Kwantitatieve analyse van Autophagy met Advanced 3D Fluorescentiemicroscopie
May 3rd, 2013
Autofagie is een alomtegenwoordige proces waarmee cellen om eiwitten en organellen degraderen en te recyclen. We passen geavanceerde fluorescentie microscopie te visualiseren en kwantificeren van de kleine, maar essentiële, fysieke veranderingen geassocieerd met de inductie van autofagie, waaronder de vorming en verspreiding van autofagosomen en lysosomen, en hun fusie in autolysosomes.
Het algemene doel van deze procedure is om kwantitatieve beelden te verkrijgen van behandelde prostaatkankercellen om de mate en omvang van autofagie op verschillende tijdstippen te meten. Dit wordt bereikt door eerst cellen te behandelen met arginine, dase of andere experimentele reagentia om autofagie en/of celdood te induceren. De tweede stap is om te beslissen of levende of gefixeerde cellen worden beeldvormd en om monsters dienovereenkomstig voor te bereiden.
Vervolgens verkrijgt u 3D-fluorescentiebeelden van levende of gefixeerde cellen met behulp van widefield, deconvolutie of gestructureerde verlichting fluorescentiemicroscopie. De laatste stap is het verzamelen van statistische gegevens over de grootteverdeling van autofagosomen en colocalisering met andere intracellulaire structuren. Met behulp van digitale 3D-beeldanalysesoftware kan deze aanpak resultaten opleveren die niet alleen laten zien dat de inductie van autofagie door arginine dase prostaatkankerceldood kan veroorzaken, maar ook dat deze cellen structurele veranderingen vertonen die morfologisch verschillend zijn van veranderingen geassocieerd met apoptose en necrose.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere bestaande methoden is dat kwantitatief 3D-beeldvorming kan laten zien wanneer en waar een specifiek moleculair evenement plaatsvindt binnen een levende cel en dit vervolgens in een driedimensionale indeling kan presenteren. Om te beginnen groeien humane prostaatkankercellen die groen fluorescent eiwit uitdrukken, gekoppelde lichtketting drie op 35 millimeter poly de lycine gecoate glazen bodem kweekschotels zoals beschreven in het protocoltekst. Cellen moeten in voldoende dichtheid worden geplaatst om snelle proliferatie mogelijk te maken, maar niet zo veel dat de cellen overgroeid en geclusterd raken op het moment van beeldvorming. Behandel geselecteerde cellen met arginine dase of een DI in PBS om cellen van vrij arginine te ontdoen en metabole stress in de kankercellen te induceren ongeveer een uur voorafgaand aan de beeldvorming. Verdun 1,5 microliters van Lyo tracker red met 20 milliliters RPMI met 10%FPS en 1%antibiotica. Bereid oplossingen met een DI voor de geselecteerde monsters die werden behandeld na het opwarmen van alle media tot 37 graden Celsius.
Voeg het juiste medium toe aan elke kweekschotel. Behandel cellen met RPMI met LYO Tracker red gedurende 15 tot 45 minuten bij 37 graden Celsius, ongeveer 30 minuten voorafgaand aan de beeldvorming. Zet de weerstation omgevingsomgeving aan en laat deze gelijkmaken tot 37 graden Celsius en 5%koolstofdioxide. Was de cellen met PBS en vervang het medium met standaard RPMI dat alleen 10%FBS en 1%antibiotica bevat. Voeg een DI toe aan de monsters zoals aangegeven.
Monteer 35 millimeter dekglasbodem kweekschotels in een aangepaste adapter. Gebruik immersieolie op de zes DX-vergroting, 1,42 numerieke aperture objectieflens en plaats de gemonteerde kweekschotel op het microscoopplatform. In deze video wordt 3D-microscopie gedemonstreerd met behulp van de Delta vision personal IDV toegepaste positie, deconvolutiemicroscoop en Associated Soft Works applicatie suite.
Om te beginnen zet het microscoopsysteem aan, inclusief acquisitiewerkstation en instrumentcontroller. Open de resolve 3D computer control applicatie om de microscoopfase te initialiseren en zet de xenon lichtbron aan. Geef 10 minuten om de lichtbron op te warmen en om stabiele omstandigheden te bereiken.
Voeg een druppel immersieolie toe aan de zes DX-vergroting, 1,42 numerieke aperture objectieflens en centreer de dia met dekglas met het dekglas naar beneden boven het objectieflens met behulp van helderveld of externe verlichting evenals de grove focus. Pas de knop langzaam aan en verhoog het objectieflens totdat het dekglas van het immersieolie contact maakt met het omgekeerde dekglas. Vanaf dit punt zou de cellagen binnen enkele beurten van de fijne focusaanpassingsknopbeurt in focus moeten komen.
Wanneer u met gefixeerde monsters op de dia's werkt, is het aan te raden om cellen binnen of nabij gebieden met bellen te vermijden. Bij het bekijken van levende monsters op de glazen bodemschotel, vermijdt u het bewegen van het objectieflens buiten de grens van de glazen dekglas. Selecteer het gewenste gezichtsveld.
Idealiter zouden cellen een goed fluorescent signaal moeten vertonen in alle juiste kanalen en voldoende gehecht en verspreid moeten zijn op het dekglasoppervlak, zodat de intracellulaire inhoud gemakkelijk te visualiseren is. Kleine aanpassingen in laterale X, Y en Z focus kunnen worden geregeld door de computer met behulp van de acquire 3D interface. Stel benning in op een op een of twee op twee, afhankelijk van het gewenste gezichtsveld voor een bepaald beeld door het middengedeelte van een cel, stel de belichtingsparameters zo in dat de maximale pixelintensiteit niet meer dan 3000 tellen overschrijdt.
Over het algemeen moet de procentuele transmissie zo laag mogelijk worden ingesteld zonder de overeenkomstige belichting te verhogen. Tijd over één seconde. Herhaal deze procedure voor elke fluorescentiekleur die moet worden afgebeeld en voor elk afzonderlijk gezichtsveld.
Om de hoogste kwaliteit beelden te verkrijgen, stelt u de bovenste en onderste limieten van de Zack in door de focus iets boven het bovenste en onderste deel van het celmonster te verstellen. Het totale aantal beelden in een bepaalde Z-stack wordt dus bepaald door deze limieten en door de afstand tussen de lagen. Om bewegingsartefacten tijdens beeldacquisitie te minimaliseren, kan de beeldacquisitiemodus worden ingesteld op golflengte.
Vervolgens ZS-stack voor gefixeerde monsters en ZS-stack dan golflengte voor levende monsters. Nadat alle parameters zijn ingesteld, kunnen de fluorescentiebeelden worden verkregen. Fluorescentiebeelden worden vervolgens ontwikkeld met behulp van soft works en later geanalyseerd met behulp van velocity.
De hier getoonde beeldsequentie toont de fysieke veranderingen die optreden in cwr 22 cellen tijdens de eerste 80 minuten van autofagie-inductie. In deze afbeeldingen vertegenwoordigt de witte stippellijn de omtrek van de cel en vertegenwoordigt het licht gemarkeerde gebied de positie van de kern. In de loop van 80 minuten onthullen de afbeeldingen
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie richt zich op autofagie, een kritiek cellulair proces voor het afbreken en recyclen van eiwitten en organellen. Met behulp van geavanceerde fluorescentiemicroscopie visualiseren en kwantificeren we de fysische veranderingen geassocieerd met autofagie-inductie, inclusief de dynamica van autofagosomen en lysosomen.
Belangrijke Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Neurowetenschappen
- Fluorescentiemicroscopie
Achtergrond
- Autofagie is essentieel voor cellulaire homeostase.
- Het omvat de vorming van autofagosomen en hun fusie met lysosomen.
- Het begrijpen van autofagie kan inzichten bieden in de kankerbiologie.
- Prostaattumorcellen kunnen duidelijke morfologische veranderingen vertonen tijdens autofagie.
Doel van het onderzoek
- Om de mate van autofagie in behandelde prostaattumorcellen te kwantificeren.
- Om de effecten van arginine dase op celdood en autofagie-inductie te analyseren.
- Om structurele veranderingen geassocieerd met autofagie te onderscheiden van die gerelateerd aan apoptose en necrose.
Gebruikte methoden
- Behandelen van cellen met arginine, dase of andere reagentia om autofagie te induceren.
- Kiezen tussen het afbeelden van levende of gefixeerde cellen.
- 3D-fluorescentiebeelden verkrijgen met behulp van verschillende microscopietechnieken.
- Statistische gegevens verzamelen over autofagosoomgrootte en colocalisatie.
Belangrijkste resultaten
- Kwantitatief beeldmateriaal onthult de mate van autofagie in prostaattumorcellen.
- Structurele veranderingen in cellen geïnduceerd door arginine dase zijn morfologisch duidelijk verschillend.
- Resultaten geven aan dat autofagie-inductie kan leiden tot celdood.
- Statistische analyse ondersteunt de bevindingen over autofagosoomdynamica.
Conclusies
- Deze studie biedt een methode voor het visualiseren van autofagie in prostaattumorcellen.
- Het begrijpen van deze processen kan therapeutische strategieën informeren.
- Toekomstig onderzoek kan de implicaties van autofagie in kankerbehandeling onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative 3D fluorescence microscopy enables precise measurement of autophagosome dynamics and lysosomal colocalization, providing mechanistic insights into autophagy-mediated cell death pathways. This approach supports target validation by distinguishing autophagy-specific structural changes from apoptosis and necrosis, thereby de-risking therapeutic hypotheses in oncology drug discovery. The method enhances predictive confidence in preclinical models by delivering statistically robust, spatially resolved data on autophagy flux in living cells.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying autophagy induction as a distinct cell death mechanism.
- Operational Value: Enables biological de-risking through morphologically specific tracking of autophagosome-lysosome fusion.
- Translational Value: Supports portfolio triage by differentiating autophagy-dependent cytotoxicity from other death pathways.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening via standardized 3D imaging protocols.
- Quantitative Output: Delivers statistical data on autophagosome number, size, distribution, and colocalization for assay standardization.
- Scalability: Enables reliable compound evaluation through reproducible imaging and digital analysis workflows.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Maintains continuity from discovery to preclinical validation by linking autophagy dynamics to prostate cancer chemotherapy response.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value by resolving autophagy’s role in death-response after metabolic stress induction.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by providing spatially resolved, quantitative biomarkers of autophagy flux.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, supporting autophagy-focused target validation and mechanistic de-risking in oncology pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying autophagy induction dynamics in live cells.
- Screening: Ensures assay readiness through reproducible 3D imaging and quantitative colocalization measurements.
- Analytics: Provides statistical readouts on autophagosome size distribution and Pearson’s correlation-based colocalization for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by aligning autophagy measurements with therapeutic response in prostate cancer models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging platform for studying autophagy across disease models and organ systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through mechanistic de-risking of autophagy-mediated cell death.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of 3D fluorescence imaging and digital analysis.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in oncology programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on quantitative autophagy flux as a biomarker of therapeutic response.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, 3D image acquisition, and digital image analysis software.
- Depends on instrumentation such as widefield deconvolution or structured illumination microscopy systems with environmental control.
- Necessitates cross-team standardization for sample preparation, imaging parameters, and data analysis pipelines.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different cell models or fixation states.
- Includes practical limitations such as phototoxicity in live-cell imaging and the need for careful Z-stack optimization to minimize motion artifacts.
