Klinische toepassing van

Dit protocol wijzigt genetisch T-cellen om chimere antigeenreceptoren te introduceren die specifiek zijn voor tumorantigenen, en vermenigvuldigt vervolgens klinisch significante aantallen op ontworpen kunstmatige antigeenpresenterende cellen. Begin met elektro-overdracht van de sleeping beauty. Transponeer en transposeer A DNA-plasmiden in rustige mononucleaire cellen geïsoleerd uit perifeer of navelstrengbloed.

Meet vervolgens de transfectie-efficiëntie met behulp van flowcytometrie. Co-cultiveer vervolgens de getransfecteerde T-cellen gedurende zeven dagen op K 5 62 afgeleide kunstmatige antigeenpresenterende cellen met de toevoeging van exogene cytokinen in een vierwekelijkse stimulatie. Cycli van proliferatie gaan door om cryobewaring en vrijlating van de geëlektropeerde en vermenigvuldigde car-positieve T-cellen voor menselijk gebruik te analyseren.

Het sleeping beauty transpose on transpose systeem biedt een alternatief voor op virussen gebaseerde genoverdrachtsbenaderingen voor stabiele introductie van een gen in de gewenste cel. Een van de belangrijkste voordelen van het sleeping beauty-systeem is dat genen kunnen worden geïntegreerd tegen een veel lagere kosten in vergelijking met DNA-plasmiden die worden geïntegreerd via onwettige niet-homologe recombinatie. Het voordeel is dus dat het sleeping beauty-systeem kan worden gebruikt om een gen te expresseren tegen lage kosten en hoge efficiëntie.

Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze methode aanvankelijk de efficiëntie van elektro T-cellen moeten overwinnen bij de selectieve vermenigvuldiging van car-positieve T-cellen op kunstmatige antigeenpresenterende cellen. Beide stappen zijn uitdagend om te beheersen vanwege de noodzaak om te co-cultiveren. Genetisch gemodificeerde T-cellen op kunstmatige antigeenpresenterende cellen.

Deze methode is nuttig op het gebied van adoptieve immunotherapie, met name bij effectieve genrechtenlevering en de productie van klinisch significante aantallen T-cellen. De bredere toepassing strekt zich uit tot therapie van kanker, omdat T-cellen uit het immuunsysteem kunnen worden gemodificeerd om tumorspecifiek te zijn. Het demonstreren van de procedure zullen Margaret Dawson en Matthew Fiola zijn.

Technici uit mijn laboratorium Verdun eerst het perifere bloed met een gelijk volume van P-B-S-E-D-T-A en navelstrengbloed met vier volumes van P-B-S-E-D-T-A. Laat langzaam 25 milliliter verdund bloed vallen op 12 milliliter van fial in een 50 milliliter centrifugeerbuis. Centrifugeer de fial-gradient bij 400 Gs gedurende 30 tot 40 minuten zonder pauze. Breng nu de mononucleaire celfractie over naar een verse 50 milliliter centrifugeerbuis met P-B-S-E-D-T-A.

Breng het volume op tot 50 milliliter en oogst de cellen door centrifugatie. Was de cellen voorzichtig eenmaal in 50 milliliter compleet kweekmedium en centrifugeer bij 400 Gs gedurende 10 minuten. Verzamel vervolgens de celpellets in CCM en voer een celtelling uit.

Gebruik de triam blue uitsluitingsmethode. De mononucleaire cellen kunnen nu worden gebruikt voor elektroporatie of voor toekomstig gebruik worden gecryopreserveerd. Als u gecryopreserveerde MNC gebruikt, ontdooit u snel twee keer 10 tot de achtste cellen voor een volledige elektroporatie, brengt u de cellen voorzichtig over naar een geschikt gedimensioneerde centrifugeerbuis met voorverwarmd.

Volledig fenolvrij RPMI-kweekmedium en pellet de cellen door centrifugatie, hersuspendeer de mononucleaire cellen in P-F-R-P-M-I, voer een celtelling uit en breng de cellen over naar een geschikt gedimensioneerde celkweekvat bij een concentratie van 10 van de zes cellen per milliliter. Breng de cellen in evenwicht in een bevochtigde incubator gedurende twee uur. Oogst de MNC door centrifugatie, hersuspendeer ze voorzichtig en combineer de celpellets in P-F-R-P-M-I en tel de cellen. Breng nu twee keer 10 tot de achtste MNC over naar een steriele 50 milliliter centrifugeerbuis en centrifugeer bij 200 Gs gedurende 10 minuten zonder pauzes.

Aspirieer het supernatant zodat er geen restmedia meer rond het celpellet achterblijft. Bereid een steriele 12-wellplaat met 10 putjes voor met vier milliliter warm P-F-R-P-M-I en breng de plaat in evenwicht in een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Herstel vervolgens de Lonzo Nucleo effectoroplossing uit de human T-cell kit volgens de instructies van de fabrikant voor elke reactie.

Q Vet bereid 100 microliter DNA mastermix voor met gesupplementeerde NU nuclear effectoroplossing. 15 microgram van de transpose on-plasmide en vijf microgram van de transpose-plasmide. Verspreid vervolgens het pellet van T-cellen en hersuspendeer een NU nuclear affection solution DNA mastermix bij een uiteindelijke celconcentratie van twee keer 10 tot de zevende cel per 100 microliter.

Breng voorzichtig 100 microliter van de celsuspensie over naar elk van de 10 lonza nucleo affection cuvettes en zorg ervoor dat u bellen vermijdt. Tik nu eenmaal op de qve en elektroporeer met behulp van het programma U 0 1 4 voor niet-gestimulatede T-cellen. Breng de cuvettes en het evenwichts-12-wellplaat over naar de kweekhood met behulp van een amox van fijne punttransferpipet bij 500 microliter van het voorverwarmde kweekmedium uit de overeenkomstige put op elke vete.

Breng de geëlektropeerde cellen over naar de plaat en laat de cellen twee uur herstellen in de celkweekincubator. Breng vervolgens de cellen van alle putten over naar een steriele centrifugeerbuis en pellet de cellen na één wasbeurt, verspreid het celpellet voorzichtig en hersuspendeer in CCM om een enkele celsuspensie te bereiken. Na het uitvoeren van een celtelling, pas de celconcentratie aan tot tien tot de zes cellen per milliliter in CCM.

Breng vervolgens de celsuspensie over naar een kweekfles en plaats deze 's nachts in de incubator om EGFP-getransfecteerde cellen te genereren. Herhaal het elektroporatieprotocol met vijf keer 10 van de zes cellen per vete met vijf microgram amox controle EGFP-plasmide. Oogst de geëlektropeerde cellen en voer vervolgens een celtelling uit met behulp van de trien blue uitsluitingsmethode.

Kleur vervolgens één tot twee keer 10 van de zes cellen met