegels induceert. Het protocol is nuttig bij het bestuderen van de vroege effecten van Aβ op axonale groei kegels en preventie van de ziekte van Alzheimer kan vergemakkelijken.

Visualiseren van axonale groei Cone ineenstorting en vroege amyloïde β effecten in gekweekte muis neuronen

In dit rapport beschrijven we een eenvoudig protocol voor het bestuderen van neuriet uitgroei in embryonale rat corticale neuronen door co-transfecting met EGFP en het eiwit van belang.

Een verbeterde groene fluorescentie proteïne-gebaseerde assay voor het bestuderen van neuriet uitgroei in primaire neuronen

Hier presenteren we een protocol om in vitro Ca2+ fluxen in midbrain neuronen en hun downstream effecten op caspase-3 met behulp van primaire muis midbrain culturen te meten. Dit model kan worden gebruikt om pathofysiologische veranderingen in verband met abnormale Ca2 + activiteit in midbrain neuronen te bestuderen, en om nieuwe therapieën voor anti-apoptotische eigenschappen te screenen.

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes en hun downstream effecten in primaire muis midbrain neuronen

Hier beschrijven we een protocol dat adeno-geassocieerde virusinjectie combineert met craniale raamimplantatie voor gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamiek en neuronale activiteit bij wakkere muizen.

Gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamica en neuronale activiteit bij wakkere muizen

Leer de visualisatie van receptorinsertie in het plasmamembraan van primaire gekweekte muishippocampusneuronen met behulp van pHluorin-tagged dopamine D2-receptoren en TIRF-microscopie.

Imaging pHluorin-tagged Receptor invoegen in op het plasmamembraan in primaire gekweekte muis neuronen

Meer video's verkennen