Experimentele Human Pneumokokken vervoer

Het doel van deze procedure is om experimentele humane pneumokokkendragerschap vast te stellen. Dit wordt bereikt door eerst het aantal bacteriën in het inoculum te verdunnen en te kwantificeren. In de tweede stap wordt de vrijwilliger intranasaal geïnoculeerd met streptococcus pneumoniae.

Vervolgens ondergaat de vrijwilliger een nasale wassing op dag twee, zeven en 14 na de inoculatie. Ten slotte wordt klassieke microbiologie gebruikt om te bepalen of de vrijwilliger het geïnoculeerde occus draagt. Uiteindelijk kan experimenteel humaan pneumokokkendragerschap worden verkregen met behulp van deze veilige en reproduceerbare methode.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande muisdragersmodellen is dat deze techniek een model biedt voor dragerschap in de natuurlijke gastheer van de pneumococcus, de mens. Verder kan deze methode helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in het pneumokokkenveld, zoals wat zijn de immunologische correlaten van bescherming? Wat is het immuniserende effect van dragerschap en wat is het effect van de gastheerdruk op de ziekteverwekker in de nasofaryngeale niche?

De toepassingen van deze techniek omvatten het gebruik ervan als een methode om nieuwe pneumokokkenvaccins te selecteren. We zijn van plan om het voorkomen van dragerschap te gebruiken als een surrogaat voor door vaccins geïnduceerde immuniteit. Het demonstreren van de klinische techniek zal worden uitgevoerd door Sister Angie Wright en hoofdzuster David Shaw.

30 minuten voor de geplande inoculatie van de vrijwilliger, neemt u een inoculumvoorraadbuis uit de vriezer van min 80 graden Celsius. Draai vervolgens het tho-inoculum in een microcentrifuge gedurende drie minuten bij 17.000 keer G, terwijl de buis draait, verwarmt u enkele bloedagarplaten in een incubator van 37 graden Celsius.

Verwijder vervolgens de bouillonsate van het centrifuge-inoculum en was het pellet in één milliliter zoutoplossing. Herhaal de centrifugatie- en wasstap. Voer een verdunningsset uit voor de gewenste inoculumconcentratie en kwantificeer vervolgens de hoeveelheid bacteriën in het inoculum met een miles en misra-achtige methode.

De uitgegroeide kolonies zullen de volgende dag zichtbaar worden. Neem het inoculum mee naar de vrijwilliger die comfortabel in een semi-liggende positie moet zitten. Gebruik vervolgens een P 200-pipet en steriele filtertips.

Trek 100 microliter van het inoculum in de pipettip en steek de tip net in de neusholte. Spuit het inoculum langzaam op de neusmembraan met een circulaire beweging. Plaats de pipettip niet te ver naar achteren, anders loopt het inoculum de keel in.

Herhaal de inoculatie voor de andere neusholte om te voorkomen dat bacteriën in de bloedbaan terechtkomen. Zorg ervoor dat u het slijmvlies niet verstoort met de pipet. Laat de vrijwilliger vervolgens 10 minuten in de semi-liggende positie blijven om de bacteriën over het slijmvlies te laten verspreiden.

Na het toedienen van het inoculum aan de vrijwilligers, herhaalt u de bacteriële kwantificering in het laboratorium. Label vervolgens de buis met de datum en inoculum dosis, en bewaar het inoculum bij min 80 graden Celsius. Voordat u begint met de nasale wassing, laat u de vrijwilliger comfortabel zitten met het hoofd 30 graden achterover vanuit het verticale.

Laat vervolgens de vrijwilliger diep ademhalen en houden terwijl hij de tong omhoog en naar achteren tegen het verhemelte duwt. Laat de vrijwilliger een signaal geven wanneer deze positie is bereikt. Was nu de neusholte vier keer met 20 milliliter zoutoplossing, waarbij vijf milliliter van de zoutoplossing tegelijkertijd in de voorste neusholte wordt geloosd.

Laat de vrijwilliger onmiddellijk voorover leunen en snel door de neus uitademen in een aluminium schaal om de vloeistof te verdrijven. Na elke spoeling met vijf milliliter zoutoplossing. Nadat de neusholte is gewassen met de vier 20 milliliter, verzamel alle verzamelde monsters in een centrifugeerbuis. Centrifugeer nu de neuswasmonsters van de vrijwilliger gedurende 10 minuten bij 3.345 keer G. Verwijder de supinate en bewaar het als een milliliter aliquoten in gelabelde einorbuizen bij min 80 graden Celsius.

Voeg 100 microliter STGG-medium toe aan het pellet en meng grondig, en bepaal vervolgens het totale volume in de buis. Plateer vervolgens een druppel van 20 microliter van het geresuspendeerde pellet op een bloedagarplaat met gentamycine en strijk de hele plaat uit. Als de nasale was na inoculatie is, gebruik dan 10 microliters van de STGG die het geresuspendeerde pellet bevat.

Voor bacteriële kwantificering volgens de miles en Misra-methode, voegt u nog eens 800 microliter STGG toe aan het nasawasbuis en meng grondig. Plateer vervolgens 25 microliter van de STGG bacteriecellen oplossing op een andere bloedagarplaat en 25 microliter op een chocoladeagarplaat, waarbij u de gehele plaat uitstrekt. Vries vervolgens de resterende bacteriën in twee cryobuisjes in bij min 80 graden Celsius.

Incubeer de platen bij 37 graden Celsius overnacht in 5% koolstofdioxide. De volgende dag onderzoekt u de platen op pneumokokken en andere mogelijke respiratoire pathogenen. Bloedagarplaten, geïnoculeerd met neuswas, kunnen moeilijk te lezen zijn.

Deze afbeelding toont een voorbeeld van een plaat die gemakkelijk te lezen is met de pneumokokken duidelijk zichtbaar. Deze plaat bevat echter veel co-koloniserende flora, waardoor het moeilijker wordt om te bepalen of pneumokokken bij elke afspraak aanwezig zijn. Vrijwilligers werd gevraagd om eventuele symptomen van de bovenste luchtwegen te beschrijven en vergelijkingen tussen dragers en niet-dragers werden gemarkeerd.

Van de 145 mensen die onlangs met pneumokokken zijn geïnoculeerd, klaagden 28 over symptomen zoals samengevat in deze tabel. Acht van deze vrijwilligers waren dragers, 20 niet. Alle klachten werden beoordeeld door het externe veiligheidscomité en na volledige onderzoeken.

Er werden geen symptomen toegeschreven aan pneumokokkenziekte. De meest voorkomende symptomen waren zere keel, verstop