Name: Detectie van eiwit palmitoylering in gekweekte hippocampale neuronen door immunoprecipitatie en Acyl-Biotin Exchange (ABE) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 33 s
Description: Leer palmitoylering detecteren in gekweekte hippocampale neuronen met immunoprecipitatie en Acyl-Biotin Exchange. Deze biochemische methode biedt hogere gevoeligheid voor eiwittrafficking onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door subsidies van Canadese Institutes of Health Research MOP-81158.

1. Extractie van Target Eiwit van gekweekte primaire hippocampale neuronen <ol><li> Voor de oogst endogene eiwit van primaire hippocampale cellen, bereid een Lysis Buffer (LB; tabel 1) met proteaseremmers. Aan 10 ml lysisbuffer, voeg 0,1 ml oplossing phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) tot een eindconcentratie van 10 mM en voeg 1 protease inhibitor cocktail tablet. </li><li> Voorbereiden N-ethylmaleimide (NEM) oplossing (Tabel 1) van gevriesdroogd poeder. Voorzichtig los op in 100% EtOH bij kamertemperatuur (RT). Altijd bereid NEM oplossing vers voor de dag van het experiment. </li><li> Vervolgens combineren lysisbuffer en NEM. Voeg 0,5 ml van 2M oplossing NEM een verse 50 ml conische buis. Voeg 20 ml LB top boven, wordt snel LB + NEM (eindconcentratie van 50 mM) op een schommelende platform bij 4 ° C volledig mengen gedurende 5 minuten. Voeg altijd NEM / EtOH oplossing eerst en LB tweede terdege de twee te mengen. </li><li> Verwijder gekweekte neuronen van incubator en plaats op ijs *. Verwijder cellulaire media en voorzichtig tweemaal wassen met koude fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) 1x. Voeg 300 ml LB + 50 mM NEM tot de eerste bron van hippocampale neuronen, en schraap cellen met behulp van een wegwerp cel lifter. Verzamel de cellysaat, vervolgens lozen het lysaat in de volgende bron van die groep. Schraap cellen in de tweede put met behulp van de cel lifter, verzamelen, en herhaal behulp van een derde goed, als nodig is om verder te concentreren het lysaat. </li><li> Verzamel cellysaat in een voorgekoeld (op ijs), 1,5 ml microcentrifugebuis. Herhaal stap 1.4 met gebruikmaking van 100 pi LB + 50 mM NEM alle resterende cellysaat verzamelen. Pass totale cellysaat door middel van een 26 ½ meter spuit 5-6 keer om te helpen bij de mechanische lysis, zorg dat de niet bellen blazen in de oplossing. Men kan in plaats Sonificeer 15 sec op ijs, wanneer apparatuur beschikbaar. Nutate cellysaat voor ≥ 30 min bij 4 ° C. </li><li> Verduidelijking van de cel Lysate door centrifugeren bij 16.000 xg / 30 min, om pellet niet-gelyseerde cellen en detergent onoplosbaar materiaal. </li><li> Verzamel gewist cellysaat (supernatant) in een nieuwe pre-gekoelde 1,5 ml buis op ijs. Herhaal oogst protocol voor alle groepen van cellen. Maatregel eiwitconcentratie in alle lysaatmonsters met BCA assay en normaliseren het volume van alle lysaatmonsters van groepen van cellen precies gelijke totale eiwitten hebben met een aanbevolen minimum van 500 ug. Vul alle monsters met LB + 50 mM NEM tot 500 ul totaal volume. </li><li> Voeg 1-5 ug primair antilichaam gericht tegen het doeleiwit aan elk lysaat monster. Nutate het antilichaam-lysaat gemengd monsters overnacht bij 4 ° C. </li></ol> Primaire rat hippocampale neuronen worden gekweekt bij een dichtheid van ca. 250.000 cellen / putje in een 6-wells schaal, in een serumvrij medium met een B27 supplement neuronale, zoals eerder beschreven 5 en gekweekt voor het verlangend tijd, meestal 14-16 dagen in vitro (DIV) tot rijpheid bereiken. Een minimum van 500 ug totaal eiwit wordt aanbevolen om succesvol immunologisch en een doelwit eiwit neuronale die gewoonlijk Hiervoor zijn 2-3 putjes van een 6-wells schaal biotinyleren. 2. Precipitatie van antilichaam gebonden doeleiwit <ol><li> Voor neerslaan en immobiliseren van een doeleiwit Bereid een 50% suspensie van proteïne A of proteïne G sepharose beklede kralen. Specifiek voeg ≥ 60 pl sepharose korrels per monster naar 1,5 ml buisjes, zodat alle monsters evenveel kralen hebben. Magnetische kralen zijn ook geschikt als het materiaal beschikbaar is. </li><li> Voeg een gelijk volume van 50% slurry aan elk antilichaam-lysaat monster en nutate ≥ 1 uur bij 4 ° C. </li></ol> 3. Acyl-Biotine Exchange: hydroxylamine (HAM) Cleavage <ol><li> Hoewel het uitvoeren van stap 2.2, stelt een aantal buizen met lysis buffer (LB) diandere kleur heeft pH&#39;s. De pH is zeer belangrijk voor deze stappen en dienen te worden bijgesteld met behulp van een pH meter. Bereid 2 ml LB pH 7,2 per monster, en 0,5 ml van strenge Buffer per monster (Tabel 1). Bereid ook 0,5 ml LB + 10 mM NEM per monster, zoals in de stappen 1,1-1,3. Voeg PMSF en protease inhibitor tabletten alle lysis buffers, zoals in stap 1.1. </li><li><ol class="lalpha"><li> Hydroxylamine (HAM) is een krachtig reductiemiddel, waarvan splitsing van palmitaat uit cysteines vereist voor biotinylering (figuur 1), en het weglaten van het HAM splitsing dient als negatieve controle. Splitsen elk monster van kralen in twee monsters, een weglaten van het HAM klieving (-HAM) en een onder de HAM stap (+ HAM). Normaliseren van eiwitafbraak door HAM behandeling moet men elk monster gesplitst in drieën met 1/3 van de korrels voor de HAM-control en de overige 2/3 voor de + HAM behandeling. </li><li> Bereid extra 1.5 ml buizen op ijs, aangeduid als de HAM-controle voor elk monster. Na stap 2,2 voorzichtig alle monsters &#39;beads gecentrifugeerd bij 0,5 xg / 1 min bij 4 ° C (centrifuge met deze snelheid, duur en temperatuur voor alle overige stappen tenzij anders vermeld), de buizen op ijs, de bovenstaande vloeistof, en resuspendeer de kralen in 600 ul van LB + 10 mM NEM. </li></ol></li><li> Na opnieuw schorsing van de monsters &#39;parels in lysisbuffer + NEM 10 mM, onmiddellijk verzamelen 200 ul lysaat-kraal het monster slurry, en lozing in dat monster-HAM buis op ijs. Een extra 300 pi LB + 10 mM NEM de HAM-sample en een extra 100 ul het HAM + monster voor een totaal van 500 pi in elk monster. Incubeer de buizen gedurende 10 minuten op ijs. </li><li> Re-schorten (wassen) de-HAM en + HAM monsters voorzichtig met 0,5 ml strenge buffer, per monster. Snel uitvoeren van deze stap, omdat een langere incubatie SDS zal resulteren in de verwijdering van gebonden antilichaam van hetkralen. </li><li> Voorzichtig wassen alle monsters driemaal in 0,5 ml / monster van LB pH 7,2, en spin neer tussen wasbeurten als in stap 3.2b. </li><li> Hoewel het uitvoeren van stap 3.5, stelt een HAM buffer (tabel 1). Voeg het juiste volume van hydroxylamine oplossing naar een nieuwe buis, tot een eindconcentratie van 1 M bereiken in een volume van 0,5 ml LB pH 7,2, per + HAM monster. Altijd de voorbereiding van de HAM buffer vers voor de dag van het experiment. Voeg 0,5 ml / monster van LB pH 7,2 tot all-HAM samples en 0,5 ml / monster aan HAM buffer om alle monsters + HAM. </li><li> Nutate alle monsters gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (RT). Neem niet meer dan 1 uur. </li></ol> 4. Acyl-Biotine Exchange: Biotine-BMCC Labeling <ol><li> Hoewel het uitvoeren van stap 3.6, bereiden van 2 ml LB pH 6,2 per monster (Tabel 1), in stap 3.1. Plaats de LB pH 6,2 op ijs tot gebruik. Meteen ook een voorraadoplossing bereid van biotine-BMCC (tabel 1) voor gebruik. Weeg exactgevoerd 2,1 mg biotine-BMCC, verzamelen in een 1,5 ml buis, en zachtjes in 0,5 ml Dimethylsulfoxide (DMSO) op te lossen door het toestel op een schommelstoel platform bij kamertemperatuur, tot 8mm concentratie (gebruik geen pipet te breken van de poeder te bereiken ). </li><li> Zodra stap 3.6 is voltooid, voorzichtig een keer wassen van de beads in pH 6,2 lysisbuffer, om residueel HAM buffer te verwijderen. Verwijder het supernatant en plaats de monsters op ijs. </li><li> Biotine-BMCC een maliemide geconjugeerd biotinemolecuul dat een hoge affiniteit voor vrije thiolgroepen van cysteïnes (Figuur 1). Hoewel het uitvoeren van stap 4.2, bereiden 0,5 ml biotine-BMCC Buffer (tabel 1) per monster op werkconcentratie van 0,5 uM tot 5 uM. Concentraties dan 5 uM waarschijnlijk het doeleiwit 6 verzadigen, en typisch niet worden overschreden, dit kan echter verschillen afhankelijk van de gewenste doeleiwit. Voeg 0,5 ml van biotine-BMCC buffer aan elk monster en nutate precies 1 uur bij 4 &amp;deg; C. Neem niet meer dan 1 uur. </li></ol> 5. Elutie van biotine-geconjugeerd doeleiwit en SDS-PAGE <ol><li> Zodra stap 4.3 is voltooid, voorzichtig een keer wassen alle monsters in LB pH 6,2. Houd alle monsters op ijs in tussen de wasbeurten. Verwijder 2x SDS monsterbuffer zonder reducerend middel (Tabel 1) van -20 ° C opslag en langzaam ontdooien op ijs. </li><li> Voorzichtig wassen monsters drie keer in LB pH 7,5 + PMSF / remmers, en de monsters op ijs in tussen de wasbeurten te houden. </li><li> Verwijder het supernatant van de derde wassing, waardoor de gepelleteerde beads in een slurry met resterende buffer in de bodem van de buis. Dompel een pipet met een kleine diameter tip (een gel laad tip of P2 pipetpunt voldoende) in de bodem van de buis door de slurry, en snel verzamelen alle resterende buffer, en let niet op te nemen elke kralen. </li><li> Aanvullen 2x SDS monsterbuffer met DL-Dithiothreitol (DTT) tot een eindconcentratie van 5 mM te bereiken. Toevoegen40-50 pi 2x monsterbuffer + 5 mM DTT aan elk monster. Indien nodig, vortex de korrels volledig wordt gemengd met het monster buffer, gecentrifugeerd en onmiddellijk met hoge snelheid naar alle parels in een pellet, ondergedompeld in monsterbuffer verzamelen. </li><li> Kook alle monsters gedurende 10 min bij 75-80 ° C. Laat monsters koel aan kamertemperatuur gedurende ≥ 10 minuten op de bank boven, en centrifugeer bij 16.000 xg / 3 min volledig pellet de kralen. </li><li> Voeg volledige volume geëlueerde eiwit (supernatant) van elk monster aan een baan op een polyacrylamide gel geschikt voor western blotting, met SDS-PAGE 7. Dient alle monsters zodat het HAM-control eluent en + HAM eluent voor een monster onmiddellijk grenzend aan elkaar lopen tijdens SDS-PAGE (Fig. 2). Na SDS-PAGE, naar een PVDF of nitrocellulose membraan. </li></ol> 6. Western blotting en detectie van palmitoylatie van Target Protein <ol><li> Zodra stap 5.6 is voltooid, was het membraantweemaal in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS 1x) 10 minuten op een schommelende platform bij kamertemperatuur. </li><li> Bereid een blockingbuffer niet-specifieke labeling blokkeren door weging van Bovine Serum Albumine (BSA), 3% gewicht te bereiken in een volume van TBS 1x + Tween-20 0,05% (TBS-T) die voldoende is om volledig onderdompelen membraan . Voor streptavidine blotting, altijd blokkeren met BSA en niet poedermelk. Blokkeren membraan gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een schommelende platform. </li><li> Bereid een oplossing van antilichaam TBS-T + 0,3% BSA. Voeg Streptavidine-HRP antilichaam opgelost bij 1 mg / ml in gedestilleerd water, verdund 1:5,000-1:10,000. Zodra stap 6.2 is voltooid, het membraan eenmaal wassen in TBS-T gedurende 10 min en vervolgens incuberen van het membraan in Streptavidin antilichaamoplossing op een schommelende platform voor ofwel gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C. </li><li> Was het membraan driemaal in TBS-T gedurende 10 min op een schommelende platform. Om het detecteren palmitoylatie, bloot HRP luminescentie met een chemiluminescent substraat kit. </li><li> Om te normaliseren palmitoylatie de hoeveelheid van het eiwit van belang dat werd immunologisch Strip de membraan met Western blot strippen buffer gedurende 5-10 minuten op een schommelende platform bij kamertemperatuur. Herhaal stap 6,1 tot 6,4 met het primaire antilichaam tegen het eiwit van belang dat oorspronkelijk werd gebruikt voor de immunoprecipitatie. </li><li> Kwantificeren palmitoylering van het eiwit van interesse met behulp van beeldanalyse software en normaliseren palmitoylering niveaus om de hoeveelheid immunogeprecipiteerd eiwit. </li></ol>

<ol><li>Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+palmitoylation+in+neuronal+development+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 161-175 (2010).</li>
<li>Kang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+palmitoyl-proteomics+reveals+dynamic+synaptic+palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation.</a> Nature. 456, 904-909 (2008).</li>
<li>Drisdel, R. C., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+and+quantifying+sites+of+protein+palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation.</a> Biotechniques. 36, 276-285 (2004).</li>
<li>Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylated+proteins%3A+purification+and+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Palmitoylated proteins: purification and identification.</a> Nat. Protoc. 2, 1573-1584 (2007).</li>
<li>Xie, C., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+hippocampal+and+cortical+neurons+in+a+mixture+of+MEM%2B+and+B27-supplemented+neurobasal+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Survival of hippocampal and cortical neurons in a mixture of MEM+ and B27-supplemented neurobasal medium.</a> Free Radic. Biol. Med. 28, 665-672 (2000).</li>
<li>Drisdel, R. C., Alexander, J. K., Sayeed, A., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+of+protein+palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Assays of protein palmitoylation.</a> Methods. 40, 127-134 (2006).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. W. estern <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blotting%3A+Sample+Preparation+to+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Blotting: Sample Preparation to Detection.</a> J. Vis. Exp. (44), e2359(2010).</li>
<li>Huang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+palmitoyl+acyl+transferases+exhibit+distinct+substrate+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Neuronal palmitoyl acyl transferases exhibit distinct substrate specificity.</a> FASEB J. 23, 2605-2615 (2009).</li>
<li>Noritake, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobile+DHHC+palmitoylating+enzyme+mediates+activity-sensitive+synaptic+targeting+of+PSD-95%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mobile DHHC palmitoylating enzyme mediates activity-sensitive synaptic targeting of PSD-95.</a> J. Cell Biol. 186, 147-160 (2009).</li>
<li>Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylation+by+DHHC5%2F8+Targets+GRIP1+to+Dendritic+Endosomes+to+Regulate+AMPA-R+Trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Palmitoylation by DHHC5/8 Targets GRIP1 to Dendritic Endosomes to Regulate AMPA-R Trafficking.</a> Neuron. 73, 482-496 (2012).</li>
<li>Hayashi, T., Thomas, G. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+palmitoylation+of+NR2+subunits+regulates+NMDA+receptor+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dual palmitoylation of NR2 subunits regulates NMDA receptor trafficking.</a> Neuron. 64, 213-226 (2009).</li>
<li>Ho, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-Nitrosylation+and+S-Palmitoylation+Reciprocally+Regulate+Synaptic+Targeting+of+PSD-95%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">S-Nitrosylation and S-Palmitoylation Reciprocally Regulate Synaptic Targeting of PSD-95.</a> Neuron. 71, 131-141 (2011).</li>
<li>Iwanaga, T., Tsutsumi, R., Noritake, J., Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+protein+palmitoylation+in+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic protein palmitoylation in cellular signaling.</a> Prog. Lipid Res. 48, 117-127 (2009).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De IP-ABE assay hier gepresenteerde een eenvoudige en zeer gevoelige methode voor het detecteren gepalmitoyleerd eiwitten in gekweekte primaire hippocampale neuronen meeste gebruik van standaard biochemische technieken. Dit maakt de test eenvoudig aan te passen voor laboratoria al uitgerust met western blotting materialen. De IP-ABE assay combineert een standaard protocol immunoprecipitatie te isoleren en te immobiliseren je doeleiwit, gevolgd door eerder beschreven ABE chemie 2-4 om snel niveaus van palmitaat detecteren op een substraat eiwit. De ABE techniek heeft een breed toepassingsgebied voor de behandeling gepalmitoyleerd eiwitten in verschillende weefsels en cellijnen, inclusief grootschalige palmitoyl-proteomische screening van globale palmitoylatie profielen en snelle detectie van palmitoylering niveaus van een doeleiwit. Vorige beschrijvingen van ABE chemie hebben gebruikt verschillende methoden cellysis en detergent extractie van neuronale proteins 2, 9, vrije thiol-blokkade 10, 11, biotinylering, en zuivering van het doeleiwit 4, afhankelijk van de toepassing van het experiment. De toevoeging van palmitaat aan neuronale eiwitten resulteert in hun targeting naar celmembranen, en detectie van de gepalmitoyleerde fractie van een doeleiwit vereist de extractie van deze membranen. ABE eerder beschreven methodieken gebruikt verschillende ionische 9 en niet-ionische detergenten 8 tot gewenste doeleiwitten extraheren, en het gebruik van een bepaald reinigingsmiddel afhankelijk van de doelgroep eiwit en zijn bekende membraantransport. Hier gebruiken wij de niet-denaturerende en niet-ionische detergens IGEPAL CA-630 gepalmitoyleerd eiwitten die we hebben gevalideerd voor extractie en detectie van de gepalmitoyleerde neuronale proteïne δ-catenine (figuur 2) extraheren. De structuur van IGEPAL CA-630 omvat een volumineus en stijf niet-polaire kopgroep die nietverstoren natieve eiwitconformatie of interacties, maar maakt de associatie met hydrofobe gebieden van membraan-geassocieerde eiwitten, waarbij verleent mengbaarheid en hen toelaten de winning. Vele neuronale eiwitten gelokaliseerd in de synaptische membraan of post-synaptische dichtheid van synapsen worden geëxtraheerd met IGEPAL CA-630, sommige kunnen echter niet volledig oplosbaar en kan het gebruik van een andere niet-denaturerend detergens zoals Triton X-100, die nodig is eerder gebruikt voor ABE chemie 2, 8. Verschillende beschrijvingen van ABE chemie hebben ook gebruik gemaakt van een andere thiol-reactieve biotinyleringsreagens van het molecuul hier beschreven, genaamd Biotin-HPDP (Thermo Scientific), die ook noodzakelijk een andere wijze van eiwitzuivering 4. Biotine-HPDP is een thiol-reactief, maliemide-geconjugeerde biotine molecuul dat een disulfidebinding in de linker arm maliemide bevat, structureel differentiating uit Biotin-BMCC, waarin geen dit disulfidebinding. Na thiol-biotinylering van vrije of gepalmitoyleerde een eiwit cysteïne door biotine-HPDP, kan de resulterende disulfidebinding tussen het doeleiwit en biotine groep worden gesplitst doordat reagentia om de biotine groep te verwijderen en het eiwit in zijn originele vorm regenereren, waardoor biotinylering door Biotine-HPDP voorbijgaande aard en reversibel. Daarom is het gebruik van deze biotinyleringsreagens vereist zuivering van een doeleiwit door geïmmobiliseerde avidine reagentia, zoals streptavidine bedekte korrels. Echter, thiol-biotinylering van een doeleiwit door biotine-BMCC, zoals wij hier beschreven, is stabiel en relatief permanent en vereist zuivering van het doeleiwit door een antilichaam gericht tegen het doel en geïmmobiliseerd op Sepharose kralen. Beide ABE technieken zijn eerder gebruikt voor grootschalige schermen en detectie van palmitoylering van enkele eiwitten 2, 8-10, 12 en deIP-ABE-assay we hier beschrijven is optimaal voor snelle detectie van palmitoylatie van enkele neuronale doelwit eiwitten. Een overweldigende meerderheid van de cellulaire palmitoylatie heeft betrekking op de omkeerbare toevoeging van palmitaat aan de thiolgroep van cysteines (genoemd S-palmitoylatie, die we generaliseren als &#39;palmitoylatie&#39; in dit protocol), zijn echter een zeer beperkte groep eiwitten onderworpen aan onomkeerbare palmitoylatie op glycine en cysteïneresten door de vorming van stabiele amidebindingen, genoemd N-palmitoylering 13. Een beperking van ABE chemie is het onvermogen om N-palmitoylering detecteren vanwege de stabiliteit van de amidebinding en dus screening van een nieuw doeleiwit voor palmitoylering worden bevestigd met 3H-palmitaat metabolische labeling 1. Zoals eerder vermeld kan de IP-ABE assay gemakkelijk worden aangepast voor de behandeling van palmitoylering in eiwitextracten van meerdere bronnen, waaronder transfected heterologe cellijnen, primaire weefsel, en primaire neuronale culturen uit verschillende gebieden van de hersenen. De IP-ABE assay is gebruikt voor de behandeling van palmitoylering voldoende gemuteerde cysteine ​​naar serine eiwitten om de locatie van een gepalmitoyleerd cysteine ​​langs een doeleiwit 8 geven, voor de behandeling dynamische palmitaat omzet synaptische eiwitten in gekweekte neuronen onder basale condities 10, en veranderingen in palmitoylering niveaus van neuronale eiwitten na inductie van neuronale activiteit 9. De gevoeligheid en het aanpassingsvermogen van de IP-ABE-test maakt het bij uitstek geschikt is voor de behandeling palmitoylatie profielen van neuronale eiwitten, en optimaal is voor het opsporen van dynamische veranderingen in palmitoylatie.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> IGEPAL CA-630 </td><td> Sigma </td><td> I8896 </td><td></td></tr><tr><td> PMSF </td><td> Fluka </td><td> 93482 </td><td></td></tr><tr><td> Protease Inhibitor Cocktail </td><td> Roche Compleet Mini </td><td> 11 836 153 001 </td><td></td></tr><tr><td> NEM </td><td> Sigma </td><td> E3876 </td><td></td></tr><tr><td> HAM-oplossing </td><td> Sigma </td><td> 46.780-4 </td><td></td></tr><tr><td> BCA Protein Assay Kit </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23225 </td><td> Zorgen voor compatibiliteit met de gekozen reinigingsmiddel </td></tr><tr><td> Proteïne G / A-sepharose kralen beklede </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-6.002-35 </td><td></td></tr><tr><td> Biotine-BMCC </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21900 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidine-HRP </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21126 </td><td> Reconstitueer bij 1 mg / ml in water </td></tr><tr><td> Western Blot Strippen Buffer </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21059 </td><td></td></tr></tbody></table>

detectie van eiwit palmitoylering in gekweekte hippocampale neuronen door immunoprecipitatie en acyl-biotin exchange (abe)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylering is een post-translationele modificatie lipide waarbij de bevestiging van een 16-koolstof verzadigd vetzuur, palmitaat, aan cysteïneresidu van substraateiwitten door een labiele thioesterbinding [beoordeeld in 1]. Palmitoylering van een substraat eiwit verhoogt de hydrofobiciteit, en typisch vergemakkelijkt de handel naar celmembranen. Recente studies hebben aangetoond palmitoylering een van de meest voorkomende lipide wijzigingen in neuronen 1, 2, suggereert dat palmitaat omzet een belangrijk mechanisme waarmee deze cellen regelen de targeting van eiwitten en handel. De identificatie en detectie van gepalmitoyleerde substraten derhalve beter inzicht in protein trafficking in neuronen. Detectie van eiwit palmitoylering in het verleden is technisch gehinderd door het ontbreken van een consensus sequentie tussen substraateiwitten en de afhankelijkheid van metabole Labellng van palmitoyl-eiwitten met 3H-palmitaat, een tijdrovende biochemische assay met een lage gevoeligheid. Ontwikkeling van de acyl-Biotin Exchange (ABE) assay laat sneller en hoge gevoeligheid van detectie gepalmitoyleerd eiwitten 2-4, en optimaal is voor het meten van de dynamische omzet palmitaat op neuronale eiwitten. De ABE assay bestaat uit drie biochemische stappen (Figuur 1): 1) onomkeerbare blokkade van ongemodificeerd cysteine ​​thiolgroepen met N-ethylmaliemide (NEM), 2) specifieke splitsing en ontmaskering van thiol de gepalmitoyleerde cysteine ​​groep van hydroxylamine (HAM), en 3) selectief merken van de gepalmitoyleerde cysteine ​​met een thiol-reactief biotinyleringsreagens, biotine-BMCC. Zuivering van de thiol-gebiotinyleerde eiwitten volgens de ABE stappen heeft verschilden, afhankelijk van de algemene doelstelling van het experiment. We beschrijven een werkwijze om een ​​eiwit van belang gepalmitoyleerd zuiveren primaire hippocampal neuronen door een eerste immunoprecipitatie (IP) stap met een antilichaam gericht tegen het eiwit, gevolgd door de ABE assay en western blotting om rechtstreeks palmitoylering niveaus van dat eiwit die het zogeheten IP-ABE assay. Low-density culturen van embryonale rat hippocampale neuronen zijn op grote schaal gebruikt om de lokalisatie, de functie, en de handel in neuronale eiwitten te bestuderen, waardoor ze bij uitstek geschikt voor het bestuderen van neuronale eiwitten palmitoylatie met behulp van het IP-ABE-test. De IP-ABE assay heeft vooral standaard IP en western blotting reagentia, en wordt alleen beperkt door de beschikbaarheid van antilichamen tegen het doelsubstraat. Deze test kan eenvoudig worden aangepast voor de zuivering en detectie van getransfecteerde gepalmitoyleerd eiwitten in heterologe celkweken primaire neuronale kweken die afkomstig zijn van verschillende hersenweefsels van zowel muis als rat, en zelfs primaire hersenweefsel zelf.

De IP-ABE assay detecteert specifiek thiol-palmitoylering van cysteïneresiduen langs substraateiwitten en worden gebruikt om palmitoylering van immunologisch neuronale eiwitten te detecteren op een wijze afgebeeld in figuur 1. Behandeling van de immunologisch neuronale eiwit met HAM (figuur 1) splitst de thioester koppeling tussen palmitaat en cysteine ​​thiolgroep&#39;s, waarbij specifieke opname van biotine-BMCC op de vrijgekomen thiolgroep, die vervolgens kunnen worden gedetecteerd met western blotting. Het weglaten van HAM (minus-HAM) splitsing voorkomt de opname van biotine-BMCC en fungeert als een negatieve controle voor specifieke palmitoyl-biotinilatie van de plus-HAM monster, en moet daarom altijd naast worden uitgevoerd om de plus-HAM monster voor westerse blotting door SDS-PAGE (figuur 2). In een geoptimaliseerde experiment (Figuur 2A), de palmitoyleringsignaal van de neuronale proteïne δ-catenine 2 kan gemakkelijk worden gedetecteerd door blotting voor biotine-BMCC bij een concentratie van 1 uM, met streptavidine geconjugeerd met HRP tegen parallel minus en plus-HAM samples. De specifieke palmitoylatie signaal voor δ-catenine lijkt dan het voorspelde grootte van 160kD, alleen in de plus-HAM monster. De specificiteit van dit signaal bevestigd door reprobing voor δ-catenine met het specifieke antilichaam dat oorspronkelijk werd gebruikt om immunologisch, wat resulteert in een signaal in zowel HAM behandelingen op hetzelfde voorspelde grootte. Optimalisatie van de IP-ABE assay (figuur 2A) zal resulteren in een western blotting profiel van een minus-HAM monster dat gemakkelijk te onderscheiden van de plus-HAM sample, en vertoont weinig tot geen palmitoylering signaal. De concentratie van biotine-BMCC gebruikt gepalmitoyleerd cysteines etiket vereist een zorgvuldige optimalisatie en als een super-verzadigingsconcentratie van biOtin-BMCC wordt gebruikt tijdens de ABE chemie stappen (Figuur 2B), overmatige achtergrond en niet-specifieke signalen zichtbaar. Een lineaire respons curve voor biotinylering van gepalmitoyleerde neuronale proteïne, de α7 nicotine acetylcholine receptor, gebruik van biotine-BMCC is eerder vastgesteld 6 en toont vrijwel volledige verzadiging bij een concentratie van 5-10 uM. Hoewel de optimale concentratie van biotine-BMCC zal wijken enigszins afhankelijk van de neuronale doeleiwit, zal behandeling met biotine-BMCC in een concentratie van meer dan 5 uM waarschijnlijk super-verzadigd het doeleiwit, en resulteren in een western blot profiel met zichtbare achtergrond en niet-specifieke signalen. Een concentratie van 0,5 uM voor biotine-BMCC is eerder gebruikt om palmitoylering andere neuronale eiwitten te detecteren inclusief SNAP-25, huntingtin, AMPA receptor subunits GluA1 en GluA2 en paralemmin 8 en bepaling van de optimale concentratie voor een nieuwdoeleiwit kan worden bereikt door trial and error in lineair beginnen binnen het bereik van 0,5-5 pM die hier beschreven. De resulterende streptavidine western blot profielen tussen de minus en plus-HAM monsters δ-catenine palmitoylering elkaar lijken wanneer behandeld met 4 pM biotine-BMCC (Figuur 2B), met extra achtergrondsignalen in verschillende maten, wat aangeeft dat ongepaste biotinylering heeft plaatsgevonden. Hydroxylamine is een krachtig reducerend middel dat resulteert in beperkte afbraak van het doeleiwit naast de efficiënte splitsing van thioester koppeling. Bijgevolg optimalisatie van ABE chemie vereist een tot normaliseren van de hoeveelheid immunogeprecipiteerd eiwit dat voor min-en plus-HAM monsters (stappen 3.2 - 3.3). Normalisatie vereist het gebruik van dubbele hoeveelheid geïmmobiliseerde doeleiwit in de plus-minus versus de HAM-sample, die daadwerkelijk leidt tot onderscheiden western blotting profielen voor het doeleiwit, zoals getoond voor δ-catenine (Figuur 2A, B). Indien echter de hoeveelheid geïmmobiliseerde doeleiwit niet genormaliseerd tussen minus en plus-HAM monsters, kunnen de resulterende western blot signaal voor het doeleiwit in de plus-HAM monster verloren, zoals getoond voor δ-catenine een gelijke hoeveelheid van eiwit werden gebruikt in zowel HAM behandelingen (figuur 2C). De specificiteit van ABE chemie voor het labelen van gepalmitoyleerd eiwitten is zeer gevoelig en vereist optimalisatie. De valkuilen die tijdens de IP-ABE test omvatten de sub-optimale resultaten weergegeven in figuren 2B en 2C, en degradatie van het doeleiwit onafhankelijk van HAM behandeling die typisch worden veroorzaakt door oudere reagentia en buffers en onjuiste pH. Om deze valkuilen te vermijden en te corrigeren voor suboptimale ABE chemie, de versheid en concentratie van de reagentia die voor debuffers in tabel 1 altijd te worden onderzocht, en de pH aanpassingen van de buffers altijd te worden gecontroleerd uitvoeren van de proef. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Buffer </td><td> Werkconcentratie </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Lysis Buffer (LB) </td><td> In gedestilleerd H2O: 1% IGEPAL CA-630 50 mM Tris-HCl pH 7,5 150 mM NaCl 10% Glycerol </td><td> N / A </td><td> Bereid voor experiment en bewaar bij 4 ° C </td></tr><tr><td> NEM Oplossing </td><td> In 100% EtOH: NEM gevriesdroogd poeder </td><td> 2 M </td><td> Bereid, onmiddellijk voor gebruik. </td></tr><tr><td> Strenge Buffer </td><td> In LB: 10 mM MEM 0,1% SDS </td><td> N / A </td><td> Bereid kort voor gebruik op ijs bewaren. </td></tr><tr><td> LB pH 7,2 </td><td> In LB: de pH instellen op exact 7,2 </td><td> N / A </td><td> Een pH meter om de pH onmiddellijk voor gebruik. </td></tr><tr><td> HAM Buffer </td><td> In LB pH 7,2: De oplossing HAM </td><td> 1 M (laatste HAM concentratie) </td><td> Bereid deze oplossing onmiddellijk voor gebruik. </td></tr><tr><td> LB pH 6,2 </td><td> In LB: Breng de pH precies 6,2 </td><td> N / A </td><td> Als voor LB pH 7,2 </td></tr><tr><td> De biotine-BMCC Solution </td><td> In DMSO: 2,1 mg Biotin-oplossing BMCC </td><td> 8 mM </td><td> Bereid deze oplossing onmiddellijk voor gebruik. </td></tr><tr><td> Biotine-BMCC Buffer </td><td> In LB pH 6,2: Voeg Biotine-BMCC oplossing </td><td> 1 tot 5 uM (laatste biotine-BMCC concentratie) </td><td> Bereid deze oplossing onmiddellijk voor gebruik. </td></tr><tr><td> 2x SDS monsterbuffer geen reductiemiddelen </td><td> In gedestilleerd H2O: 5% SDS 5% Glycerol 125mm Tris-HCl pH 6,8 0,01% Bromophenol Blue </td><td> N / A </td><td> Bereid voor experiment, en bewaar bij -20 ° C tot gebruik. Aangevuld met 5 mM DTT vóór gebruik. </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Buffers en reagentia die voor de IP-ABE assay. Veel lysis buffers worden bereid voordat het experiment, maar de pH worden gecontroleerd en direct aangepast voor gebruik met een pH meter, het succes van de ABE chemie waarborgen. De meeste stamoplossingen moeten worden vers bereid voor elk experiment, onmiddellijk voor gebruik. Veel van de buffers nodig reagentia voor de meeste uitgeruste laboratoria biochemie en speciale reagentia met leverancier zijn vermeld in de tabel van reagentia en apparatuur. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50031/50031fig1.jpg" alt="Figuur 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50031/50031fig1highres.jpg" /> Figuur 1. Schema van de Immunoprecipitatie en Acyl-Biotin Exchange (IP-ABE) assay te zuiveren en detecteren palmitoylering van neuronale eiwitten. Cultured hippocampale neuronen gelyseerd (1) een doeleiwit wordt dan gezuiverd met een doelwit-specifiek antilichaam, en geïmmobiliseerd op Sepharose korrels bekleed met proteïne G of A. Het gezuiverde doeleiwit is dan (2) behandeld met N-ethylmaliemide (NEM) irreversibel binden en vrije thiol (-SH) groepen te blokkeren langs ongewijzigd cysteïnen (C). Het doeleiwit wordt vervolgens (3) een behandeling met hydroxylamine (HAM), resulterend in specifieke splitsing van bindingen op thioester gepalmitoyleerd cysteïnes en het zichtbaar worden van een vrije thiolgroep gepalmitoyleerde (-SH). Vervolgens wordt de doeleiwit (4) treated met een thiol-reactief biotine molecule, biotine-BMCC, waardoor specifieke biotinylering van de cysteine ​​gepalmitoyleerd. Tenslotte (5) het gebiotinyleerde doelwit eiwit wordt geëlueerd en uit het antilichaam en kralen. Het doeleiwit met gepalmitoyleerd cysteine ​​(s) gelabeld met biotine is nu geschikt voor SDS polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) en Western-blotting met streptavidine te detecteren palmitoylering van het gezuiverde eiwit neuronale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50031/50031fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om groter bedrag bekijken</a> . <img src="/files/ftp_upload/50031/50031fig2.jpg" alt="Figuur 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50031/50031fig2highres.jpg"/> Figuur 2. Detectie van palmitoylatie van de neuronale eiwitten δ-catenine met behulp van de IP-ABE-test. Primaire rat hippocampale neuronen werden gekweekt als pre5 hiervoor beschreven bij een dichtheid van 130 cellen / mm 2 tot rijpheid 14DIV werden vervolgens gelyseerd en onderworpen aan de IP-ABE assay op palmitoylering van een recent geïdentificeerde gepalmitoyleerd neuronale substraat, δ-catenine 2 detecteren. Gezuiverd immunoprecipitaten (IP) van δ-catenine (doeleiwit) werden geïsoleerd met 5 ug δ-catenine antilichaam per sample (BD Transduction Laboratories), en werden onderworpen aan SDS-PAGE in parallel minus en plus-hydroxylamine (HAM) monsters. Palmitoylering werd gedetecteerd door western blotting (WB) met streptavidine-HRP (palmitoylering), en het membraan werd gestript en onderworpen aan een WB reprobe voor δ-catenine. (A) Een geoptimaliseerde vertegenwoordiger IP-ABE resultaat voor gepalmitoyleerd δ-catenine (pijlpunt) behandeld met 1 uM biotine-BMCC, ter illustratie van de specificiteit van ABE chemie voor het detecteren van thiol-gepalmitoyleerd eiwitten van IP monsters. (B) Een sub-optimale vertegenvertegenwoordiger IP-ABE resultaat δ-catenine, waar een sterke concentratie van 4 pM biotine-BMCC werd gebruikt, waardoor niet-specifieke signalen en achtergrond in zowel minus en plus-HAM samples (pijlen). (C) Een suboptimale representatieve IP-ABE WB voor δ-catenine, waar een hoge concentratie van 4 pM biotine-BMCC werd gebruikt, en de hoeveelheid eiwit dat voor het plus-HAM IP monster niet genormaliseerd voor HAM-gemedieerde eiwitafbraak, wat resulteert in een signaal is in de reprobe WB voor δ-catenine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50031/50031fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> .

De omkeerbare toevoeging van palmitaat aan eiwitten is een belangrijke regulator van intracellulaire eiwitten mensenhandel. Dit is van bijzonder belang in neuronen waar veel synaptische eiwitten gepalmitoyleerd. We gebruiken een eenvoudige biochemische methode gepalmitoyleerd eiwitten in gekweekte neuronen, die kunnen worden aangepast voor meerdere celtypes en weefsels.

Detectie van eiwit palmitoylering in gekweekte hippocampale neuronen door immunoprecipitatie en Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Het algemene doel van deze procedure is om poid-gerelateerde neuronale eiwitten van gekweekte neuronen te isoleren en detecteren met behulp van een eenvoudige en aanpasbare biochemische test. Dit wordt bereikt door de doeleiwit te extraheren en te immobiliseren in aanwezigheid van ethyl of NEM om de blokkering van alle vrije thiolgroepen te garanderen. De tweede stap is om het geïmmobiliseerde doeleiwit te behandelen met hydroxyl betekenis of ham, om de thioesterverbinding tussen de palm-cysteïnerest en het palmitaatmolecuul te splitsen.Dit maakt de Palmated cystine stijlgroep vrij en maakt deze beschikbaar voor etikettering in de derde stap. Het geïmmobiliseerde doeleiwit wordt geïncubeerd met biotin B-M-C-C-A-bestandspecifiek molecuul getagd met biotin, dit biotin elates en tags, de Thile groep die oorspronkelijk pyl was. De laatste stap is het detecteren van het niveau van pation van het doeleiwit door SDS-pagina en westerse blotting voor Strp Aden.Uiteindelijk wordt de IP A BE-test gebruikt om niveaus van het lipide palmitaat te tonen dat reversibel aan een neuronaal doeleiwit is bevestigd, en kan ook subtiele veranderingen in doeleiwitten detecteren. Pation niveaus. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals detectie van eiwit, palm mutilatie met behulp van metabolische labelen met trait A palmate is dat de acyl biotin uitwisselingstest gevoeliger en minder tijdrovend is.De A BE-test maakt ook kwantitatieve schattingen van palm mutilatie mogelijk en is optimaal geschikt voor het detecteren van kleine veranderingen in de niveaus van palm mutilatie. Hoewel deze methode inzicht kan geven in het identificeren van palm-eiwitten en gekweekte hippocampale neuronen, kan deze ook worden toegepast op andere systemen zoals primaire neurale culturen uit andere hersengebieden, heterologe cellijnen en zelfs primaire weefsels. Om te beginnen met de extractie van doeleiwit uit gekweekte primaire hippocampale neuronen, bereidt u de lysisbuffer en NEM-oplossing voor zoals beschreven in de geschreven procedure die bij deze video hoort.Combineer vervolgens de lysisbuffer en NEM-oplossing door 0,5 milliliter van twee molare NEM-oplossing toe te voegen aan een verse 50 milliliter conische buis. Voeg 20 milliliter lysisbuffer bovenaan toe. Voeg altijd eerst de NEM ethanoloplossing toe en vervolgens de lysisbuffer, om de twee goed te mengen in een koude kamer van vier graden Celsius, plaats het mengsel snel op een slingerplatform om vijf minuten lang volledig te mengen.Verwijder gekweekte primaire rat hippocampale neuronen uit de incubatorinstructies over hoe te kweken. De neuronen zijn te vinden in de tekst na het plaatsen van de gekweekte neuronen op ijs. Verwijder voorzichtig het cellulaire medium.Was de neuronen voorzichtig twee keer met koud fosfaatgebufferd zoutoplossing. Voeg vervolgens 300 microliter lysisbuffer plus 50 millimolar NEM toe aan de eerste put van hippocampale neuronen en schraap cellen met behulp van een wegwerpbare cellifter. Verzamel het cellysaat en laat het lysaat vervolgens in de volgende put van die groep stromen.Schraap de cellen in de tweede put met behulp van de cellifter. Verzamel en herhaal met behulp van een derde put indien nodig. Om het lysaat verder te concentreren, verzamel het cellysaat in een voorgekoelde 1,5 milliliter microcentrifugebuis.Voeg 100 microliter lysisbuffer plus 50 millimolar NEM toe aan de eerste put en herhaal het schraapproces om eventueel resterend cellysaat te verzamelen. Laat het totale cellysaat vijf tot zes keer door een 26 en een halve gauge spuit om mechanische lysen te bevorderen. Wees voorzichtig om geen luchtbellen in de oplossing te blazen.Mutateer het cellysaat gedurende ten minste 30 minuten bij vier graden Celsius na centrifugatie. Verzamel het verdunde cellysaat in een nieuwe voorgekoelde 1,5 milliliter buis op ijs. Herhaal het gedemonstreerde oogstprotocol voor alle celgroepen.Meet de eiwitconcentratie in alle lysaatmonsters met behulp van de BCA-test. Volgens de instructies van de fabrikant. Normaliseer het volume van alle lysaatmonsters van celgroepen om exact gelijk eiwit te hebben met een aanbevolen minimum van 500 microgram.Vul alle monsters aan met lysisbuffer plus 50 millimolar NEM tot een totaal volume van 500 microliter. Voeg vervolgens een tot vijf microgram primaire antilichaam gericht tegen het doeleiwit toe aan elk lysaatmonster. Mutatieer de antilichaamlysaat gemengde monsters een nacht bij vier graden Celsius voordat u een doeleiwit precipiteert en immobiliseert.Bereid een 50% slurrie van eiwit A of eiwit G gecoate SRO-snelheden voor zoals beschreven in het geschreven protocol. Als laatste stap, voeg een gelijk volume van 50% slurrie toe aan elk antilichaam lysaatmonster, en muteer gedurende ten minste een uur bij vier graden Celsius. Bij het uitvoeren van ael, verwissel de juiste pH en temperatuur van alle buffers en reagentia, evenals hun versheid, zijn cruciaal.Om een succesvol experiment te garanderen. Begin de ham-splitsing met de voorbereiding van een aantal buizen met lysisbuffer van verschillende phs. De pH is erg belangrijk voor deze stappen en moet altijd worden aangepast.Gebruik een pH-meter per monster om twee milliliter lysisbuffer pH 7,2 en 0,5 milliliter strenge buffer voorbereid in lysisbuffer voor te bereiden. Bereid ook 0,5 milliliter lysisbuffer plus 10 millimolar NEM per monster voor. Voeg PMSF en proteaseremmertabletten toe aan alle lysisbuffers.Hydroxyl betekenis of ham wordt gebruikt om de thioesterverbinding tussen de palm-cysteïne en het palmitaatvetzuur te splitsen. Dit is essentieel om de palm-cysteïne stijlgroep vrij te maken en beschikbaar te maken voor etikettering met biotin. Het weglatenen van ham-splitsing kan daarom dienen als een nuttige negatieve controle.Bereid extra 1,5 milliliter buizen op ijs voor die gelabeld zijn als de min ham controle voor elk monster na de incubatie van het antilichaam met het cellysaat. En vervolgens met de kralen, centrifugeer alle monsterkralen voorzichtig bij 0,5 keer G gedurende één minuut bij vier graden Celsius met

detection-protein-palmitoylation-cultured-hippocampal-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Ubiquitinatie is een belangrijke posttranslationele modificatie uitgevoerd door een set van drie enzymen. Mutaties van genen die betrokken zijn in deze wijziging worden geassocieerd met vele verschillende ziekten bij de mens. We beschrijven hier protocollen aan eiwit ubiquitinatie te detecteren in gekweekte...

Detectie van eiwit ubiquitinering

The video demonstrates the analysis of the palmitoylation state of cell membrane proteins isolated from mouse brain tissue. The process involves exposing the non-palmitoylated cysteines and blocking them, then using a polymer that binds to the palmitoylated cysteines, aiding in assessing the palmitoylation state of the isolated proteins.

Assessing the Palmitoylation State of Cell Membrane Proteins from Mouse Brain Tissue

Neuronale membraan mensenhandel stelt dynamisch plasmamembraaneiwit beschikbaarheid en significant invloed neurotransmissie. Tot op heden, is het een uitdaging om neuronale endocytische handel in volwassen neuronen te meten. Hier beschrijven we een zeer effectieve, kwantitatieve methode om snelle veranderingen in de oppervlakte-eiwit expressie ex vivo bij acute plakjes hersenen te meten.

Brain Slice Biotinylatie: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Aanpak Regiospecifieke van plasma membraaneiwit Trafficking Meet in Adult Neuronen

Twee biotinylatie-gebaseerde methoden, ontworpen voor het bepalen van de expressie van de celoppervlak en de endocytische snelheid van eiwitten uitgedrukt in het plasmamembraan, worden in dit rapport weergegeven.

Bepaling van de expressie van de celoppervlakte en de endocytische snelheid van eiwitten in primaire astrocytekulturen met behulp van biotinylering

Het onderzoeken van meerdere, kunnen endogene posttranslationele modificaties voor een eiwit-doelstelling zeer uitdagend. De hier beschreven technieken gebruiken een geoptimaliseerde lysis buffer en filter systeem ontwikkeld met specifieke PTM-targeting, affiniteit matrices te sporen van de acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3 en tyrosine fosforylering wijzigingen voor een doel eiwit met behulp van een enkele, gestroomlijnde systeem.

Met behulp van een uitgebreide Immunoprecipitation verrijking systeem ter identificatie van het profiel van een endogene posttranslationele wijziging voor Target eiwitten

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) is een zeer gevoelige, betrouwbare en gemakkelijk uit te voeren methode om omkeerbare lipidemodificatie van cysteïneresiduen (S-acylation) in een verscheidenheid van biologische monsters op te sporen.

Detectie van eiwit s-acylation met behulp van Acyl-Hars Assisted Capture

Palmitoylation houdt de integratie in van een 16-koolstof palmitaat moiety aan cysteïneresiduen van doelproteïnen op een omkeerbare manier. Hier beschrijven we een biochemische benadering, de acyl-PEGyl exchange gel shift (APEGS) test, om de palmitoylation toestand van een eiwit van belang in muis hersenen lysaten te onderzoeken.

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay voor kwantitatieve bepaling van palmitoylation van Brain Membrane Eiwitten

De studie van vetacylatatie heeft belangrijke implicaties in cellulaire eiwitinteracties en ziekten. Hier wordt een aangepast protocol gepresenteerd om de detectie van vet-geacyleerde eiwitten te verbeteren, die kunnen worden toegepast in verschillende celtypen en gecombineerd met andere testen, waaronder pulsachtervolging en massaspectrometrie.

Geoptimaliseerde integratie van alkynylvetzuuranalogen voor de detectie van vetacyleiwitten met behulp van Click Chemistry

Een neuronaal lysosoom proximity labeling proteomics protocol wordt hier beschreven om de dynamische lysosomale micro-omgeving in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide neuronen te karakteriseren. Lysosomale membraaneiwitten en eiwitten die interageren met lysosomen (stabiel of tijdelijk) kunnen nauwkeurig worden gekwantificeerd in deze methode met een uitstekende intracellulaire ruimtelijke resolutie in levende menselijke neuronen.

Karakterisering van neuronale lysosoom interactoom met proximity labeling proteomics

Het protocol presenteert een methode voor in vivo covalente hechting van biotine aan eiwitten op basis van hun nabijheid tot een biotineligase die is gefuseerd met een interessant eiwit. Deze modificatie maakt een selectieve verrijking van de eiwitten mogelijk met behulp van streptavidinekorrels als dat nodig is in eiwitinteractiestudies.

In vivo Nabijheidsbiotinylering voor onderzoek naar eiwitinteractie in Paramecium tetraurelia

Leer palmitoylering detecteren in gekweekte hippocampale neuronen met immunoprecipitatie en Acyl-Biotin Exchange. Deze biochemische methode biedt hogere gevoeligheid voor eiwittrafficking onderzoek.

Detectie van eiwit palmitoylering in gekweekte hippocampale neuronen door immunoprecipitatie en Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Meer video's verkennen