Name: Genetische Modificatie en recombinatie van speekselklier Orgel culturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Leer genetische modificatie van epitheelcellen in embryonale muizen speekselklieren met adenovirale vectoren. Deze methode analyseert branching morfogenese zonder transgene organismen te creëren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Dr Deirdre Nelson bedanken voor nuttige opmerkingen en voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit werk werd gefinancierd door NIH subsidie ​​DE019244, DE019197 en DE021841 te ML, F32DE02098001 aan SJS en C06 RR015464 aan de Universiteit van Albany, SUNY.

Het protocol bestaat uit vier stappen, zoals afgebeeld in figuur 1. Alle stappen worden beschreven in detail. Adenovirus constructie en virale zuivering te worden uitgevoerd vóór de orgaanroof voor gebruik in de genetische transductie van epitheliale rudiments ontleed. Alle standaard BSL-2 veiligheidsmaatregelen moeten worden gevolgd bij het werken met adenovirussen. 1. Muis embryonale Submandibulaire Gland (SMG) Oogst en Microdissection <ol><li> Euthanaseren timed-zwangere vrouwelijke muizen (outbred stam CD-1 of ICR) met behulp van CO 2 narcose, gevolgd door cervicale dislocatie en oogst snaren van de muis embryo&#39;s op embryonale dag 13 (E13, 3-5 epitheliale knoppen) volgende procedures zijn goedgekeurd door de institutionele IACUC commissie. De dag van vaginale plug ontdekking wordt aangewezen als E0. Speekselklieren kunnen worden geoogst en gekweekt in de E12 stadium wanneer er een primaire knop en steel met spleten beginnendete starten. SMG voorafgaand aan deze fase vereisen verschillende kweekomstandigheden dan hier aangegeven. </li><li> Breng embryo strings in steriele 10 cm weefselkweekschalen gevuld met 25 ml DMEM / Ham &#39;s F12 Medium (F12) zonder fenolrood (Life Technologies), aangevuld met 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine (pen-strep, Life Technologies). </li><li> Met een steriel scalpel (# 11 bladen) en tang (# 5, Fine Science Tools, 11252-20), verwijder de embryo&#39;s van de zakjes in een aparte 10 cm schotel met 25 ml DMEM/F12 + pen-strep. </li><li> Sever het embryo hoofden met een schuine snede net onder de onderkaak. </li><li> Isoleer de onderste kaken van de hoofden onder een stereo dissectiemicroscoop met een doorvallend licht-basis (Nikon SMZ645 of gelijkwaardig) met een snee onder de bovenkaak. Plaats de weefsels boven op een extra stuk glas in plaats van direct op het glas component van de microscoop base. </li><li> Verzamel de onderste kaken in 3 ml van DMEM/F12 + pen-strep in een steriele 35 mm weefselkweek schotel. </li><li> Plaats een onderkaak slice op de dissectiemicroscoop fase zodat de tong aan de onderzijde van de plak, maar wijst naar de 12:00 uur positie. </li><li> Met behulp van een kant van twee gekruiste tang in een scharende beweging, te verwijderen en gooi het onderste 1/3 e van de onderkaak slice. </li><li> Draai het segment 90 ° naar rechts (als rechts) en via een scharende cut met de tang, snij het bovenste gedeelte van de onderkaak slice (zonder dat de tong) halverwege het segment. </li><li> Schil de overtollige weefsel weg en verwijder deze om de SMG eronder blootlegt. Er zal aan weerszijden nabij de basis van de tong. </li><li> Met behulp van een pincet ingedrukt te houden het weefsel door de tong, gebruik dan de andere tang om de SMG los te maken uit de tong. Herhaal dit voor de andere klier. </li><li> Verzamel de gemicrodissecteerde speekselklieren in 3 ml DMEM/F12 + pen-strep in een nieuwe steriele 35 mm weefselcultuur schotel. Let op: de grotere submandibulaire klieren (3-5 epitheliale knoppen), samen met de aangesloten kleinere sublinguale klier (1 knop) kan worden intact gekweekt door het overslaan van stap 4 en het uitvoeren van de stappen 4.1, 4.3, en 4.4, zoals eerder beschreven 2,8. </li></ol> 2. SMG Epitheliale rudiment Scheiding <ol><li> Place 5 (of meer) speekselklieren in een glazen bodem, 50 mm diameter microwell schaal (MatTek Corporation, P50G-1.5-14-F) met 200 pl gebalanceerde zoutoplossing Hank&#39;s (HBSS ontbreekt Ca + + of Mg + +, Life Technologies) bevattende 0,4% (v / v) dispase (Life Technologies, cat.. 17,105-041) en gedurende 15 min geïncubeerd bij 37 ° C. </li><li> Na de incubatie met een steriele pipet 200 pi voorzichtig zuigen de dispase oplossing zonder de klieren. Onmiddellijk voeg 200 ul DMEM/F12 medium dat 5% (w / v) BSA (DMEM/F12-BSA, vooraf gesteriliseerde met een 0,22 urn filter) de dispase neutraliseren. </li> &lt;li&gt; Onder een dissectiemicroscoop, met behulp van een pincet met fijne tips (# 5 Dumostar, Fine Science Tools, 11295-20), voorzichtig scheiden de losgemaakte mesenchym van rond de SMG epitheliale knoppen en kanalen, en zorg te vertrekken, het epitheel intact . </li><li> Pre-nat een steriele 200 ul pipet tip met DMEM/F12-BSA media en voorzichtig pipetteren uit de epitheliale rudiments in een nieuwe diameter van 50 mm microwell schotel met 200 ul van DMEM/F12 + pen-strep. Gebruik een hoge kwaliteit 200 ul pipet tip met een gladde rand. </li><li> In het gerecht dat het mesenchym stukken bevat, moet u alle niet-mesenchymale weefsels waaronder de sublinguale klieren en eventuele vrijstaande glandula submandibularis knoppen. </li></ol> 3. Adenovirale infectie van epitheliale Rudiments <ol><li> Maak 200 ul virale infectie media door verdunning van het adenovirus plaats in DMEM/F12 + pen-strep in een microcentrifugebuis zodat de titer van de resulterende oplossing 1x10 8 -10 9 PFUs. Deoptimale titer nodig is voor verschillende virussen kunnen variëren. Het is belangrijk om cesium chloride (CsCl)-gezuiverde virale preparaten voor optimale opname efficiëntie. </li><li> Verwijder de media uit het schaaltje met de vijf epitheliale rudiments. Voeg snel 200 ul van de media infectie, waarbij de beginselen natte allen tijde. Neem de nodige voorzorgsmaatregelen bij het hanteren van het virus en de verwijdering van verontreinigde pipet tips. Desinfecteer enig virus-besmette oppervlakken met 10% bleekwater oplossing. </li><li> Verplaats de epitheliale rudiments ver van elkaar forceps om te voorkomen dat aan elkaar kleven en ze naar de bodem van de plaat mogelijk te maken. Incubeer rudiments in virale media gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Tijdens de incubatie scheiden rudiments, als ze zich dicht bij elkaar. Overmatige schommelstoel of beweging zal de klieren samen te klonteren. </li><li> Na incubatie, verwijdert u de virale-bevattende media en gooi de juiste, zorg ervoor dat u de r verstorenudiments. Voeg 200 ul van DMEM/F12 + pen-strep. Herhaal deze wash minstens twee keer en vervangen door 200 ui DMEM/F12 + pen-strep media. Deze wasbeurten zijn essentieel voor een virus dat niet sterk aan het epitheel verwijderen en infectie van het mesenchym voorkomen. </li><li> Incubeer epitheliale rudiments met 200 ml DMEM/F12 die 2% (v / v) Matrigel (BD Biosciences, 356231) gedurende 20 minuten. We vinden dat dit korte incubatie in Matrigel de regressie van bestaande spleten minimaliseert tijdens de eerste kweekperiode, maar deze stap kan worden afgezien als blootstelling aan Matrigel niet gewenst. </li></ol> 4. Ex vivo cultuur van gerecombineerde SMG <ol><li> Plaats elke rudiment, een voor een, met behulp van een pre-wet 200 ul pipetpunt, op een inkeping (sneetje) 13 mm, 0,1 urn Nuclepore Track-Etch membraanfilter (Whatman) zwevend boven 200 pl kweekmedium ( 5 rudiments / filter) in een glazen bodem microwell plaat. De cultuur mediais: DMEM/F12 + pen-strep dat 50 ug / ml transferrine en 150 ug / ml ascorbinezuur, zoals eerder beschreven 2,8. Transferrine is bekend dat het voortbestaan ​​te stimuleren en vertakking morfogenese van speekselklier en andere organen explantaten 9. Toevoeging van ascorbinezuur is aangetoond dat SMG vertakking stimuleren. 10 Het is bekend om als een cofactor in talrijke hydroxylering reacties van metabolisme (zoals proline hydroxylering in collageenvezelvorming 11) en stimuleert fibronectine en laminine productie in andere orgaansystemen explantaten 12. </li><li> Verwijder zoveel media bovenop de filter mogelijk na het toevoegen van elk epitheliale rudiment. Teveel media bovenop de filter kan de filter te zinken, terwijl minder media maakt plaatsing van de beginselen en mesenchym veel gemakkelijker. Overmaat media kan worden verwijderd met een pipet of door forceps van de media tussen de tips grijpen. </li><li> Plaats mesenchym stukken weer afgeleidm drie tot vier klieren geplaatst en / of rond elk epitheliale rudiment. Verwijder eventuele extra media die rond de klieren om beweging van de mesenchym voorkomen uit de buurt van de eerste beginselen. Mesenchym uit meer klieren niet voordelig maar minder schadelijk kunnen zijn voor epitheliale rudiment groei. </li><li> Incubeer gerecombineerde SMG in een bevochtigde incubator (95% lucht / 5% CO2) bij 37 ° C gedurende 48 -72 uur, zoals gewenst. </li><li> Verwerven helderveld en / of fluorescerende beelden van levende klieren bij 0 uur (indien gewenst), 2 uur na recombinatie en elke 24 uur daarna op een omgekeerde, rechtop of stereo licht microscoop uitgerust met een digitale camera met een 4X of 5X vergroting doelstelling vangen de hele gerecombineerde klier in een enkel frame gezien. Beelden van de speekselklier tonen de beste contrast met behulp van de helderveld of plaats het juiste fase-ring geplaatst gedeeltelijk in het lichtpad (wat niet mogelijk is op volledig geautomatiseerde microscopen). Standard fasecontrast geent nodig, omdat de klier is dik en zorgt voor contrast. </li><li> Op de gewenste tijdstippen kan gerecombineerde SMG vast gedurende 20 minuten met fixatief oplossing gemaakt van 2% paraformaldehyde (PFA) in 1X PBS bevattende 5% (w / v) sucrose (interne celstructuur beter in stand houden van de cellen in een isosmotic staat). In tegenstelling tot 4% PFA, 2% PFA slaat een aanzienlijke hoeveelheid van het GFP signaal als het fixeermiddel volledig verwijderd na fixatie. Klieren worden bewaard tot 1 week in 1X PBS in het donker bij 4 ° C totdat whole mount immunocytochemie en confocale beeldvorming wordt uitgevoerd, zoals eerder 3,6,13-15. Idealiter immunocytochemie en imaging snel worden uitgevoerd na bevestiging aan de beste beeldkwaliteit te verkrijgen. Klieren worden gelyseerd in RIPA buffer voor SDS-PAGE gevolgd door Western blot analyse. </li></ol>

<ol><li>Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Salivary gland development.</a> Seminars in cell & developmental biology. 18, 237-244 (2007).</li>
<li>Sakai, T., Onodera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic organ culture.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 19, Unit 19(2008).</li>
<li>Patel, V. N., Rebustini, I. T., Hoffman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+gland+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Salivary gland branching morphogenesis.</a> Differentiation. 74, 349-364 (2006).</li>
<li>Sequeira, S. J., Larsen, M., DeVine, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+and+growth+factors+in+salivary+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+oral+biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix and growth factors in salivary gland development.</a> Frontiers of oral biology. 14, 48-77 (2010).</li>
<li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+detection+of+E1-containing+adenovirus+in+saliva+after+the+delivery+of+a+first-generation+adenoviral+vector+to+human+parotid+gland%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Transient detection of E1-containing adenovirus in saliva after the delivery of a first-generation adenoviral vector to human parotid gland.</a> J. Gene Med. 12, 3-10 (2010).</li>
<li>Larsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+PI+3-kinase+and+PIP3+in+submandibular+gland+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Role of PI 3-kinase and PIP3 in submandibular gland branching morphogenesis.</a> Developmental biology. 255, 178-191 (2003).</li>
<li>Hoffman, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiles+of+mouse+submandibular+gland+development%3A+FGFR1+regulates+branching+morphogenesis+in+vitro+through+BMP-+and+FGF-dependent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiles of mouse submandibular gland development: FGFR1 regulates branching morphogenesis in vitro through BMP- and FGF-dependent mechanisms.</a> Development. 129, 5767-5778 (2002).</li>
<li>Rebustini, I. T., Hoffman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ECM+and+FGF-dependent+assay+of+embryonic+SMG+epithelial+morphogenesis%3A+investigating+growth+factor%2Fmatrix+regulation+of+gene+expression+during+submandibular+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">ECM and FGF-dependent assay of embryonic SMG epithelial morphogenesis: investigating growth factor/matrix regulation of gene expression during submandibular gland development.</a> Methods Mol. Biol. 522, 319-330 (2009).</li>
<li>Partanen, A. M., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transferrin+and+tooth+morphogenesis%3A+retention+of+transferrin+by+mouse+embryonic+teeth+in+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Transferrin and tooth morphogenesis: retention of transferrin by mouse embryonic teeth in organ culture.</a> Differentiation. 34, 25-31 (1987).</li>
<li>Naka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+branching+morphogenesis+of+fetal+mouse+submandibular+gland+by+sodium+ascorbate+and+epigallocatechin+gallate%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Modulation of branching morphogenesis of fetal mouse submandibular gland by sodium ascorbate and epigallocatechin gallate.</a> In Vivo. 19, 883-888 (2005).</li>
<li>Bornstein, P., Traub, W. The chemistry and biology of collagen. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBornstein%2C+P+%22The+Proteins%22">The Proteins</a>. Neurath, H., Hill, R. L. 4, 3rd, Academic Press. 412-632 (1979).</li>
<li>Zhou, L., Higginbotham, E. J., Yue, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+ascorbic+acid+on+levels+of+fibronectin%2C+laminin+and+collagen+type+1+in+bovine+trabecular+meshwork+in+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of ascorbic acid on levels of fibronectin, laminin and collagen type 1 in bovine trabecular meshwork in organ culture.</a> Curr. Eye Res. 17, 211-217 (1998).</li>
<li>Daley, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK1-directed+basement+membrane+positioning+coordinates+epithelial+tissue+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ROCK1-directed basement membrane positioning coordinates epithelial tissue polarity.</a> Development. 139, 411-422 (2012).</li>
<li>Daley, W. P., Gulfo, K. M., Sequeira, S. J., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+mechanochemical+checkpoint+and+negative+feedback+loop+regulating+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Identification of a mechanochemical checkpoint and negative feedback loop regulating branching morphogenesis.</a> Developmental biology. 336, 169-182 (2009).</li>
<li>Sequeira, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+focal+adhesion+complex+formation+and+salivary+gland+epithelial+cell+organization+by+nanofibrous+PLGA+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The regulation of focal adhesion complex formation and salivary gland epithelial cell organization by nanofibrous PLGA scaffolds.</a> Biomaterials. 33, 3175-3186 (2012).</li>
<li>Nogawa, H., Mizuno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+control+over+elongating+and+branching+morphogenesis+in+salivary+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+embryology+and%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal control over elongating and branching morphogenesis in salivary gland development.</a> Journal of embryology and. 66, 209-221 (1981).</li>
<li>Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+requirement+in+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fibronectin requirement in branching morphogenesis.</a> Nature. 423, 876-881 (2003).</li>
<li>Daley, W. P., Kohn, J. M., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+focal+adhesion+protein-based+mechanochemical+checkpoint+regulates+cleft+progression+during+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics+%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">A focal adhesion protein-based mechanochemical checkpoint regulates cleft progression during branching morphogenesis.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 2069-2083 (2011).</li>
<li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parasympathetic+innervation+maintains+epithelial+progenitor+cells+during+salivary+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis.</a> Science. 329, 1645-1647 (2010).</li>
<li>Larsen, M., Wei, C., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+fibronectin+dynamics+during+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cell and fibronectin dynamics during branching morphogenesis.</a> J. Cell Sci. 119, 3376-3384 (2006).</li>
<li>Wei, C., Larsen, M., Hoffman, M. P., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+and+branching+morphogenesis+of+primary+salivary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Self-organization and branching morphogenesis of primary salivary epithelial cells.</a> Tissue Eng. 13, 721-735 (2007).</li>
<li>Zheng, C., Baum, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+viral+and+mammalian+promoters+for+use+in+gene+delivery+to+salivary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Evaluation of viral and mammalian promoters for use in gene delivery to salivary glands.</a> Mol. Ther. 12, 528-536 (2005).</li>
<li>Hsu, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+gene+transfer+to+developing+mouse+salivary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Dent.+Res%22%5BJournal%5D)">Viral gene transfer to developing mouse salivary glands.</a> J. Dent. Res. 91, 197-202 (2012).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De ex vivo epitheliale-mesenchymale recombinatie techniek werd voor het eerst gepubliceerd voor submandibulaire speekselklieren in 1981 16. In dit protocol, we breiden de oorspronkelijke methode, met behulp van adenovirale infectie aan epitheliale cellen genexpressie te manipuleren in het kader van een gerecombineerde klier. Aangetoond dat het percentage van de epitheliale cellen geïnfecteerd met het adenovirus, dat het percentage cellen die zijn geïnfecteerd afhankelijk van de eigenschappen van de v...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> DMEM / Ham &#39;s F12-medium zonder fenolrood </td><td> Life Technologies </td><td> 21041-025 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilline en streptomycine </td><td> Life Technologies </td><td> 15070-163 </td><td> 10X voorraad </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Life Technologies </td><td> 17105-041 </td><td> Bevriezen eenmalig gebruik monsters bij-20C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A2934-100G </td><td> Fractie V, lage endotoxine </td></tr><tr><td> Adeno-X-GFP </td><td> BD Biosciences </td><td> 8,138-1 </td><td> Moet een hoge titer (1x10 10 pfu / ml) zijn. CsCl gezuiverde virussen effectiever zijn dan een kolom gezuiverd virus in deze assay. </td></tr><tr><td> 16% Paraformaldehyde </td><td&gt; Electron Microscopy Sciences </td><td> 15710 </td><td> Verdund tot 2% in PBS met 5% sucrose (w / v) </td></tr><tr><td> 1X fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) </td><td> Life Technologies </td><td> 70011-044 </td><td> Bereid uit 10X voorraad </td></tr><tr><td> Balanced Salt Hank&#39;s oplossing </td><td> Life Technologies </td><td> 14175095 </td><td> no Calcium, geen magnesium, geen fenolrood </td></tr><tr><td> Transferrine </td><td> Sigma </td><td> T8158 </td><td> 25 mg / ml voorraadoplossing in DMEM/F12 media. Bevriezen eenmalig gebruik monsters bij-20C </td></tr><tr><td> L-ascorbinezuur (vitamine C) </td><td> Sigma </td><td> A4403 </td><td> 75 mg / ml voorraadoplossing in DMEM/F12 media.Freeze eenmalig gebruik monsters bij-20C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabel 1. Lijst van reagentia die voor SMG recombinatie protocol. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td&gt; <td></td></tr><tr><td> 10 cm steriel plastic schaaltjes </td><td> Corning </td><td> 430167 </td><td> Niet weefselkweek behandelde platen kunnen ook worden gebruikt. </td></tr><tr><td> Stereo ontleden microscoop met doorvallend licht-basis </td><td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td> Eventuele stereo-dissectiemicroscoop kan worden gebruikt dat is voorzien van een doorvallend licht-basis. </td></tr><tr><td> 35 mm weefselkweekplaten </td><td> Valk </td><td> 353001 </td><td> Niet weefselkweek behandelde platen kunnen ook worden gebruikt. </td></tr><tr><td> Diameter van 50 mm microwell gerechten </td><td> MatTek Corporation </td><td> P50-G-1.5-14F </td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore Track-Etch membraanfilters </td><td> Whatman papier </td><td> 110405 </td><td> 13 mm diameter, 0,1 mm poriegrootte </td></tr><tr><td> Widefield fluorescentiemicroscoop </td><td> Carl Zeiss, USA </td><td> Axio Observer Z1 </td><td> Elke fluorescentie microscoop (rechtop, inverted of stereo dissectiemicroscoop) kan worden gebruikt om GFP expressie controleren bij een lage vergroting met een aangesloten digitale camera. </td></tr><tr><td> Confocale microscoop </td><td> Leica Microsystems </td><td> TCS SP5 </td><td> Confocale microscopie is nodig om gedetailleerde celstructuren te zien. Elke confocale microscoop kunnen worden gebruikt. </td></tr><tr><td> Timed-zwangere vrouwelijke muizen, stam CD-1 of ICR </td><td> Charles River Labs </td><td></td><td> Embryo&#39;s geoogst op dag 13 (dag met plug ontdekking aangeduid als dag 0). </td></tr><tr><td> Scalpel # 11 </td><td> Fine Science Tools </td><td> 10.011-00 </td><td></td></tr><tr><td> Scalpelhouder # 3 </td><td> Fine Science Tools </td><td> 10.003-12 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 5 tang inox-legering, 0.05mm X 0.02mm </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.252-20 </td><td> Ideaal voor het oogsten van klieren uit embryo&#39;s </td></tr><tr><td&gt; Dumont # 5 pincet dumostar legering, 0.05mm X 0.01mm </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.295-20 </td><td> Fine tips zijn nodig voor het verwijderen van epitheel mesenchym. Tungsten naalden kunnen ook worden gebruikt. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabel 2. Apparatuur gebruikt in de SMG recombinatie protocol. </td></tr></tbody></table>

genetische modificatie en recombinatie van speekselklier orgel culturen

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Vertakkende morfogenese optreedt tijdens de ontwikkeling van vele organen en de muis embryonale submandibulaire klier (SMG) is een klassieke model voor de studie van vertakking morfogenese. In ontwikkelingslanden SMG impliceert dit proces iteratieve stappen van epitheliale knop en kanaal vorming uiteindelijk leiden tot een complex netwerk van vertakte acini en leidingen, die dienen te produceren wijzigen en / transporteren speeksel, respectievelijk in de mondholte 1 - 3. De epitheel-geassocieerde basaalmembraan en aspecten van de mesenchymale compartiment zoals de mesenchymcellen, groeifactoren en extracellulaire matrix, geproduceerd door deze cellen zijn essentieel voor de vertakking mechanisme, hoewel hoe de cellulaire en moleculaire gebeurtenissen worden gecoördineerd echter niet goed begrepen 4 . De studie van de moleculaire mechanismen die epitheliale morfogenese ons begrip van ontwikkelingsmechanismen en geeft inzicht in mogelijke geregenereerdtieve geneeskunde benaderingen. Deze studies door het ontbreken van effectieve methoden voor genetische manipulatie van de speekselklieren epitheel belemmerd. Momenteel adenovirale transductie de meest effectieve methode voor het richten epitheelcellen in volwassen klieren in vivo 5. Echter in embryonale explantaten, dichte mesenchym en de kelder membraan rond de epitheelcellen belemmert virale toegang tot de epitheelcellen. Als het mesenchym wordt verwijderd, kan het epitheel worden getransfecteerd met adenovirussen en epitheliale beginselen kunnen hervatten vertakking morfogenese in aanwezigheid van Matrigel of laminine-111 6,7. Mesenchym-vrij epitheliale rudiment groei vereist ook extra suppletie met oplosbare groeifactoren en niet volledig herhalen vertakking morfogenese als het zich voordoet in intacte klieren 8. Hier beschrijven we een techniek die adenovirale transductie van epitheelcellen en cultuur van de getransfecteerde e vergemakkelijktpithelium met bijbehorende mesenchym. Na microdissectie van de embryonale SMG, verwijdering van het mesenchym en virale infectie van het epitheel met een GFP-bevattende adenovirus, aangetoond dat het epitheel spontaan recombineert met ongeïnfecteerde mesenchym met vermelding intact SMG glandulaire structuur en vertakking morfogenese. De genetisch gemodificeerde epitheliale celpopulatie kan eenvoudig worden gecontroleerd met standaard fluorescentiemicroscopiemethodes als fluorescent-gemerkte adenovirale constructen gebruikt. Het weefsel recombinatie hier beschreven methode is momenteel de meest efficiënte en toegankelijke methode voor transfectie van epitheelcellen met een wild-type of mutant vector in een complex 3D weefsel construct dat niet nodig genereren van transgene dieren.

De stroom van de belangrijkste experimentele stappen wordt geschetst in figuur 1. Een voorbeeld van een intact SMG, een geïsoleerde epitheliale rudiment en de bijbehorende mesenchym zijn weergegeven in figuur 2. Helderveld beelden van gerecombineerde SMG, die nog steeds ondergaan vertakkende morfogenese indien gekweekt ex vivo gedurende de aangegeven tijden, worden getoond in Figuur 3. Gerecombineerde klieren gekweekt gedurende 48 uur tot expressie epitheliale ...

Een techniek om genetisch te manipuleren epitheelcellen binnen het gehele<em&gt; Ex vivo</em&gt; Gekweekte embryonale muis submandibulaire klieren (SMG) met behulp van virale gen-overdracht wordt beschreven. Deze methode maakt gebruik van het aangeboren vermogen van SMG epitheel en mesenchym spontaan recombineren na scheiding en infectie van epitheliale rudiments met adenovirale vectoren.

Genetische Modificatie en recombinatie van speekselklier Orgel culturen

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Het algemene doel van deze procedure is om de expressie van een gewenst eiwit in het epitheel van de muis, embryonale submandibulaire speekselklier, te veranderen met behulp van adenovirale constructen. Dit wordt bereikt door embryo's te verzamelen op dag 13 van de embryonale ontwikkeling en de submandibulaire speekselklieren te disseceren. Vervolgens worden de epitheliële rudimenten gescheiden van het omringende mesenchym en geweekt in een virusbevattende cultuur.Na het wassen van het rudiment wordt het medium geïncubeerd in matrigel bevattend medium, en we combineren dit met drie van de mesenchymen voor ex vivo cultivering. Veranderingen in de niveaus van de doelwitten en de effecten hiervan op de vertakkingsmorfogenese kunnen worden geanalyseerd met behulp van immunochemie en standaard microscopie of westerse bloedanalyse. Deze techniek stelt ons in staat om slechts één weefselcompartiment in een complex orgaan genetisch te modificeren en veranderingen in een herstelde hele orgaanexplaant te monitoren zonder een transgeen organisme te maken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden is dat het de expressie van een wild type of dominant negatief eiwit mogelijk maakt binnen het epitheelcompartiment.Volg de standaardprocedures en verzamel eerst 13 embryo's in 10 centimeter schalen met 25 milliliters medium. Vervolgens, met behulp van een pincet, verwijder de embryo's uit hun zakken en breng ze over naar een 10 centimeter schaal met 25 milliliters D-M-E-M-F 12 met pen strep onder een stereoscoop met een getransmitteerde lichtbron, plaats het embryo op een schone glazen plaat. Scheid nu de hoofden van de embryo's met een schuine snede net onder de onderkaak of mandibula en isoleer de onderkaken door een snede te maken onder de bovenkaak.Breng vervolgens de onderkaken over in drie milliliters D-M-E-M-F 12 met pen strep in een 35 millimeter weefselcultuurschaal. Plaats nu een kaak terug op de glazen plaat op het stadium zodat de tong het glas raakt en in de richting van de 12 uur positie wijst. Gebruik een zijde van twee gekruiste pincetten in een schaarbeweging om het onderste derde deel van de kaak te verwijderen en weg te gooien.Draai vervolgens de kaak 90 graden naar uw dominante hand toe en snij met een schaarbeweging door het bovenste gedeelte van de kaak. Schil het overtollige weefsel weg en leg de SMG's bloot die zich onder het weefsel bevinden. Er zal er een aan elke kant zijn, dicht bij de basis van de tong aan elke kant.Gebruik een paar pincetten om het weefsel naast de tong vast te houden en het andere paar om de SMG van de tong los te maken. Op dit punt kunnen de grotere SMG en aangrenzende sublinguale klier intact worden gekweekt met het omringende mesenchym. Anders, ga verder naar het volgende gedeelte.Begin door ten minste vijf speekselklierplanten in een glazen bodem 50 millimeter microwelschaal te plaatsen met 200 microliters HBSS plus diss pasta. Incubeer de klieren gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius. Gebruik vervolgens een 200 microliter pipetpunt om voorzichtig de diss pasta oplossing te aspireren zonder de klieren direct te verstoren.Voeg 200 microliters D-M-E-M-F 12 medium met BSA toe. Gebruik een paar nummer vijf pincetten met fijne punten om het losgemaakte mesenchymweefsel met de sublinguale klier voorzichtig te scheiden van de epitheliale uitlopers en kanalen van de grotere submandibulaire klier. Zorg ervoor dat het epitheel zo intact mogelijk blijft. Selecteer vervolgens een hoogwaardige 200 microliter pipetpunt met een gladde rand pre aan de punt in D-M-E-M-F 12 BSA medium.Pipet vervolgens voorzichtig de mechy vrije epitheliale rudimenten in een nieuwe 50 millimeter diameter microwelschaal met 200 microliters D-M-E-M-F 12 plus pen strep. Gooi uiteindelijk in de schaal met de mesenchymstukken alle niet-mesenchymale weefsel weg. Dit omvat de sublinguale klieren en eventuele losgemaakte submandibulaire klieruitlopers.Zet het resterende mesenchym opzij. Bereid eerst 200 microliters infectiemedium voor bij de optimale titerconcentratie van een door cesiumchloride gradient gezuiverd viraal preparaat. Verwijder nu onder de dissectiescoop het medium uit de schaal met de vijf epitheliale rudimenten.Voeg vervolgens snel 200 microliters van het infectiemedium toe, houd de rudimenten altijd nat met behulp van pincetten. Scheid de epitheliale rudimenten ver van elkaar om te voorkomen dat ze aan elkaar plakken en laat ze op de bodem van de schaal bezinken. Laat de rudimenten vervolgens een uur in het virale medium incuberen bij kamertemperatuur met minimale verstoring.Controleer de rudimenten elke 15 minuten om er zeker van te zijn dat ze niet dicht bij elkaar zijn gekomen. Scheid ze indien nodig met pincetten. Na de incubatie onder de dissectiescoop, verwijder voorzichtig het virale medium en gooi het goed weg, zorg ervoor dat de rudimenten niet worden verstoord.Was vervolgens de rudimenten twee keer met 200 microliters vers medium. Deze wasbeurten zijn cruciaal om elk virus dat zwak aan het epitheel is gehecht te verwijderen en om infectie van het mesenchym te voorkomen. Volg de tweede was met 200 microliters medium, voortzetting 2% matrigel, opnieuw, zorg ervoor dat de rudimenten niet klonteren.Laat de rudimenten vervolgens 20 minuten bij kamertemperatuur incuberen met behulp van een Prewitt 200 microliter pipetpunt, plaats vijf rudimenten op een gekarteld membraanfilter, dat drijft op 200 microliters cultuurmedium in een glazen bodem microwelschaal. Gebruik een pipetpunt of pincet om overtollig medium van de bovenkant van het filter te verwijderen, zodat het filter niet zinkt en de epitheliale rudimenten op hun plaats blijven. Plaats vervolgens alle mesenchymstukken die zijn afgeleid van drie tot vier klieren rond elk epitheliaal rudiment, zorg ervoor dat ze in direct contact staan. Recombinatie van het mesenchym van drie tot vier klieren met het enkele virologisch geïnfecteerde epitheliale rudiment is

genetic-modification-recombination-salivary-gland-organ

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een geoptimaliseerde protocol voor de isolatie van stamcellen van de muis speekselklier wordt beschreven. De methode maakt gebruik van enzymatische en mechanische spijsvertering, en laat de isolatie van salispheres met cellen met kenmerken van stamcellen.

Isolatie van Mouse speekselklier Stem Cells

This video presents the protocol for culturing salispheres, the three-dimensional spheroids derived from salivary glands. The salispheres can be further used to assess the impact of head and neck cancer on saliva production from salivary glands of affected human patients.

Culturing Salispheres from Salivary Gland Tissue: A Method to Develop Salispheres from Human Salivary Gland Derived Epithelial Cells

De traanklier (LG) is een vertakking orgaan dat de waterige componenten van tranen nodig produceert voor het behoud van de visie en de gezondheid van het oog. Hier beschrijven we muizen LG dissectie en ex vivo cultuur technieken te ontcijferen signaalwegen betrokken bij LG ontwikkeling.

Het manipuleren van de muizen traanklier

We presenteren een gedetailleerde aanpak voor het uitvoeren van speeksel inzameling, met inbegrip van lymfkliertest tracheostomy en het isolement van de drie grote speekselklieren.

Gefractioneerde lymfkliertest speeksel functioneel-diagnostiek via Pilocarpine stimulatie volgende straling

Met behulp van driedimensionale organotypic culturen te visualiseren morfologie en functionele markers van speekselklieren kunnen nieuwe inzichten in de mechanismen van weefselbeschadiging na straling. Hier beschreven is een protocol bij sectie, cultuur, bestralen, vlek, en beeld 50 – 90 μm dikke speekselklier secties voorafgaand aan en na blootstelling aan ioniserende straling.

De behandeling van de straling van Organotypic culturen van submandibulaire en Parotis speekselklieren modellen sleutel in vivo kenmerken

We presenteren een methode voor het isoleren en cultiveren van primaire menselijke speekselklier-afgeleide epitheliale cellen. Deze cellen vertonen genexpressie patronen consistent met hen van speeksel epitheel oorsprong en kunnen worden gekweekt als salispheres op kelder membraan matrices afgeleid van engelbreth-Holm-Swarm tumorcellen of als monolagen op behandelde cultuur gerechten.

Isolatie van speeksel epitheelcellen van menselijke speekselklieren voor in vitro groei als Salispheres of monolagen

Speekselklieren zijn voorgesteld als een weefseldoelplaats voor gentherapie, vooral op het gebied van vaccinatie door genoverdracht. We demonstreren genafgifte in een niet-menselijk primatenmodel met behulp van retrograde parotisinfusie.

Retrograde parotisklierinfusie via het kanaal van Stensen in een niet-menselijke primaat voor vectored genafgifte

Immunofluorescerende beeldvorming wordt beperkt door het vermogen om complexe, tijdsafhankelijke biologische processen in slechts één momentopname in de tijd waar te nemen. Deze studie schetst een live-imaging-benadering die wordt uitgevoerd op nauwkeurig gesneden plakjes submandibulaire klier van muizen. Deze aanpak maakt de real-time observatie mogelijk van cel-cel interacties tijdens homeostase en de processen van regeneratie en herstel.

Ondervraging van cel-celinteracties in de speekselklier via ex vivo beeldvorming van levende cellen

De mug middendarm en de speekselklieren zijn belangrijke in-en uitgangen voor vector ziekteverwekkers zoals Plasmodium falciparum en het dengue virus. Deze video toont de dissectie technieken voor het verwijderen van de middendarm en de speekselklieren van Aedes aegypti muggen.

Ontleding van Midgut en speekselklieren van de Ae. aegypti Muggen

PDMS Device Fabrication en modificatie van het oppervlak

Leer genetische modificatie van epitheelcellen in embryonale muizen speekselklieren met adenovirale vectoren. Deze methode analyseert branching morfogenese zonder transgene organismen te creëren.

Genetische Modificatie en recombinatie van speekselklier Orgel culturen

Meer video's verkennen