Name: Voorbereiding van de Tumor antigenen opgeladen Mature dendritische cellen voor immunotherapie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Leer de bereiding van klinisch geschikte dendritische cellen voor immunotherapie. Deze methode omvat differentiatie van monocyten met GM-CSF en IL-4, gevolgd door rijping en antigeenlading voor patiëntinjectie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Andres Salazar (Oncovir, Inc) danken voor de gave van de Poly-ICLC.

1. Isolatie en cryopreservatie van PBMC 4 <ol><li> Aseptisch spike een van de toegangspoorten in de leukaferese zak met behulp van een plasma transferset. Met behulp van een 60 ml spuit, breng de leukaferese verkregen van patiënten in een steriele 500 ml fles. </li><li> Het volume van de leukaferese zijn oorspronkelijke volume met kamertemperatuur RPMI 2x. Meng goed. </li><li> Meng voorzichtig de fles Ficoll-Paque PLUS. Voeg 12 ml Ficoll-Paque PLUS in steriele 50 ml conische buis. </li><li> Zachtjes laag 30 ml van het verdunde leukaferese product aan elke steriele 50 ml conische buis met Ficoll. Wees voorzichtig dat u de interface tussen de Ficoll en celsuspensie verstoren. </li><li> Herhaal de stappen 1.3 en 1.4 totdat alle leukaferese is gelaagd. </li><li> Centrifugeer de 50 ml conische buizen bij 1000 xg gedurende 20 min bij kamertemperatuur zonder rem. </li><li> Oogsten zorgvuldig de bewolkte laag van PBMC van elke buis en Transfer om nieuwe steriele 50 ml buizen. </li><li> Voeg RPMI aan elke buis tot een eindvolume van 50 ml. Meng voorzichtig door inversie. </li><li> Centrifugeer de cellen bij 500 g gedurende 10 min bij 4 ° C met volledige rem. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistoffen van elke buis. Resuspendeer de celpellet van elke buis en voeg RPMI tot een eindvolume van 50 ml. Meng voorzichtig door inversie. </li><li> Centrifugeer de cellen bij 500 g gedurende 6 minuten bij 4 ° C. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistoffen van elke buis. Resuspendeer en zwembad samen de cel suspensies in een 50 ml conische buis. </li><li> Breng het volume van de samengevoegde PBMC aan met 50 ml RPMI meer. Meng voorzichtig door inversie. </li><li> Centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 6 minuten bij 4 ° C. </li><li> Verwijder het supernatant. Resuspendeer de celpellet in 50 ml RPMI. Meng voorzichtig om uniforme celsuspensie te garanderen. </li><li> Tel het aantal cellen en levensvatbaarheid van de cellen te bepalen. Bereken het totale aantal levensvatbare cellen. </li><li> Centrifugeer de cellen bij 300Xg gedurende 6 min bij 4 ° C. Bereid de bevriezing media. Bevriezing media bestaat uit 10% Dimethylsulfoxide (DMSO; Miltenyi Biotec) in menselijk AB-serum (Valley Biomedical). </li><li> Verwijder het supernatant. Resuspendeer de cellen in een eindconcentratie van 2 x 10 8 cellen / ml in koude vriesmedium. </li><li> Maak porties van 1 ml in 1,8 ml cryovials. </li><li> Breng de cryovials in de gecontroleerde-tarief vriezer en beginnen met het invriezen run, Programma 1. Aan het einde van de run, dragen de bevroren cryovials onmiddellijk in de dampfase van vloeibare stikstof vriezer. </li></ol> 2. Dag 0: Differentiatie van dendritische cellen uit monocyten <ol><li> Voeg 30 ml van RPMI / 1% autoloog plasma naar een steriele 50 ml conische buis. </li><li> Dooi porties van bevroren PBMCs door voorzichtig schudden in het 37 ° C waterbad. Toen helemaal ontdooid, breng de inhoud van de flesjes aan de steriele 50 ml conische buis. Meng goed. </li><li> Centrifugeer de cellen gedurende 6 minbij 500 x g bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer de gepelleteerde cellen in een klein volume van RPMI / 1% autoloog plasma. Voeg dan meer RPMI / 1% autoloog plasma op een eindvolume van 50 ml. Meng goed. </li><li> Centrifugeer de cellen opnieuw gedurende 6 min bij 500 x g bij kamertemperatuur. Zuig het supernatant en resuspendeer de pellet in 50 ml RPMI / 1% autoloog plasma. Meng goed. </li><li> Tel het aantal cellen en levensvatbaarheid van de cellen te bepalen. Bereken het totale aantal levensvatbare cellen. </li><li> Plaat 1.40 x 10 8 cellen in 40 ml RPMI / 1% autoloog plasma op 225 cm 2 EasyFlask. Herhaal dit totdat alle cellen zijn bedekt. </li><li> Incubeer de EasyFlasks plat op zijn zijkant 1-2 uur bij 37 ° C in de weefselkweek incubator met 5% CO2 om de monocyten te houden aan de kolf. </li><li> Wanneer de incubatie is voltooid, verwijdert de EasyFlask uit de incubator en tweemaal spoelen aan de niet-hechtende cellen te verwijderen using 30 ml voorverwarmde RPMI. </li><li> Na de tweede wasbeurt, voeg 40 ml van RPMI / 1% autoloog plasma met 400-1,000 IU / ml IL-4 en 100-1000 IU / ml GM-CSF 5-8. Voor dit protocol, gebruiken we 400 IU / ml IL-4 en 100 IU / ml GM-CSF. </li><li> Incubeer de EasyFlasks gedurende 2 dagen bij 37 ° C in de weefselkweek incubator met 5% CO2. </li></ol> 3. Dag 2: Het voeden van dendritische cellen met IL-4 en GM-CSF <ol><li> Voeg 4 ml RPMI / 1% autoloog plasma 400-1,000 IU / ml IL-4 en 100-1000 IU / ml GM-CSF aan elke EasyFlask. Meng door schudden en schommelen op zijn kant. </li><li> Incubeer de EasyFlasks gedurende 3 dagen (tot dag 5) bij 37 ° C in de weefselkweek incubator met 5% CO2. </li></ol> 4. Dag 5: Het oogsten van onrijpe dendritische cellen <ol><li> Oogst de kweken door krachtig wervelen kolven en door pipetteren tot niet-hechtend en losjes hechtende cellen te resuspenderen. Breng degeoogste cellen om nieuwe 50 ml conische buizen. </li><li> Centrifugeer de buizen bij 500 xg gedurende 6 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 50 ml RPMI / 1% autoloog plasma. Meng goed. </li><li> Tel het aantal cellen en levensvatbaarheid van de cellen te bepalen. Bereken het totale aantal levensvatbare cellen. </li><li> Centrifugeer de buizen bij 500 xg gedurende 6 minuten bij kamertemperatuur. Plaat 1-2 x 10 6 cellen per putje in 3 ml RPMI / 1% autoloog plasma met 400 IU / ml IL-4 en 100 IU / ml GM-CSF in 6-well weefselkweekplaten. </li><li> Incubeer de platen bij 37 ° C in de weefselkweek incubator met 5% CO 2 overnacht. </li></ol> 5. Dag 6: Rijping en Antigen Laden van dendritische cellen <ol><li> Voeg 10 ug / ml KLH tot 1/3 van de putjes in de 6 putjes. Swirl de platen te mixen. KLH wordt alleen toegevoegd aan 1/3 van de putjes omdat KLH wordt enkel gebruikt als eerste DC vaccin. Latere DC vaccins conTain alleen de tumor antigen peptiden. </li><li> DCs kunnen worden gestimuleerd om te rijpen met verschillende stimuli. De meest voorkomende rijping stimuli die in klinische studies is een cocktail van cytokinen (IL-1 β, TNFa en IL-6) en prostaglandine E2 (PGE2) 9,10. Meer recent, hebben het gebruik van Toll-like receptor (TLR)-agonisten populariteit 11,12 gewonnen. In dit protocol, voeg 2 mg / ml Polyinosinic-Polycytidylic Acid-poly-L-lysine Carboxymethylcellulose (Poly-ICLC) aan de putjes en meng goed. Poly-ICLC is van klinische kwaliteit formulering van Poly-IC dat wordt gestabiliseerd met poly-L-*-lysine en carboxymethylcellulose (geproduceerd door Oncovir, Inc). </li><li> Voeg 100 ug / ml lang peptide antigenen (NY-ESO-1 en / of Melan-A/MART-1) aan hun bestemde putjes, elk putje krijgen slechts een peptide om cross-concurrentie 13 voorkomen. </li><li> Incubeer de platen bij 37 ° C in de weefselkweek incubator met 5% CO &lt;sub&gt; 2 O / N. </li></ol> 6. Dag 7: cryopreservatie van dendritische cellen <ol><li> Bereid DC Freezing Solution met behulp van autoloog plasma en 10% DMSO. Centrifugeer de DC Freezing Solution bij 2000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C aan een deeltjesvormig materiaal te verwijderen. Overdragen supernatant naar een nieuwe gelabelde 15 ml conische buis. Bewaar bij 4 ° C tot gebruik. </li><li> Wanneer de nacht incubatie is voltooid, oogst en het zwembad alle putjes met DC&#39;s gepulst met de peptiden in 50 ml conische buizen. </li><li> Centrifugeer de buizen bij 500 x g gedurende 6 minuten. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de celpellet in 5 ml RPMI / 1% autoloog plasma. Breng het totale volume tot met RPMI / 1% autoloog plasma 50 ml. Meng goed. </li><li> Tel het aantal cellen en levensvatbaarheid van de cellen te bepalen. Bereken totaal aantal levensvatbare cellen. </li><li> Centrifugeer de buizen bij 500 xg gedurende 6 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de bovenstaande vloeistoffen en resuspendeer elke pellet in 5 ml sterile 0,9% NaCl, USP en transfer naar nieuwe 15 ml conische buizen. Breng elke celsuspensie tot 14 ml met meer steriele 0,9% NaCl, USP. Cap en meng door omkeren. </li><li> Herhaal de vorige stap tweemaal. Na de laatste centrifugatie, de supernatanten te verwijderen, zo dicht mogelijk bij de celpellets zonder de pellets te verstoren. </li><li> Resuspendeer de celpellets in DC Freezing Solution bij 4-20 x 10 6 cellen / ml en 1 ml aliquot elk 1,8 ml cryobuis flacon. </li><li> Gebruik de gecontroleerde-tarief vriezer, Programma 1, te bevriezen onderaan de fracties van DC vaccins en breng onmiddellijk in de dampfase van een vloeibare stikstof vriezer voor opslag op lange termijn. </li></ol> 7. Lot release Testen <ol><li> Elke batch DC vaccin worden getest en voldoen aan specifieke lot-criteria (Tabel 1) en voordat het voor injectie in patiënten in de studie, typisch 5 tot 6 weken na vaccinpreparaat. </li><li> Levensvatbaarheid:Evalueer levensvatbaarheid van de DC-vaccin met behulp van een geautomatiseerde cel teller. De minimaal aanvaardbare levensvatbaarheid specificatie is&gt; 70%. </li><li> Identiteit: Evalueer de identiteit van het rijpe DCs (CD11c + CD14-CD83 +) door flowcytometrie. Het percentage CD11c + cellen moet&gt; 50%. Het percentage CD11c + en CD14 + cellen moet &lt;30% en het percentage van CD 11 c +, CD14-en CD83 + cellen moet&gt; 50%. </li><li> Steriliteit: Test het DC vaccin voor de aanwezigheid van anaërobe en aërobe bacteriën en schimmels door directe cultuur en Gramkleuringen. Evalueer de aanwezigheid van mycoplasma met een rechtstreekse kweeksysteem en DNA fluorochroom kleuring Assay met indicator cellijn. Daarvoor moet de minimale specificatie set is dat geen groei waargenomen uit alle culturen. </li><li> Endotoxine: Evalueer het endotoxine inhoud met behulp van de Kinetic-QCL kinetische chromogene LAL-assay en het moet &lt;50 EU / ml zijn de minimumeisen voldoen. </li><li&gt; Functie: Evalueer DC functie in een gemengde lymfocyt reactie door incubatie met allogene T-cellen. De aanwezigheid van proliferatie in vergelijking met ongestimuleerde DC gerapporteerd (figuur 3). </li></ol>

<ol><li>Lesterhuis, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+vaccines+in+melanoma%3A+from+promise+to+proof%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Oncol.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell vaccines in melanoma: from promise to proof.</a> Crit. Rev. Oncol. Hematol. 66, 118-134 (2008).</li>
<li>Sabado, R. L., Bhardwaj, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+dendritic+cell+immunotherapy+towards+successful+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment.</a> Immunotherapy. 2, 37-56 (2010).</li>
<li>Schumacher, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keyhole+limpet+hemocyanin+%28KLH%29+conjugate+vaccines+as+novel+therapeutic+tools+in+malignant+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cancer.+Res.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Keyhole limpet hemocyanin (KLH) conjugate vaccines as novel therapeutic tools in malignant disorders.</a> J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 127, Suppl 2. 1-2 (2001).</li>
<li>Jaatinen, T., Laine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mononuclear+cells+from+human+cord+blood+by+Ficoll-Paque+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient.</a> Curr. Protoc. Stem Cell Biol. Chapter 2, Unit 2A 1(2007).</li>
<li>Eichler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicenter+study+on+in+vitro+characterization+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Multicenter study on in vitro characterization of dendritic cells.</a> Cytotherapy. 10, 21-29 (2008).</li>
<li>Feuerstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+production+of+cryopreserved+aliquots+of+antigen-preloaded%2C+mature+dendritic+cells+ready+for+clinical+use%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for the production of cryopreserved aliquots of antigen-preloaded, mature dendritic cells ready for clinical use.</a> J. Immunol. Methods. 245, 15-29 (2000).</li>
<li>O'Neill, D., Bhardwaj, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+autologous+peptide-+and+protein-pulsed+dendritic+cells+for+patient-specific+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of autologous peptide- and protein-pulsed dendritic cells for patient-specific immunotherapy.</a> Methods Mol. Med. 109, 97-112 (2005).</li>
<li>de Vries, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypical+and+functional+characterization+of+clinical+grade+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Phenotypical and functional characterization of clinical grade dendritic cells.</a> J. Immunother. 25, 429-438 (2002).</li>
<li>Jonuleit, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-inflammatory+cytokines+and+prostaglandins+induce+maturation+of+potent+immunostimulatory+dendritic+cells+under+fetal+calf+serum-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions.</a> Eur. J. Immunol. 27, 3135-3142 (1997).</li>
<li>Lee, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinical+grade+cocktail+of+cytokines+and+PGE2+results+in+uniform+maturation+of+human+monocyte-derived+dendritic+cells%3A+implications+for+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">A clinical grade cocktail of cytokines and PGE2 results in uniform maturation of human monocyte-derived dendritic cells: implications for immunotherapy.</a> Vaccine. 20, Suppl 4. A8-A22 (2002).</li>
<li>Bhardwaj, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+the+immune+system+to+treat+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Harnessing the immune system to treat cancer.</a> J. Clin. Invest. 117, 1130-1136 (2007).</li>
<li>Gnjatic, S., Sawhney, N. B., Bhardwaj, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+agonists%3A+are+they+good+adjuvants%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+J%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor agonists: are they good adjuvants?</a> Cancer J. 16, 382-391 (2010).</li>
<li>Kedl, R. M., Kappler, J. W., Marrack, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+dominance%2C+competition+and+T+cell+affinity+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Epitope dominance, competition and T cell affinity maturation.</a> Curr. Opin. Immunol. 15, 120-127 (2003).</li>
<li>Bogunovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR4+engagement+during+TLR3-induced+proinflammatory+signaling+in+dendritic+cells+promotes+IL-10-mediated+suppression+of+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">TLR4 engagement during TLR3-induced proinflammatory signaling in dendritic cells promotes IL-10-mediated suppression of antitumor immunity.</a> Cancer Research. 71, 5467-5476 (2011).</li>
<li>Verdijk, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyriboinosinic+polyribocytidylic+acid+%28poly%28I%3AC%29%29+induces+stable+maturation+of+functionally+active+human+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Polyriboinosinic polyribocytidylic acid (poly(I:C)) induces stable maturation of functionally active human dendritic cells.</a> J. Immunol. 163, 57-61 (1999).</li>
<li>Rouas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28I%3AC%29+used+for+human+dendritic+cell+maturation+preserves+their+ability+to+secondarily+secrete+bioactive+IL-12%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Poly(I:C) used for human dendritic cell maturation preserves their ability to secondarily secrete bioactive IL-12.</a> Int. Immunol. 16, 767-773 (2004).</li>
<li>Jongmans, W., Tiemessen, D. M., van Vlodrop, I. J., Mulders, P. F., Oosterwijk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th1-polarizing+capacity+of+clinical-grade+dendritic+cells+is+triggered+by+Ribomunyl+but+is+compromised+by+PGE2%3A+the+importance+of+maturation+cocktails%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Th1-polarizing capacity of clinical-grade dendritic cells is triggered by Ribomunyl but is compromised by PGE2: the importance of maturation cocktails.</a> J. Immunother. 28, 480-487 (2005).</li>
<li>Krause, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E2+is+a+key+factor+for+monocyte-derived+dendritic+cell+maturation%3A+enhanced+T+cell+stimulatory+capacity+despite+IDO%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E2 is a key factor for monocyte-derived dendritic cell maturation: enhanced T cell stimulatory capacity despite IDO.</a> J. Leukoc. Biol. 82, 1106-1114 (2007).</li>
<li>Morelli, A. E., Thomson, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+under+the+spell+of+prostaglandins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells under the spell of prostaglandins.</a> Trends Immunol. 24, 108-111 (2003).</li>
<li>Adams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+%28DC%29+based+therapy+for+cervical+cancer%3A+use+of+DC+pulsed+with+tumour+lysate+and+matured+with+a+novel+synthetic+clinically+non-toxic+double+stranded+RNA+analogue+poly+%5BI%5D%3Apoly+%5BC%2812%29U%5D+%28Ampligen+R%29%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell (DC) based therapy for cervical cancer: use of DC pulsed with tumour lysate and matured with a novel synthetic clinically non-toxic double stranded RNA analogue poly [I]:poly [C(12)U] (Ampligen R).</a> Vaccine. 21 (12), 787-790 (2003).</li>
<li>Colombo, M. P., Trinchieri, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-12+in+anti-tumor+immunity+and+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">Interleukin-12 in anti-tumor immunity and immunotherapy.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 13, 155-168 (2002).</li>
<li>Mayordomo, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+dendritic+cells+pulsed+with+synthetic+tumour+peptides+elicit+protective+and+therapeutic+antitumour+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity.</a> Nat Med. 1, 1297-1302 (1995).</li>
<li>Dhodapkar, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+broad+T-cell+immunity+in+humans+after+a+single+injection+of+mature+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of broad T-cell immunity in humans after a single injection of mature dendritic cells.</a> J. Clin. Invest. 104, 173-180 (1999).</li>
<li>Schuler-Thurner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+induction+of+tumor-specific+type+1+T+helper+cells+in+metastatic+melanoma+patients+by+vaccination+with+mature%2C+cryopreserved%2C+peptide-loaded+monocyte-derived+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Rapid induction of tumor-specific type 1 T helper cells in metastatic melanoma patients by vaccination with mature, cryopreserved, peptide-loaded monocyte-derived dendritic cells.</a> J. Exp. Med. 195, 1279-1288 (2002).</li>
</ol>

De auteurs hebben financiële steun ontvangen van de volgende: NIH (AI061684, AI071078, AI044628 en K08 AI084578 (Miller)), de Bill en Melinda Gates Foundation, Doris Duke Charitable Foundation, Cancer Research Institute, Alliantie voor Lupus Research, en de Emerald stichting. Nina Bhardwaj is een coinventor op octrooien met betrekking tot de voorbereiding en het gebruik van dendritische cellen om de immuniteit te manipuleren. De auteurs hebben geen andere relevante voorkeuren of financiële betrokkenheid bij een organisatie of entiteit met een financieel belang in of financiële strijd zijn met de leerstof of materialen besproken in het manuscript, afgezien van die welke beschreven.

Fase I en II klinische proeven van monocyt-afgeleide DCs gebleken dat zij immuunresponsen induceren bij patiënten echter klinisch succes was beperkt 1. Dit kan deels te wijten aan het gebrek aan consensus over hoe de optimale DC&#39;s voor tumor immunotherapeutische gebruik genereren. Hoewel er tal van manieren van klinische kwaliteit DCs genereren deze werkwijzen verschillen wat betreft het gebruik van cytokines die de monocyten, stimuli gebruikt om rijping te induceren en werkwijzen antigen loading differen...

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640 medium met L-glutamine</td><td>BioWhittaker</td><td>12-702F</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES gebufferde zoutoplossing</td><td>BioWhittaker</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>BioWhittaker</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Humane albumine, 25% oplossing USP</td><td>Aventis Behring</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Hypaque PREMIUM</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-03</td><td></td></tr><tr><td>Human AB serum</td><td>Valley Biomedical</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>Steriele zoutoplossing USP</td><td>Hospira</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CryoMACS DMSO </td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-303</td><td></td></tr><tr><td>Leukine GM-CSF, 0,5 mg/ml</td><td>Berlex</td><td>A02266</td><td></td></tr><tr><td>MACS GMP IL-4</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-101</td><td></td></tr><tr><td>Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/ml</td><td>Oncovir</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>VACMUNE KLH</td><td>Biosyn</td><td></td><td></td></tr><tr><td>225 vierkante cm EasyFlasks</td><td>Nalgene Nunc</td><td>159934</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 6-well weefselkweekplaten</td><td>Becton Dickinson</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>1,8 ml CryoTube flacons</td><td>Nalgene Nunc</td><td>377267</td><td></td></tr><tr><td>Controlled Rate Freezer</td><td>Thermo</td><td>CryoMed</td><td></td></tr></tbody></table>

voorbereiding van de tumor antigenen opgeladen mature dendritische cellen voor immunotherapie

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

Hoewel uit klinische studies hebben aangetoond dat antigeen-beladen DC vaccins veilig en veelbelovende therapie voor tumoren 1 zijn, blijft hun klinische werkzaamheid vast te stellen. De hieronder beschreven methode, opgesteld in overeenstemming met de Good Manufacturing Process (GMP) richtlijnen, is een optimalisatie van de meest voorkomende ex vivo bereidingswijze voor het genereren van grote aantallen DCs voor klinische studies 2. Onze werkwijze gebruikt de synthetische TLR 3 agonist Polyinosinic-Polycytidylic zuur poly-L-lysine Carboxymethylcellulose (Poly-ICLC) bij de DC stimuleren. Onze eerdere studie aangetoond dat Poly-ICLC is de meest krachtige individuele rijping stimulans voor humane DCs zoals beoordeeld door een opregulatie van CD83 en CD86, inductie van interleukine-12 (IL-12), tumornecrosefactor (TNF), interferon gamma-geïnduceerde proteïne 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1) en type I interferonen (IFN) en minimale interleukine 10 (IL-10) productie. </p&gt; DCs gedifferentieerd uit ingevroren perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC&#39;s) verkregen door leukaferese. PBMC&#39;s worden geïsoleerd door Ficoll gradiëntcentrifugatie en ingevroren in porties. Op dag 1 worden PBMC&#39;s ontdooid en uitgeplaat op weefselkweek kolven te selecteren op monocyten die na 1-2 uur incubatie bij 37 ° C in de weefselkweek incubator zich aan het plastic oppervlak. Na incubatie worden de lymfocyten afgewassen en hechtende monocyten gekweekt gedurende 5 dagen in de aanwezigheid van interleukine-4 (IL-4) en granulocyt macrofaag kolonie-stimulerende factor (GM-CSF) te differentiëren tot rijpe DCs. Op dag 6 worden onrijpe DC gepulst met keyhole limpet hemocyanine (KLH) eiwit dat dient als een controle voor de kwaliteit van het vaccin en kan de immunogeniciteit van het vaccin te verhogen 3. De DCs worden gestimuleerd om te rijpen, geladen met peptide-antigenen, en overnacht geïncubeerd. Op dag 7 werden de cellen gewassen en bevroren in hoeveelheden van 1 ml met4-20 x 10 6 cellen met behulp van een gecontroleerde-tarief vriezer. Veel vrijgave testen voor de partijen van DC&#39;s wordt uitgevoerd en moeten voldoen aan de minimale specificaties voordat ze geïnjecteerd in patiënten.

Tussen 10 - 20% van het starten PBMCs differentiëren in dendritische eind van de kweekperiode. Mature DCs zijn CD11c +, CD14-, CD83 +, CD40 +, en CCR7 + (figuur 1). Ze drukken hoge niveaus van MHC klasse I en II moleculen en co-stimulerende moleculen CD80 en CD86. Poly-ICLC induceerde ook lagere PDL-1 in vergelijking tot andere TLR-agonisten 14. Bovendien, deze Poly-IC-gerijpte DC scheiden grote hoeveelheden IL-12 (figuur 2 en 15,16) en induceren de proliferatie va...

De meest gebruikte methode voor het genereren van grote aantallen autologe dendritische cellen (DCs) voor gebruik bij tumor immunotherapie beschreven. De methode maakt gebruik van IL-4 en GM-CSF om DCs te onderscheiden van monocyten. De onrijpe DCs worden gestimuleerd om te rijpen en daarna beladen met antigenen voordat ze geïnjecteerd terug in de patiënt.

Voorbereiding van de Tumor antigenen opgeladen Mature dendritische cellen voor immunotherapie

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

Het algemene doel van deze procedure is het demonstreren van de bereiding van dendritische cellen van klinische graad voor immunotherapie. Dit wordt bereikt door eerst perifere mononucleaire bloedcellen te vriezen die zijn geïsoleerd via leukaferese. In de tweede stap worden de ingevroren aliquoten PBMC ontdooid en worden de monocyten gedurende vijf dagen gedifferentieerd tot dendritische cellen in aanwezigheid van G-M-CSF en IL-4.Vervolgens worden de dendritische cellen geoogst, gepulst met peptiden en gedurende de nacht gerijpt met de TLR 3-agonist poly ICLC. In de laatste stap worden de rijpe dendritische cellen geoogst en in aliquots ingevroren. Deze ingevroren aliquots van rijpe dendritische cellen kunnen worden ontdooid, in spuiten worden overgebracht en als onderdeel van hun immunotherapie opnieuw bij de patiënten worden geïnjecteerd.De procedure zal worden gedemonstreerd door Sedia en Farra Hassan, beiden onderzoekstechnici in mijn laboratorium. Begin met het aseptisch doorprikken van een van de toegangspoorten in de leukaferesezak met behulp van een plasmaset. Gebruik vervolgens een spuit van 60 milliliter om de leukaferese over te brengen naar een steriele fles van 500 milliliter. Pas daarna het volume van de leukaferese aan naar twee keer het oorspronkelijke volume met behulp van RPMI op kamertemperatuur en meng dit grondig. Na het voorzichtig mengen van een fles FiC-pack plus, voegt u 12 milliliter van de oplossing toe aan steriele conische buizen van 50 milliliter, en brengt u vervolgens voorzichtig 30 milliliter van het verdunde leukafereseproduct in laagjes aan in elke FiC-buis.Zorg ervoor dat de interface tussen de Ficoll-laag en de celsuspensie niet wordt verstoord. Centrifugeer de buizen 20 minuten lang bij 1000 GS en kamertemperatuur zonder remming. Oog vervolgens voorzichtig de troebele laag PBMC uit elke buis en breng deze over naar nieuwe steriele buizen van 50 milliliter.Voeg vervolgens RPMI toe aan elke buis tot een eindvolume van 50 milliliters en meng de cel-suspensies daarna voorzichtig door omkering. Nadat de cellen 10 minuten zijn gecentrifugeerd bij 500 Gs en vier graden Celsius, worden de supernatanten uit elke buis verwijderd en worden de celpellets uit elke buis opnieuw gesuspendeerd in RPMI tot een eindvolume van 50 milliliters. Na het voorzichtig mengen van de buizen door omkering wordt het aantal en de levensvatbaarheid van de cellen bepaald.Centrifugeer vervolgens de cellen en resuspendeer het pellet in vers bereide vriesmedium tot een uiteindelijke concentratie van 2 × 10⁸ cellen per milliliter. Breng één milliliter van de celoplossing over in 1,8 milliliter cryovials. Plaats de cryovials daarna in een controlled rate freezer en start het vriesproces. Breng de bevroren cryovials aan het einde van het proces onmiddellijk over naar de dampfase van een vloeibare stikstofvriezer.Ontdooi de volgende dag de aliquots van bevroren p BMCs in een waterbad van 37 °C onder zachte agitatie. Zodra ze volledig zijn ontdooid, brengt u de inhoud van de vials over in steriele conische buizen van 50 mL die 30 mL RPMI en autoloog plasma bevatten. Centrifugeer de cellen voorzichtig en resuspendeer de celpellet in een klein volume RPMI plus autoloog plasma.Voeg vervolgens meer RPMI plus autoloog plasma toe tot een eindvolume van 50 milliliters. Nadat de suspensies grondig zijn gemengd, worden 1,4 x 10⁸ cellen in 40 milliliters RPMI plus autoloog plasma op een Easy flask van 225 centimeter² geplaatst. Incubeer de Easy flask plat op zijn zij gedurende één tot twee uur bij 37 °C in de weefselkweekincubator met 5% koolstofdioxide om de monocyten de kans te geven aan de fles te hechten. Was de Easy flask na voltooiing van de incubatie tweemaal met 30 milliliters voorverwarmd RPMI om de niet-adherente cellen te verwijderen.Voeg na de tweede wasbeurt 40 milliliter RPMI plus autoloog plasma met IL 4 en G-M-C-S-F toe aan de cellen en incubeer vervolgens de EASI-fles gedurende twee dagen bij 37 °C en 5% CO₂. Draai de flessen vijf dagen later krachtig rond en pipetteer herhaaldelijk op en neer om de cellen te resuspenderen. Draag de niet-adherente en losjes adherente geoogste cellen over naar nieuwe conische buizen van 50 milliliter.Na het centrifugeren suspenderen we de celpellets in 50 milliliters RPMI plus autoloog plasma. Na het mengen en wassen van de celsuspensies plating we opnieuw 1 tot 2 × 10⁶ cellen per well in 3 milliliters RPMI plus autoloog plasma met IL-4 en G-M-CSF in 6-well tissue culture platen. Incubeer de platen vervolgens gedurende de nacht bij 37 °C in de tissue culture incubator met 5% CO2. Voeg de volgende dag 10 µg/mL KLH toe aan één derde van de wells in de 6-well culture platen en meng de platen door te wervelen.Voeg vervolgens twee µg/mL poly ICLC toe aan de wells en meng dit goed. Voeg daarna 100 µg/mL lange peptideantigenen toe aan de daarvoor bestemde wells, waarbij elke well slechts één peptide ontvangt om kruiscompetitie te voorkomen. Incubeer de platen vervolgens gedurende de nacht bij 37 °C in een weefselkweekincubator met 5% CO2. Oogst en pool op dag zeven alle wells die dendritische cellen bevatten.Pulse de peptiden op dag zes in nieuwe conische buizen van 50 milliliter. Na het centrifugeren van de cellen worden de geaspireerde celpellets geresuspendeerd in vijf milliliter RPMI plus autoloog plasma, waarna het totale volume wordt aangevuld tot 50 milliliter met RPMI plus autoloog plasma en de celsuspensies grondig worden gemengd. Na het berekenen van het totaal aantal levensvatbare cellen worden de buizen gecentrifugeerd, wordt elke pellet geresuspendeerd in vijf milliliter steriel natriumchloride en vervolgens wordt elke celsuspensie nog twee keer gewassen in 14 milliliter steriel natriumchloride.Meng de buisjes na de tweede wasbeurt. Resuspendeer de celpellets in vriesoplossing voor dendritische cellen bij een concentratie van 4 tot 20 × 10⁶ cellen per milliliter en verdeel telkens één milliliter van elke celsuspensie over 1,8 milliliter cryobuisjes. Vries vervolgens de aliquoten van de dendritische celvaccins in met behulp van een gecontroleerde vriesapparaat en breng de aliquoten onmiddellijk over naar de dampfase van een vloeibare stikstofvriezer voor langdurige bewaring.Tussen de 10 en 20% van de startende p BMCs differentiëren aan het einde van de cultuurperiode tot dendritische cellen. De rijping van de dendritische cellen als reactie op poly ICLC, weergegeven door de dikke lijnen, werd geëvalueerd op basis van de expressie van CD 83, CD 40 en CCR seven, en vergeleken met ongestimuleerde dendritische cellen, weergegeven door de grijstinten; zoals in deze staafdiagrammen wordt aangetoond, scheiden de poly IIC-gerijpte dcs in dit experiment, gedifferentieerd van drie gezonde donoren, grote hoeveelheden IL six, IL eight, IL 12 en TNF alpha uit. Deze poly ICLC-gerijpte cellen induceren daarnaast allogene T-celproliferatie, zoals blijkt uit de CFSE-expressie, evenals de productie van interferon gamma na hun ontwikkeling.Deze techniek baande de weg voor onderzoekers in het veld van de immunologie om het gebruik van dendritische cellen voor immunotherapie bij kanker en infectieziekten te onderzoeken.

preparation-tumor-antigen-loaded-mature-dendritic-cells-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Deze video toont de procedure voor de differentiatie van myeloïde dendritische cellen van de muis beenmerg. Isolatie van de muis scheenbeen en dijbeen, en verwerking van het beenmerg worden aangetoond. Foto's tonen celmorfologie voor en na de differentiatie, en figuren afbeelden cel fenotype en IL-12 productie na rijping met behulp van CpG worden weergegeven.

Cultuur van myeloïde dendritische cellen uit beenmerg precursors

Antigeen presentatie in secundaire lymfoïde organen door de dendritische cellen is cruciaal voor de opening van het T-cel gemedieerde adaptieve immuunrespons. Hier laten we zien de cultuur van beenmerg afgeleide dendritische cellen van muizen, activering, en de etikettering voor 2-photon imaging.

Generatie van beenmerg afgeleide Murine dendritische cellen voor gebruik in twee-foton Imaging

Geëvalueerd in syngeneïsche immunocompetente gastheren, toonde het op kankerstamcel (CSC) gebaseerde dendritische cel (DC) vaccin een significant hogere antitumorimmuniteit aan dan traditionele DC-vaccins gepulseerd met heterogene bulktumorcellen.

Generatie van een nieuw dendritisch celvaccin met melanoom en plaveiselkankerstamcellen

Immature dendritische cellen kunnen selectief worden gedifferentieerd in tolerogeen of rijpe dendritische cellen om het evenwicht tussen immuniteit en tolerantie te reguleren. Dit werk presenteert een manier om vanuit onrijpe, uit monocyten afgeleide dendritische cellen (moDC's) in vitro tolerogeen en rijpe moDC's te genereren die verschillen in metabolische fenotypen.

Generatie van onrijpe, Ouder en tolerogene dendritische cellen met verschillende Metabolic Phenotypes

Monocyt-afgeleide DC (MoDC) kleine hoeveelheden gevaar-geassocieerde moleculen kunnen voelen en zijn daarom gemakkelijk primer. Wij bieden een gedetailleerd protocol voor de isolatie van de MoDC uit bloed, tumoren en hun activering met immuuncomplexen terwijl het benadrukken van belangrijke voorzorgsmaatregelen die moeten worden overwogen om te voorkomen dat hun voortijdige activering.

Protocol van de isolatie van muis monocyt-afgeleide dendritische cellen en hun latere In Vitro activatie met Tumor immuuncomplexen

Hier presenteren we een protocol te ontwikkelen en karakteriseren van tolerogenic dendritische cellen (TolDCs) en evalueren van hun immunotherapeutische nut.

Ontwikkeling en functionele karakterisering van lymfkliertest Tolerogenic dendritische cellen

De transimmunisatie (TI) apparaat of plaat en aanverwante protocollen zijn ontwikkeld om de belangrijkste kenmerken van extracorporele fotochemo therapie (ECP) te repliceren, in een experimentele setting, waardoor voor de productie van fysiologisch geactiveerd, tunable dendritische cellen (DCs) voor kanker immunotherapie.

Nieuw protocol voor het genereren van fysiologische immunogeen dendritische cellen

Hier presenteren we een economische en efficiënte methode om zeer zuivere beenmerg-afgeleide dendritische cellen van muizen te isoleren en te genereren na 7 dagen cultuur met 10 ng / ml GM-CSF / IL-4.

Economisch en efficiënt protocol voor het isoleren en kweken van beenmerg-afgeleide dendritische cellen van muizen

Het protocol presenteert een kankerimmunotherapiemodel met behulp van celgebaseerde tumorvaccinatie met Flt3L-tot expressie brengend B16-F10 melanoom. Dit protocol demonstreert de procedures, waaronder de voorbereiding van gekweekte tumorcellen, tumorimplantatie, celbestraling, meting van tumorgroei, isolatie van intratumorale immuuncellen en flowcytometrie-analyse.

Experimenteel melanoom immunotherapiemodel met behulp van tumorvaccinatie met een hematopoëtisch cytokine

Er wordt een uniek, uitgebreid protocol gepresenteerd voor het genereren van gedesialyleerde humane monocyt-afgeleide dendritische cellen (mo-DC's) uit geïsoleerde perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) met behulp van een sialidasebehandeling. Verder worden methoden beschreven om de fenotypische en functionele karakterisering van mo-DC's te beoordelen en te evalueren hoe behandeling met sialidase het rijpingsniveau van mo-DC's verbetert.

Generatie van monocyt-afgeleide dendritische cellen met verschillende gesialyleerde fenotypes

Dit protocol beschrijft de in vivo herprogrammering van muizenkankercellen tot type 1 dendritische-achtige cellen binnen de tumormicro-omgeving door middel van geforceerde expressie van de transcriptiefactoren PU.1, IRF8 en BATF3.

Kanteerbare in vivo herprogrammering van tumorcellen tot type 1 conventionele dendritische celachtige cellen

Leer de bereiding van klinisch geschikte dendritische cellen voor immunotherapie. Deze methode omvat differentiatie van monocyten met GM-CSF en IL-4, gevolgd door rijping en antigeenlading voor patiëntinjectie.

Voorbereiding van de Tumor antigenen opgeladen Mature dendritische cellen voor immunotherapie

Meer video's verkennen