Name: Klinische toepassing van Sleeping Beauty En Kunstmatige antigeen presenterende cellen genetisch te wijzigen T-cellen uit perifeer en navelstrengbloed (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Leer T-cellen genetisch modificeren met het Sleeping Beauty-systeem voor immunotherapie tegen kanker. Deze methode produceert klinisch relevante aantallen CAR-positieve T-cellen voor adoptieve celtherapie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen graag dr. Carl juni (University of Pennsylvania) bedanken voor hulp het genereren van en het verstrekken van AAPC kloon # 4 en Dr Perry Hackett (University of Minnesota) voor hulp bij het SB-systeem. Grant ondersteuning: Cancer Center Core Grant (CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303), R33 (CA116127); P01 (CA148600); SPORE (CA136411); Albert J Ward Foundation; Burroughs Wellcome Fund; Gillson Longenbaugh Foundation; Cancer Prevention en Research Institute van Texas; CLL Global Research Foundation; Ministerie van Defensie; Estate van Noelan L. Bibler; Harry T. Mangurian, Jr, Fonds voor Leukemie Immunotherapie, Instituut voor Persoonlijke Cancer Therapy, leukemie en lymfoom Society; Lymfoom Research Foundation; MDACC&#39;s Sister instelling Network Fonds; Miller Stichting, de heer Herb Simons, de heer en mevrouw Joe H. Schalen, de heer Thomas Scott; Nationale Stichting voor Kankeronderzoek; Pediatric Cancer Research Foundation; Productie assistance voor cellulaire therapieën (PACT), William Lawrence en Blanche Hughes Children&#39;s Foundation.

<html> Dag 0 of voordat 1. Isolatie van mononucleaire cellen (MNC) uit PB en UCB <ol><li> Verdun PB met gelijk volume, en UCB met vier volumes PBS-EDTA. </li><li> Langzaam laag verdund bloed (25 ml) op Ficoll (12 ml) in een 50 ml centrifugebuis (s) en centrifugeer bij 400 xg gedurende 30 - 40 min (geen rem). </li><li> Opnemen en overbrengen mononucleaire celfractie (interface) met een transferpipet een verse 50 ml centrifugebuis. </li><li> Breng het volume op 50 ml met PBS-EDTA en centrifugeer bij 450 xg gedurende 10 minuten. </li><li> Zuig het supernatant voorzichtig resuspendeer de celpellet (s) in 50 ml compleet Culture Media (CCM) en centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 minuten. </li><li> Voorzichtig opnieuw te schorten en het zwembad de cel pellets in CCM en het uitvoeren van een aantal cellen met behulp van trypan blauw uitsluiting methode (Cellometer, PBMC programma). </li><li> MNC kan nu worden gebruikt voor elektroporatie (Nucleofectie) of ingevroren voor toekomstig gebruik. </li></ol>title &quot;&gt; 2. Bereiding van T cellen voor elektroporatie op dag 0 <ol><li> Bij gebruik gecryopreserveerde MNC snel ontdooien voldoende cellen voor een volledige schaal elektroporatie (2 x 10 8 toevoeging ~ 20% voor hun rekening celverlies tijdens centrifugeren en 2 uur incubatie) in 37 ° C water bad. Bij gebruik van vers geïsoleerde MNC overgaan tot 2,3 stap. </li><li> Zachtjes resuspenderen en breng cellen een geschikt bemeten centrifugebuis (fen) voorverwarmd Compleet fenolvrij RPMI kweekmedium (RPMI-PF) en gecentrifugeerd bij 200 xg gedurende 10 min (geen rem), aspiratie supernatant. </li><li> Resuspendeer de MNC in PF-RPMI, voert een celgetal (Cellometer) en breng cellen een geschikt bemeten celkweek vat (s) bij een concentratie van 10 6 cellen / ml. </li><li> Incuberen in een bevochtigde 37 ° C / 5% CO2 incubator gedurende 2 uur ± 30 min. </li><li> Breng de MNC om steriele centrifugebuis (s), spin bij 200 xg gedurende 5 minuten (geen remmen), aspireer het supernatant voorzichtig re-schorten en combineren de cel pellet (s) in RPMI-PF. </li><li> Voer een celgetal (Cellometer) en bereken het volume van de celsuspensie voorschriften (2 x 10 8 MNC). </li><li> Breng het berekende volume van een steriele 50 ml centrifugebuis en centrifugeren bij 200 xg gedurende 10 min (geen rem). </li><li> Zuig het supernatant zodat er geen resterende media blijft zacht en resuspendeer door te tikken kant van de buis. </li></ol> 3. Elektroporatie (Nucleofectie) van MNC (volledig schaalbereik proces met behulp van 10 cuvetten) op dag 0 <ol><li> Pre-incubeer een steriele 12-well plaat met 10 putjes met 4 ml warm PF-RPMI in een bevochtigde 37 ° C / 5% CO2 incubator. </li><li> Bereid en pre-warm de Lonza Nucleofector Oplossing Human T-cel kit (gereconstitueerd volgens de aanwijzingen van de fabrikant, <a href="http://www.lonza.com" target="_blank">www.lonza.com</a> ) tot omgevingstemperatuur in een bioveiligheid kabinet (BSC). </li><li> Bereid Nucleofector oplossing / DNA master mix door adding 100 pi aangevuld Nucleofector oplossing 15 ug transposon (supercoiled DNA plasmide aangeduid als CD19RCD28/pSBSO) en 5 ug transposase (supercoiled DNA plasmide aangeduid als pCMV-SB11) per reactie / cuvette. </li><li> Dispergeer de celpellet (uit stap 2.8) door voorzichtig tikken op de zijkant van de centrifugebuis en resuspendeer in Nucleofectie oplossing / DNA master mix (uiteindelijke celconcentratie: 2 x 10 7 cellen/100 pl). </li><li> Breng zorgvuldig 100 pi van de celsuspensie (van stap 3.4) toe aan elk van de tien (10) Lonza Nucleofectie cuvetten, voorzichtig om luchtbellen te vermijden. </li><li> Tik een keer op het kuvet en electroporate met behulp van het programma U-014 (voor niet-gestimuleerde T-cellen). </li><li> Breng de cuvettes en de 12-well plaat (Stap 3.1) in de BSC. </li><li> Oogst de geëlektroporeerde cellen van elke cuvette met een fijne punt Amaxa transferpipet door toevoeging ~ 500 pi van de voorverwarmde kweekmedium van de overeenkomstige put (12-well plaat bereid Step 3,1) en zet de plaat een bevochtigde 37 ° C / 5% CO2 incubator gedurende 2 uur ± 30 min. </li><li> Na een 2 uur incubatie oogst en breng de cellen van alle wells om een ​​steriele centrifugebuis. </li><li> Was de cellen door centrifugatie bij 140 xg gedurende 8 min, kamertemperatuur, zonder rem en zuig en verwijder het supernatant zodat geen resten van het medium de celpellet omvat. </li><li> Dispergeer de cel pellet door voorzichtig tikken de zijde van de centrifugebuis en voorzichtig resuspendeer in CCM om een ​​enkele celsuspensie te bereiken. </li><li> Voer cellen en pas celconcentratie tot 10 6 cellen / ml in CCM. </li><li> Overdracht celsuspensie aan celkweek kolf (s) en plaats in incubator &#39;s nachts. </li><li> Processtappen 2,1 tot 3,8 werden herhaald voor control: EGFP-getransfecteerde cellen (5 x 10 6 cellen / cuvette met 5 ug Amaxa control EGFP plasmide, pmaxGFP). </li></ol> Dag 1 van 1 e en VolgendeStimuleringscycli 4. Analyse van CAR Expression door flowcytometrie op dag 1 <ol><li> Oogst de geëlektroporeerde cellen en het uitvoeren van een aantal cellen met behulp van trypan blauw uitsluiting methode (hemocytometer). </li><li> Stain cellen (1 tot 2 x 10 6) met antilichaam specifiek voor CD3, CD4, CD8, en menselijk IgG Fcy (als een meting van CAR expressie). </li><li> Acquire cellen op FACS Calibur en analyseren van de gegevens met behulp van FCS Express-software om de expressie van CAR berekenen. <ol><li> Bereken CAR + cellen in cultuur door de formule: (Aantal Totaal levensvatbare cellen) x (% CAR + cellen) = Aantal CAR + cellen </li></ol></li></ol> 5. Bereiding van AAPC (kloon # 4) op dag 1. AAPC (kloon # 4) werden afgeleid uit K562 cellen (Parental Line verkregen uit American Type Culture Collection) naar Co-express Gewenste T Cell Co-stimulerende Molecule <ol><li> Een hoeveelheid ontdooien van bevroren 100 Gy bestraald AAPC in een 37 °; C waterbad. </li><li> Cellen werden tweemaal gewassen door centrifugatie bij 400 xg, 10 min in CCM en geteld met Cellometer (Trypan blue uitsluiting). </li><li> Bereken aantal levensvatbare AAPC vereist voor stimulatie: (Aantal CAR + cellen) x 2 = Aantal bestraalde AAPC nodig </li></ol> 6. AAPC-gemedieerde stimulatie van CAR + T-cellen op dag 1 Begin van 1 e en Volgende stimuleringscycli <ol><li> Meng geëlektroporeerde cellen (expressie CAR) en γ-bestraalde AAPC (kloon # 4) in een steriele container in een verhouding van 1:2 (CAR + cel: levensvatbare AAPC) in CCM. <ol><li> Let op de AAPC verhouding wordt aangepast voor de expressie van CAR basis van flowcytometrie de dag na elektroporatie. </li></ol></li><li> Voeg IL-21 (30 ng / ml) aan de celsuspensie. </li><li> Aliquot in T-75 cm2 fles (s) en / of Vue Life Culture zakken bij een concentratie van 10 6 cellen / ml en terug te incubatof. </li></ol> Dagen 3, 5 7. Vervolg Cultuur van CAR + T-cellen <ol><li> Voer een half-media verandering vullen IL-21 en T-cellen te handhaven in een concentratie van 10 6 cellen / ml. </li></ol> Dag 7 8. Einde van de Eerste AAPC-gemedieerde stimulatie Cycle <ol><li> Oogst cellen, tellen en kleuren voor CD3, CD4, CD8, en Fcy (CAR) en ga verder tot 10,1 stap. </li></ol> 9. Depletie van CD56 + cellen (gewoonlijk tussen 7 en 14 dagen na elektroporatie) <ol><li> Voer een CD56 depletie met behulp van paramagnetische kralen als CD56 + CD3 neg lymfocyten ≥ 10%. </li></ol> Stimuleringscycli # 2, # 3, # 4 &amp; Overeenkomstige tot dagen 8 → 14, Dagen 15 → 21, &amp; Dagen 22 → 28 10. Recursieve Toevoeging van AAPC aan T-cellen doorgeven aan Klinisch-voldoende <ol><li> Herhaal de stimulatie vann proces (4 keer) zoals beschreven in stappen 4.3-8.1. </li><li> Voeg IL-2 (50U/ml) aan de culturen die beginnen op dagen 7, 14 en 21, en vervolgens bij elke media-verandering (drie keer per week, op maandag-woensdag-vrijdag schema). </li><li> Cryopreserveren (archief) dan T-cellen als nodig is. <ol><li> T-cellen ingevroren met behulp van gecontroleerde snelheid vriezer. </li></ol></li></ol> Dag 28 11. Eind vorig AAPC-gemedieerde stimulatie cyclus: Harvest T-cellen <ol><li> Cryopreserveren T-cellen voor een release testen en infusie. </li></ol>

<ol><li>Jena, B., Dotti, G., Cooper, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redirecting+T-cell+specificity+by+introducing+a+tumor-specific+chimeric+antigen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Redirecting T-cell specificity by introducing a tumor-specific chimeric antigen receptor.</a> Blood. 116, 1035-1044 (2010).</li>
<li>Ertl, H. C., Zaia, J., Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+the+clinical+application+of+chimeric+antigen+receptor+T+cells%3A+observations+from+a+recombinant+DNA+Advisory+Committee+Symposium+held%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Considerations for the clinical application of chimeric antigen receptor T cells: observations from a recombinant DNA Advisory Committee Symposium held.</a> Cancer Res. 71, 3175-3181 (2010).</li>
<li>Kohn, D. B., Dotti, G., Brentjens, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CARs+on+track+in+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">CARs on track in the clinic.</a> Mol. Ther. 19, 432-438 (2011).</li>
<li>Aronovich, E. L., McIvor, R. S., Hackett, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sleeping+Beauty+transposon+system%3A+a+non-viral+vector+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The Sleeping Beauty transposon system: a non-viral vector for gene therapy.</a> Hum. Mol Genet. 20, R14-R20 (2011).</li>
<li>Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transposon+and+transposase+system+for+human+application%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">A transposon and transposase system for human application.</a> Mol. Ther. 18, 674-683 (2010).</li>
<li>Izsvak, Z., Hackett, P. B., Cooper, L. J., Ivics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+Sleeping+Beauty+transposition+into+cellular+therapies%3A+victories+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Translating Sleeping Beauty transposition into cellular therapies: victories and challenges.</a> Bioessays. 32, 756-767 (2010).</li>
<li>Kebriaei, P., Huls, H., Bipulendu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infusing+CD19-directed+T+cells+to+augment+disease+control+in+patients+undergoing+autologous+hematopoietic+stem-cell+transplantation+for+advanced+B-lymphoid+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Infusing CD19-directed T cells to augment disease control in patients undergoing autologous hematopoietic stem-cell transplantation for advanced B-lymphoid malignancies.</a> Hum. Gene Ther. 23 (5), 444-450 (2012).</li>
<li>Williams, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleeping+beauty+vector+system+moves+toward+human+trials+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Sleeping beauty vector system moves toward human trials in the United States.</a> Mol. Ther. 16, 1515-1516 (2008).</li>
<li>Geurts, A. M., Hackett, C. S., Bell, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+prediction+of+insertion-site+preferences+of+transposons+into+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Structure-based prediction of insertion-site preferences of transposons into chromosomes.</a> Nucleic Acids Res. 34, 2803-2811 (2006).</li>
<li>Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+reconstruction+of+Sleeping+Beauty%2C+a+Tc1-like+transposon+from+fish%2C+and+its+transposition+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells.</a> Cell. 91, 501-510 (1997).</li>
<li>Izsvak, Z., Ivics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleeping+beauty+transposition%3A+biology+and+applications+for+molecular+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Sleeping beauty transposition: biology and applications for molecular therapy.</a> Mol Ther. 9, 147-156 (2004).</li>
<li>Manuri, P. V., Wilson, M. H., Maiti, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+transposon%2Ftransposase+system+to+generate+CD19-specific+T+cells+for+the+treatment+of+B-lineage+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for the treatment of B-lineage malignancies.</a> Hum. Gene Ther. 21, 427-437 (2010).</li>
<li>Singh, H., Figliola, M. J., Dawson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+CD19-specific+T+cells+with+IL-21+signaling+can+improve+adoptive+immunotherapy+of+B-lineage+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Reprogramming CD19-specific T cells with IL-21 signaling can improve adoptive immunotherapy of B-lineage malignancies.</a> Cancer Res. 71, 3516-3527 (2011).</li>
<li>Kowolik, C. M., Topp, M. S., Gonzalez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD28+costimulation+provided+through+a+CD19-specific+chimeric+antigen+receptor+enhances+in+vivo+persistence+and+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells.</a> Cancer Res. 66, 10995-11004 (2006).</li>
<li>Jin, Z., Maiti, S., Huls, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hyperactive+Sleeping+Beauty+transposase+SB100X+improves+the+genetic+modification+of+T+cells+to+express+a+chimeric+antigen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor.</a> Gene Ther. 18, 849-856 (2011).</li>
<li>Davies, J. K., Singh, H., Huls, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+CD19+redirection+and+alloanergization+to+generate+tumor-specific+human+T+cells+for+allogeneic+cell+therapy+of+B-cell+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Combining CD19 redirection and alloanergization to generate tumor-specific human T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies.</a> Cancer Res. 70, 3915-3924 (2010).</li>
<li>Kebriaei, P., Kelly, S. S., Manuri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CARs%3A+driving+T-cell+specificity+to+enhance+anti-tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci.+%28Schol.+Ed%29%22%5BJournal%5D)">CARs: driving T-cell specificity to enhance anti-tumor immunity.</a> Front. Biosci. (Schol. Ed). 4, 520-531 (2012).</li>
<li>Singh, H., Manuri, P. R., Olivares, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redirecting+specificity+of+T-cell+populations+for+CD19+using+the+Sleeping+Beauty+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system.</a> Cancer Res. 68, 2961-2971 (2008).</li>
<li>Nakazawa, Y., Huye, L. E., Salsman, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PiggyBac-mediated+cancer+immunotherapy+using+EBV-specific+cytotoxic+T-cells+expressing+HER2-specific+chimeric+antigen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">PiggyBac-mediated cancer immunotherapy using EBV-specific cytotoxic T-cells expressing HER2-specific chimeric antigen receptor.</a> Mol. Ther. 19, 2133-2143 (2011).</li>
<li>Huang, G., Yu, L., Cooper, L. J., Hollomon, M., Huls, H., Kleinerman, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+modified+T+cells+targeting+interleukin-11+receptor+alpha-chain+kill+human+osteosarcoma+cells+and+induce+the+regression+of+established+osteosarcoma+lung+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Genetically modified T cells targeting interleukin-11 receptor alpha-chain kill human osteosarcoma cells and induce the regression of established osteosarcoma lung metastases.</a> Cancer Res. 72, 271-281 (2012).</li>
<li>Huang, X., Guo, H., Kang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleeping+Beauty+transposon-mediated+engineering+of+human+primary+T+cells+for+therapy+of+CD19%2B+lymphoid+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Sleeping Beauty transposon-mediated engineering of human primary T cells for therapy of CD19+ lymphoid malignancies.</a> Mol. Ther. 16, 580-589 (2008).</li>
<li>Huang, X., Wilber, A., McIvor, R. S., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+transposons+for+modification+of+human+primary+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA transposons for modification of human primary T lymphocytes.</a> Methods Mol. Biol. 506, 115-126 (2009).</li>
<li>Hackett, P. B. Jr, Aronovich, E. L., Hunter, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+Sleeping+Beauty+transposon-mediated+gene+transfer+in+preclinical+animal+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of Sleeping Beauty transposon-mediated gene transfer in preclinical animal studies.</a> Curr. Gene Ther. 11, 341-349 (2011).</li>
<li>Suhoski, M. M., Golovina, T. N., Aqui, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+artificial+antigen-presenting+cells+to+express+a+diverse+array+of+co-stimulatory+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Engineering artificial antigen-presenting cells to express a diverse array of co-stimulatory molecules.</a> Mol. Ther. 15, 981-988 (2007).</li>
<li>Numbenjapon, T., Serrano, L. M., Singh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+artificial+antigen-presenting+cell+to+propagate+cytolytic+CD19-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Characterization of an artificial antigen-presenting cell to propagate cytolytic CD19-specific T cells.</a> Leukemia. 20, 1889-1892 (2006).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Transposon en transposase systemen, zoals van piggyBac 12,19 en SB 18,20-22, niet-virale benaderingen voor gentherapie die een alternatief viraal-bemiddelde transductie van klinische kwaliteit CAR + T-cellen. De SB werd gekozen als genoverdracht op basis van de mogelijke menselijke gentherapie 1,6,23. Wij ontwikkelden de dubbele technologieën van SB omzetting (een CAR voeren) en recursieve toevoeging van γ-bestraalde AAPC (genetisch gemodificeerde T-cellen die stabiel ophalen a CAR) dienen als platform technologie voor de vervaardiging van TAA T-cellen in overeenstemming met cGMP voor Fase I / II studies (Figuur 4). Na 28 dagen (vier van 7 dagen stimuleringscycli) van co-cultuur op γ-bestraalde AAPC, we doorgaans kunnen genereren ten minste ~ 10 10 genetisch gemodificeerde T-cellen geschikt voor toepassing op de mens. Indien nodig, kunnen extra stimulatie cycli worden uitgevoerd to genereren grotere aantallen genetisch gemodificeerde T-cellen. Bovendien als minder CAR + T cellen nodig, kan de aanpak elektroporatie en propagatie worden teruggebracht die minder cuvettes en overbrengen van slechts een subset van de numeriek uitgebreid T cellen voor volgende ronden van proliferatie AAPC aan het begin van elk Stimulatie cyclus. De meerderheid van de geëlektroporeerd en gepropageerd T cellen geoogst voor infusie stabiel tot expressie de CAR. De uitgroei van CD4 + en CD8 + T-cellen die onze 2e generatie CAR omvatten cellen met een geheugen / naïef fenotype vertonen drie kenmerken van omgeleid specificiteit. Ten eerste, de genetisch gemodificeerde T-cellen specifiek lyseren CD19 + targets anderzijds produceren IFN-γ in reactie op CD19 + stimulator cellen en ten derde prolifereren in reactie op CD19 + cellen feeder, alles in een CAR-afhankelijke wijze 13,18. Onze benadering van integraten CAR transgen door electro-overdracht van niet-virale DNA plasmiden uit de SB systeem kan worden uitgevoerd in rustende primaire T cellen uit PB en UCB. Wij en anderen hebben genetisch gemodificeerde K562 cellen als AAPC doeltreffend klinisch voldoende aantallen T cellen propageren voor infusie 24,25. De AAPC weefselkweek en milieu (bijvoorbeeld de toevoeging van IL-21) zijn aangepast zijn voor het genereren patiënt en donor-afgeleide CD19-specifieke T-cellen voor infuus na hematopoietische stamceltransplantatie (tabel 1) 13,18. Wij kunnen CAR + T-cellen van PB eenvoudig verkregen door venapunctie die vermijdt de kosten, ongemak, en het ongemak van het verkrijgen van MNC van PB door middel van aferese. De mogelijkheid om grote aantallen leiden CAR + T-cellen van een klein aantal MNC is bijzonder aantrekkelijk voor infusie T-cellen na allogene transplantatie UCB. Het kleine formaat en de anonimiteit van de neonatale donor verzet tegen re-Toegang deze persoon op een later tijdstip en slechts een beperkt aantal geoogst MNC zijn als uitgangsmateriaal voor T cel fabricagedatum te belemmeren hematopoiese. Verdere voorschotten aan het productieproces zijn op dit moment gewerkt aan een high throughput elektroporatie apparaat in combinatie met een volledig gesloten WAVE bioreactor te hanteren een minimum te beperken zijn. In totaal worden de SB en AAPC aantrekkelijk platforms CD19-specifieke CAR + T-cellen die kunnen worden aangepast om grote aantallen genetisch gemodificeerde T-cellen die alternatieve celoppervlak TAAs herkent overeenkomstig cGMP genereren.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagentia </td><td> Verkoper </td><td> Catalogusnummer </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagentia </td></tr><tr><td> DNA plasmide dat GFP (pmaxGFP) </td><td> Lonza </td><td> VPA-1002 (kit) </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> CliniMACS PBS-EDTA </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 70026 </td><td></td></tr><tr><td> HyQ RPMI-1640 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30096.01 </td><td></td></tr><tr><td> Fenolvrij RPMI-1640 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30605.01 </td><td></td></tr><tr><td> Foetaal runderserum Hyclone </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH3007003HI </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax(100x) </td><td> Gibco </td><td> 3505-061 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll-Paque </td><td> GE Healthcare Biosciences </td><td> 17-1440-02 </td><td></td></tr><tr><td> Recombinant menselijk IL-21 </td><td> PeproTech </td><td> AF-200-21 </td><td></td></tr><tr><td> Recombinant humaan IL-2 (Proleukin) </td><td> Novartis </td><td> NDC 65483-116-07 </td><td></td></tr><tr><td> Humane T-cel Kit (Nucleofector Solution) </td><td> Lonza </td><td> VPA-1002 </td><td></td></tr><tr><td> CliniMACS CD56 Reagens </td><td> Miltenyi </td><td> 70206 </td><td></td></tr><tr><td> FITC-geconjugeerd muis mAb specifiek voor menselijk CD3 </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td><td></td></tr><tr><td> APC-geconjugeerd muis mAb specifiek voor menselijk CD4 </td><td> BD Biosciences </td><td> 340443 </td><td></td></tr><tr><td> PerCPCy5.5 geconjugeerdmuizen-mAb specifiek voor menselijk CD8 </td><td> BD Biosciences </td><td> 341051 </td><td></td></tr><tr><td> PE-geconjugeerd aan F (ab &#39;) 2 fragment geit antilichaam specifiek voor menselijke Fcy </td><td> Invitrogen </td><td> H10104 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumazide </td><td> Sigma </td><td> S2002 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Disposables </td></tr><tr><td> 12-well plaat </td><td> Corning </td><td> 3513 </td><td></td></tr><tr><td> T-75 cm2 fles </td><td> Corning </td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td> Cultuur tassen </td><td> Vue Life </td><td> 290C; 750C </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml centrifugebuis </td><td> BD Biosciences </td><td> 352098 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><sTrong&gt; Apparatuur </td></tr><tr><td> Amaxa Nuceleofector II </td><td> Lonza </td><td> AAB-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Cellometer </td><td> Nexcelom Bioscience </td><td> Cellometer Vision </td><td></td></tr><tr><td> Sorvall Legend RT Centrifuge </td><td> Sorvall </td><td> 75004377 </td><td></td></tr><tr><td> BD FACS Calibur </td><td> BD Biosciences </td><td> 342975 </td><td></td></tr><tr><td> Gecontroleerde snelheid vriezer </td><td> Planer </td><td> Kryo 750 </td><td></td></tr><tr><td> Bestraler </td><td> CIS bio International </td><td> IBL-437 C # 09433 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> Expressie van moleculen (Endogene en Geïntroduceerd) </td></tr><tr><td> Cell Line </td> &lt;td&gt; Common Name </td><td> Het Type van cel </td><td> Uitgedrukt moleculen </td></tr><tr><td> CJKT64.86.41BBL.GFP-IL15.CD19 </td><td> Clone 4 </td><td> K562 </td><td> CD86, CD64, CD137L, CD19, GFP co-expressie met membraan gebonden IL-15 </td></tr></tbody></table> Volledige Culture Media (CCM) (bewaard bij 4 ° C gedurende maximaal 30 dagen) HyQ RPMI-1640/Phenol-free RPMI-1640 10% FBS 1% Glutamax Flowcytometrie Buffer (opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 30 dagen) PBS 2% FBS 0,1% natriumazide </td></tr></tbody></table>

klinische toepassing van<em&gt; sleeping beauty</em&gt; en kunstmatige antigeen presenterende cellen genetisch te wijzigen t-cellen uit perifeer en navelstrengbloed

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

De sterkte van klinische kwaliteit T-cellen kan worden verbeterd door gebruik gentherapie met immunotherapie een biologische product construeren met een mogelijke superior (i) de opname van tumor-geassocieerde antigenen (TAAs), (ii) persistentie na infusie (iii) mogelijke migratie naar tumorplaatsen en (iv) het vermogen om effectorfuncties recyclen in de tumor micro-omgeving. De meeste benaderingen van genetische manipulatie van T-cellen bij de mens ontworpen zijn gebruikt retrovirus en lentivirus voor de stabiele expressie van CAR 1-3. Deze aanpak, hoewel in overeenstemming met de huidige Good Manufacturing Practice (GMP), kan duur zijn als het gebaseerd is op de productie en afgifte van klinische-grade recombinant virus uit een beperkt aantal productie-installaties. De elektro-overdracht van plasmiden viraal is een aantrekkelijk alternatief omdat DNA transductie soorten kan worden geproduceerd klinische graad ongeveer 1/10 van de kosten van recombinmier GMP-grade virus. Om de efficiëntie van integratie hebben we aangepast Doornroosje (SB) transposon en transposase voor toepassing op de mens 4 tot 8 te verbeteren. Ons systeem gebruikt twee SB DNA plasmiden die bestaan ​​uit een transposon codeert voor een gen van belang (bijv. 2e generatie CD19-specifieke auto transgen, aangeduid CD19RCD28) en een transposase (bijv. SB11) die inserts het transgen in TA dinucleotide herhaalt 9-11 . Om klinisch voldoende genetisch gemodificeerde T-cellen we K562 afkomstige kunstmatige antigen presenterende cellen (AAPC) (kloon # 4) gemodificeerd om een TAA (bijv. CD19) en de T-cel costimulatoire moleculen CD86, CD137L, drukken genereren membraangebonden versie van interleukine (IL) -15 (peptide gefuseerd aan gemodificeerde IgG4 Fc gebied) en CD64 (Fc-γ receptor 1) voor het laden van monoklonale antilichamen (mAb) 12. In dit rapport laten we zien de procedures die kunnen worden uitgevoerd in compliaNCE met cGMP aan CD19-specifieke CAR + T-cellen die geschikt zijn voor toepassing op de mens te genereren. Dit werd bereikt door de electro-synchrone overdracht van twee DNA plasmiden, een transposon SB (CD19RCD28) en een SB transposase (SB11) gevolgd door retrieval van stabiele integranten door iedereen 7 dagen toevoegingen (stimulatiecyclus) van γ-bestraalde AAPC (kloon # 4) in de aanwezigheid van oplosbaar recombinant humaan IL-2 en IL-21 13. Typisch 4 cycli (28 dagen continu cultuur) worden ondernomen om klinisch-aansprekende nummers van T-cellen die stabiel tot expressie van de CAR te genereren. Deze methodologie vervaardigen klinische kwaliteit CD19 T-cellen kan op T cellen uit perifeer bloed (PB) of navelstrengbloed (UCB). Bovendien kan deze aanpak worden aangewend om T-cellen om verschillende typen tumoren te genereren door het koppelen van de specificiteit van de geïntroduceerde CAR met de expressie van de TAA, erkend door de auto, op de AAPC.

Wij dat elektro-overdracht van DNA plasmiden en vermeerdering van T cellen op γ-bestraalde AAPC kan worden gebruikt om klinisch aantrekkelijke aantallen T cellen uit PB en UCB voor menselijke applicaties. Deze genetisch gemodificeerde T-cellen brengen een ingebracht CAR dat de TAA CD19, onafhankelijk van major histocompatibility complex herkent. De SB-afgeleide DNA plasmiden tot (i) transposon, een 2e generatie CAR (CD19RCD28) die signalen via CD28 en CD3-ε 14 en (ii) transposase, SB11 15, eerder 13 beschreven, 16,17 uitdrukken . De plasmiden die in deze studie werden commercieel geproduceerd door Waisman Clinical BioManufacturing Facility (Madison, WI). De AAPC (kloon # 4), afkomstig van K562 cellen (ouderlijn verkregen van American Type Culture Collection), co-express gewenste T-cel co-stimulerende moleculen (elk molecuul geïntroduceerd op 3 90% op celoppervlak van AAPC)zoals eerder beschreven 12. We tonen aan dat CD19-T-cellen kunnen worden gegenereerd uit mononucleaire cellen (MNC) uit PB of UCB met SB omzetting naar het CAR gevolgd door toevoeging van AAPC numeriek vergroten de T-cellen in een CAR-afhankelijke wijze (fig. 1 introduceren , 4) 13,18. Ten cuvettes (2x10 7 MNC / cuvette) zijn voor elke ontvanger elektroporatie met 15 ug DNA plasmide (CD19RCD28/pSBSO) codeert voor transposon (CAR) en 5 ug DNA plasmide (pCMV-SB11) codeert voor transposase (SB11). Het aantal cuvettes kunnen worden verlaagd als beperkend of MNC teruggebracht voor laboratoriumwerk. De dag van elektroporatie wordt gedefinieerd als &quot;Day 0&quot; van stimulatiecyclus # 1. Als controles voor flowcytometrie en kweekomstandigheden, autologe T cellen mock geëlektroporeerde (zonder DNA plasmide) en numeriek uitgebreid op γ-bestraalde AAPC (kloon # 4) die tevoren geladen met OKT3 te verknopen van T-cellen CD3 ondersteunen proliferatie. We routinely de doeltreffendheid van Electroforetisch en levensvatbaarheid van de T-cellen de dag na elektroporatie (Figuur 2B). De expressie van EGFP van de controle-DNA-plasmide (aangeduid pmaxGFP) en CAR in deze eerste tijdstip weerspiegelt eiwitexpressie van de geïntegreerde en episomaal plasmide. Typisch, de dag na elektroporatie we meten EGFP expressie bij ~ 60% en CAR expressie bij ~ 40% (Figuur 2A) met T cel levensvatbaarheid tussen 40-50%. Recursieve toevoegingen van γ-bestraalde AAPC in aanwezigheid van oplosbare recombinant humaan IL-2 en IL-21 halen T cellen die stabiel tot expressie CAR (CD19RCD28). CD3 neg CD56 + NK cellen uitgeput van de kweek met CD56-specifieke paramagnetische deeltjes als het percentage van deze NK cellen ≥ 10% en vooral als het percentage CAR uitgedrukt op T cellen laag is. Deze uitputting voorkomt snelle woekering van NK cellen die interfereert met het vermogen van de AAPC te houden proliferation van CAR + T-cellen. Soms wordt uitputting van NK cellen uit CAR + T-cellen die gedurende de laatste twee stimuleringscycli, maar dit introduceert een verlies van gewenste cellen gevolg van co-expressie van CD56 op een CAR + T-cellen. De T-cellen werden gekweekt in een functioneel gesloten systeem met Vue Life cultuur zakken voorbij dag 14. Een subset van de genetisch gemodificeerde T-cellen en vermenigvuldigd worden typisch ingevroren op dag 14 of dag 21 (eind stimuleringscycli # 2 en # 3) van co-cultuur op AAPC te dienen als een bron van materiaal gearchiveerd voor toekomstige analyses en om ontdooid als onverwachte problemen vervolgens tijdens het fabricageproces. T-cellen zijn meestal geoogst op of omstreeks dag 28 van kweek (Figuur 3) die routinematig express&gt; 90% CAR en&gt; 80% levensvatbare (figuur 2C, D). We hebben eerder aangetoond dat, na vier weken co-cultuur op AAPC de gemiddelde opvouwen expansie van CD3 + T cellen 19.800 ± 11.313 met CA<html> R + expressie wordt 90% ± 7,5 13. Deze T-cellen zijn gecryopreserveerd en ondergaan in-proces tests afgifte dat informeert over de veiligheid en therapeutisch potentieel van het vervaardigde product. Op de markt tests worden uitgevoerd in overeenstemming met de klinische laboratoria verbetering wijzigingen (CLIA) om een ​​certificaat van analyse te genereren voorafgaand aan de infusie in ontvangers op klinische studies. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig1.jpg" /> Figuur 1. Stappen waarin het proces om electroporate en uit te dragen CAR + T-cellen van PB en UCB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . upload/50070/50070fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50070/50070fig2.jpg &quot;/&gt; Figuur 2. Karakterisering van genetisch gemodificeerde T-cellen uit PB. (A) Expressie van EGFP op dag 0 van eerste stimulatiecyclus de efficiëntie van genoverdracht te beoordelen. Expressie van CD19-specifieke CAR (CD19RCD28) zoals beoordeeld door flowcytometrie op CD3 +, CD8 + en CD4 + T-cellen in (B) ongeveer 24 uur na elektroporatie en (C) 28 dagen na co-cultuur op AAPC. Vergelijkbare uitdrukking van CAR werd waargenomen met UCB-afgeleide T-cellen. (D) Kinetiek van CAR expressie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img alt="Figuur 3" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig3.jpg" /> Figuur 3. Voortplanting van PB-afgeleide CAR+ T cellen. Percentage numerieke uitbreiding van CD3 + en CAR + T cellen uit PB door herhaalde co-cultuur op γ-bestraalde AAPC in aanwezigheid van recombinant humane oplosbare IL-2 en IL-21. Opwaartse pijlen geven de toevoegingen van γ-bestraalde AAPC dat markeren het begin van elke stimulatie cyclus. UCB-afgeleide CAR + T-cellen vertonen vergelijkbare percentages van numerieke expansie. <img alt="Figuur 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig4.jpg" /> Figuur 4. Schema van het productieproces met SB en AAPC systemen genetisch te modificeren en te verspreiden CAR + T cellen uit PB en UCB. CD19-specifieke CAR + T-cellen werden gegenereerd door electro-overdracht van SB-afgeleide supercoiled DNA plasmiden en vervolgens co-cultuur op K562-afgeleide AAPC (kloon # 4) in aanwezigheid of recombinant humaan oplosbare IL-2 en IL-21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <table border="1"><tbody><tr><td width="5"> T celbron </td><td width="9"> Transposon * </td><td width="9"> Transposase </td><td width="26"> T cel infusie </td><td width="1"> IRB # </td><td width="1"> NIH-OBA # </td><td width="1"> IND # </td></tr><tr><td> Autologe (patiënt-afgeleide) ** </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> Na autologe hematopoietische stamceltransplantatie </td><td> 2007-0635 </td><td> 0804-922 </td><td> 14193 </td></tr><tr><td> Allogene (donor-afgeleide) </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> Na allogene hematopoietische stamceltransplantatie </td><td> 2009-0525 </td><td> 0910-1003 </td><td&gt; 14577 </td></tr><tr><td> Allogene (donor-afgeleide) </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> Na allogene transplantatie van navelstrengbloed </td><td> 2010-0835 </td><td> 1001-1022 </td><td> 14739 </td></tr></tbody></table> * Tabel 1. Klinische studies onder auspiciën van de FDA op MDACC aan CD19-specifieke CAR bezielen + T-cellen gepropageerd op AAPC. T-cellen worden weergegeven die specifiek zijn voor CD19 door middel van gedwongen expressie van SB transposon codeert voor een 2 e generatie CAR, aangewezen CD19RCD28, dat de signalen door middel van CD28 en CD3-ε. ** Trial beschreven in referentie 5.

T cellen die een CD19-antigen specifieke chimere receptor (CAR) worden toegediend als onderzoek behandeling van B-cel maligniteiten in de eerste-in-humane gentherapie trials. We beschrijven genetische modificatie van T cellen met behulp van de<em&gt; Sleeping Beauty</em&gt; (SB) systeem CD19-specifieke CAR en selectieve voortplanting te introduceren op designer CD19 + kunstmatige antigeen presenterende cellen.

Klinische toepassing van<em&gt; Sleeping Beauty</em&gt; En Kunstmatige antigeen presenterende cellen genetisch te wijzigen T-cellen uit perifeer en navelstrengbloed

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Dit protocol wijzigt genetisch T-cellen om chimere antigeenreceptoren te introduceren die specifiek zijn voor tumorantigenen, en vermenigvuldigt vervolgens klinisch significante aantallen op ontworpen kunstmatige antigeenpresenterende cellen. Begin met elektro-overdracht van de sleeping beauty. Transponeer en transposeer A DNA-plasmiden in rustige mononucleaire cellen geïsoleerd uit perifeer of navelstrengbloed.Meet vervolgens de transfectie-efficiëntie met behulp van flowcytometrie. Co-cultiveer vervolgens de getransfecteerde T-cellen gedurende zeven dagen op K 5 62 afgeleide kunstmatige antigeenpresenterende cellen met de toevoeging van exogene cytokinen in een vierwekelijkse stimulatie. Cycli van proliferatie gaan door om cryobewaring en vrijlating van de geëlektropeerde en vermenigvuldigde car-positieve T-cellen voor menselijk gebruik te analyseren.Het sleeping beauty transpose on transpose systeem biedt een alternatief voor op virussen gebaseerde genoverdrachtsbenaderingen voor stabiele introductie van een gen in de gewenste cel. Een van de belangrijkste voordelen van het sleeping beauty-systeem is dat genen kunnen worden geïntegreerd tegen een veel lagere kosten in vergelijking met DNA-plasmiden die worden geïntegreerd via onwettige niet-homologe recombinatie. Het voordeel is dus dat het sleeping beauty-systeem kan worden gebruikt om een gen te expresseren tegen lage kosten en hoge efficiëntie.Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze methode aanvankelijk de efficiëntie van elektro T-cellen moeten overwinnen bij de selectieve vermenigvuldiging van car-positieve T-cellen op kunstmatige antigeenpresenterende cellen. Beide stappen zijn uitdagend om te beheersen vanwege de noodzaak om te co-cultiveren. Genetisch gemodificeerde T-cellen op kunstmatige antigeenpresenterende cellen.Deze methode is nuttig op het gebied van adoptieve immunotherapie, met name bij effectieve genrechtenlevering en de productie van klinisch significante aantallen T-cellen. De bredere toepassing strekt zich uit tot therapie van kanker, omdat T-cellen uit het immuunsysteem kunnen worden gemodificeerd om tumorspecifiek te zijn. Het demonstreren van de procedure zullen Margaret Dawson en Matthew Fiola zijn.Technici uit mijn laboratorium Verdun eerst het perifere bloed met een gelijk volume van P-B-S-E-D-T-A en navelstrengbloed met vier volumes van P-B-S-E-D-T-A. Laat langzaam 25 milliliter verdund bloed vallen op 12 milliliter van fial in een 50 milliliter centrifugeerbuis. Centrifugeer de fial-gradient bij 400 Gs gedurende 30 tot 40 minuten zonder pauze. Breng nu de mononucleaire celfractie over naar een verse 50 milliliter centrifugeerbuis met P-B-S-E-D-T-A.Breng het volume op tot 50 milliliter en oogst de cellen door centrifugatie. Was de cellen voorzichtig eenmaal in 50 milliliter compleet kweekmedium en centrifugeer bij 400 Gs gedurende 10 minuten. Verzamel vervolgens de celpellets in CCM en voer een celtelling uit.Gebruik de triam blue uitsluitingsmethode. De mononucleaire cellen kunnen nu worden gebruikt voor elektroporatie of voor toekomstig gebruik worden gecryopreserveerd. Als u gecryopreserveerde MNC gebruikt, ontdooit u snel twee keer 10 tot de achtste cellen voor een volledige elektroporatie, brengt u de cellen voorzichtig over naar een geschikt gedimensioneerde centrifugeerbuis met voorverwarmd.Volledig fenolvrij RPMI-kweekmedium en pellet de cellen door centrifugatie, hersuspendeer de mononucleaire cellen in P-F-R-P-M-I, voer een celtelling uit en breng de cellen over naar een geschikt gedimensioneerde celkweekvat bij een concentratie van 10 van de zes cellen per milliliter. Breng de cellen in evenwicht in een bevochtigde incubator gedurende twee uur. Oogst de MNC door centrifugatie, hersuspendeer ze voorzichtig en combineer de celpellets in P-F-R-P-M-I en tel de cellen. Breng nu twee keer 10 tot de achtste MNC over naar een steriele 50 milliliter centrifugeerbuis en centrifugeer bij 200 Gs gedurende 10 minuten zonder pauzes.Aspirieer het supernatant zodat er geen restmedia meer rond het celpellet achterblijft. Bereid een steriele 12-wellplaat met 10 putjes voor met vier milliliter warm P-F-R-P-M-I en breng de plaat in evenwicht in een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Herstel vervolgens de Lonzo Nucleo effectoroplossing uit de human T-cell kit volgens de instructies van de fabrikant voor elke reactie.Q Vet bereid 100 microliter DNA mastermix voor met gesupplementeerde NU nuclear effectoroplossing. 15 microgram van de transpose on-plasmide en vijf microgram van de transpose-plasmide. Verspreid vervolgens het pellet van T-cellen en hersuspendeer een NU nuclear affection solution DNA mastermix bij een uiteindelijke celconcentratie van twee keer 10 tot de zevende cel per 100 microliter.Breng voorzichtig 100 microliter van de celsuspensie over naar elk van de 10 lonza nucleo affection cuvettes en zorg ervoor dat u bellen vermijdt. Tik nu eenmaal op de qve en elektroporeer met behulp van het programma U 0 1 4 voor niet-gestimulatede T-cellen. Breng de cuvettes en het evenwichts-12-wellplaat over naar de kweekhood met behulp van een amox van fijne punttransferpipet bij 500 microliter van het voorverwarmde kweekmedium uit de overeenkomstige put op elke vete.Breng de geëlektropeerde cellen over naar de plaat en laat de cellen twee uur herstellen in de celkweekincubator. Breng vervolgens de cellen van alle putten over naar een steriele centrifugeerbuis en pellet de cellen na één wasbeurt, verspreid het celpellet voorzichtig en hersuspendeer in CCM om een enkele celsuspensie te bereiken. Na het uitvoeren van een celtelling, pas de celconcentratie aan tot tien tot de zes cellen per milliliter in CCM.Breng vervolgens de celsuspensie over naar een kweekfles en plaats deze 's nachts in de incubator om EGFP-getransfecteerde cellen te genereren. Herhaal het elektroporatieprotocol met vijf keer 10 van de zes cellen per vete met vijf microgram amox controle EGFP-plasmide. Oogst de geëlektropeerde cellen en voer vervolgens een celtelling uit met behulp van de trien blue uitsluitingsmethode.Kleur vervolgens één tot twee keer 10 van de zes cellen met

clinical-application-sleeping-beauty-artificial-antigen-presenting

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een snelle, eenvoudige en kosteneffectieve protocol voor het genereren van donor-afgeleide multivirus-specifieke CTL (rCTL) voor infusie aan allogene hematopoietische stamceltransplantatie (HSCT) ontvangers risico op het ontwikkelen CMV, Adv of EBV infecties. Dit productieproces is GMP-compliant en moet zorgen voor de bredere implementatie van T-cel-immunotherapie voorbij gespecialiseerde centra.

Genereren van Multivirus-specifieke T-cellen te voorkomen / virale infecties te behandelen na allogene hematopoietische stamceltransplantatie

Een nieuwe DC-onafhankelijke methode voor de inductie en de uitbreiding van antigeen-specifieke T-cellen wordt beschreven. HLA A2-Ig op basis van kunstmatige antigeen presenterende cellen (aAPC) zijn geladen met HLA-A2 beperkt peptiden om efficiënt uit te breiden CTL van diverse antigen specificiteit. Deze technologie biedt veel mogelijkheden voor CTL-op basis van adoptieve immunotherapie.

HLA-Ig Based Artificial antigeen presenterende cellen voor efficiënte Ex vivo Uitbreiding van de Mens CTL

Hier beschrijven we de eerste Good Manufacturing Practice (GMP)-compatibele werkwijze voor het produceren van virus-specifieke cytotoxische T lymfocyten (CTL) uit navelstrengbloed een bron voornamelijk naïeve T-cellen.

Uitbreiden cytotoxische T-lymphocyten uit navelstrengbloed dat Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, en Adenovirus

Genereren van T-lymfocyten van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen geeft een alternatieve aanpak van het gebruik van embryonale stamcellen voor T-cel-gebaseerde immunotherapie. De werkwijze blijkt dat door een...

Geregisseerd Differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen naar T lymfocyten

We presenteren hier een methode om functionele antigeen (Ag)-specifieke regulatoire T-cellen (Tregs) te ontwikkelen uit geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) voor immunotherapie van auto-immuun artritis in een muismodel.

Ontwikkeling van stamcel-afgeleide Antigeen-specifieke regulatoire T-cellen tegen auto-immuniteit

Antigeen-specifieke T-cellen zijn moeilijk te karakteriseren of frametechnieken gebruiken in therapieën vanwege hun extreem lage frequentie. Hierin bieden we een protocol voor de ontwikkeling van een magnetische deeltjes die aan antigeen-specifieke T-cellen binden kan te verrijken van deze cellen en vervolgens uit te breiden ze verschillende keer voor zowel de karakterisering en de therapie.

Verrijken en uit te breiden van zeldzame Antigen-specifieke T-cellen met magnetische nanodeeltjes

Dit artikel beschrijft een nieuwe methode voor het genereren van tumor antigeen-specifieke geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige Thymus emigants (iTE) door een driedimensionaal (3D) Thymus cultuur systeem. iET zijn een homogene deelverzameling van T-cellen die nauw verwant zijn aan naïeve T-cellen met de capaciteit voor proliferatie, Geheugenvorming en tumor onderdrukking.

Een driedimensionaal Thymic cultuur systeem voor het genereren van Murine geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige tumor antigen-specifieke Thymic emigranten

Het doel van dit protocol is het isoleren van niet-menselijke primaten CD34+ cellen uit primer beenmerg, gen-wijzigen van deze cellen met lentivirale vectoren, en voor te bereiden een product infusie in de autologe host. Het protocol van de totale lengte is ongeveer 48 uur.

Voorbereiding en genetische modificatie van Nonhuman primaat hematopoietische stamcellen en voorlopercellen

Hier is een protocol voor de effectieve onderdrukking van replicatie van het hepatitis B-virus (HBV) in muizen door gebruik te maken van de adoptieve celoverdracht (ACT) van stamcel afkomstige virale antigeen (AG)-specifieke T-lymfocyten. Deze procedure kan worden aangepast voor mogelijke op ACT gebaseerde immunotherapie van HBV-infectie.

Stamcel afkomstige virale AG-specifieke T-lymfocyten onderdrukken HBV-replicatie bij muizen

Het huidige protocol beschrijft een geoptimaliseerde hematopoietische stam- en voorlopercel (HSPC) kweekprocedure voor de robuuste engraftment van gen-bewerkte cellen in vivo.

CRISPR/Cas9-genbewerking van hematopoietische stam- en voorlopercellen voor gentherapietoepassingen

Dit protocol biedt een gestroomlijnde workflow voor het genereren en testen van menselijke chimere antigeenreceptorregulerende T-cellen (CAR Tregs).

Generatie van menselijke chimere antigeenreceptorregulerende T-cellen

Leer T-cellen genetisch modificeren met het Sleeping Beauty-systeem voor immunotherapie tegen kanker. Deze methode produceert klinisch relevante aantallen CAR-positieve T-cellen voor adoptieve celtherapie.

Klinische toepassing van Sleeping Beauty En Kunstmatige antigeen presenterende cellen genetisch te wijzigen T-cellen uit perifeer en navelstrengbloed (Video) | JoVE Journal

Klinische toepassing van

Meer video's verkennen