Name: Molecular Imaging te Getransplanteerde Muscle Progenitor Cellen Target (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-27T08:54:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Leer een niet-invasieve methode om myoblasttransplantatie te evalueren met bioluminescentiebeeldvorming en een tri-fusie reportergen in muizen. Deze techniek maakt het volgen van getransplanteerde cellen in vivo mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Sanjiv Gambhir bedanken voor de gave van de fluc/mrfp/sr39tk reportergen. Dit werk werd gefinancierd door De Stem Cell Network (SCN) van Canada, en The Jesse&#39;s Journey Foundation.

1. Instandhouding en vermeerdering van C2C12 myoblasten <ol><li> C2C12 myoblasten plaat in een 75 cm2 fles en handhaven cellen in hoge glucose Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Serum (HG-DMEM) aangevuld met foetaal bovine serum (FBS) tot een eindconcentratie van 10%. Sta niet toe dat cellen confluent worden op elk gewenst moment, omdat dit de myoblastic bevolking afbreken. Medium worden om de andere dag Opmerking:. Altijd warm medium tot 37 ° C in een waterbad voor gebruik. </li><li> Wanneer myoblasten voor ca. 80% confluente, passage cellen om een ​​nieuwe fles. Zuig kweekmedium. Was de cellen met 4-5 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) om alle sporen van kweekmedium, die trypsine-remmende serum te verwijderen. Even uitspoelen de cellaag met 2-3 ml 0,25% (w / v) trypsine-EDTA-oplossing om de hechtende myoblasten van de fles los. Aspireren trypsine en plaats kolf in incubator bij 37 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Tijdens deze incubatietie, bereidt u een nieuwe fles met 9 ml HG-DMEM/10% FBS medium. Na behandeling met trypsine, voeg 10 ml compleet medium voor cellen en pipet 4-5 keer om de verzameling van alle cellen op de middellange. Voeg 1 ml celsuspensie de nieuwe kolf en incuberen in 5% CO2 bij 37 ° C. </li></ol> 2. C2C12 celtransfectie <ol><li> Zodra cellen tot 50% confluentie transfecteren volgens instructies van de fabrikant van Invitrogen. Kort Combineer 90 pi Lipofectamine 2000 reagens met 4,5 ml OPTI-MEM medium. In een andere buis, samen 36 ug CMV-trifusion reportergen DNA met 4,5 ml OPTI-MEM. Flick elke buis te combineren en wacht 5 minuten. Combineer de inhoud van beide buizen voorzichtig en incubeer bij kamertemperatuur gedurende precies dertig minuten Opmerking:. Een tweede kolf moeten worden vastgesteld voor getransfecteerde cellen die alleen Lipofectamine en OPTI-MEM ontvangen als een negatieve controle. </li><li> Verwijderen medium van C2C12 cellen en voeg 15,5ml vers HG-DMEM/10% FBS medium. Toevoegen transfectiemedium aan totale volume 20 ml. </li><li> Toestaan ​​cellen overnacht transfecteren minstens 20 uur bij 37 ° C. </li><li> De volgende dag, aspireren transfectie medium en voeg 10 ml HG-DMEM/10% FBS. </li><li> Bekijk cellen onder een omgekeerde fluorescentie microscoop. Geven zowel helderveld en rode fluorescentie beelden (met behulp van een TRITC filter kubus; mrfp ex / em: 584/607 nm). Tel het aantal RFP tot expressie brengende cellen bekeken onder fluorescentie gedeeld door het totaal aantal cellen bekeken onder helderveld voor meerdere gebieden te transfectie efficiëntie leiden. </li></ol> 3. Beoordeling van de Cel Overlevingsvermogen / MTT-test <ol><li> Een dag voor transfectie plaat 1x10 5 C2C12 cellen in ieder putje in een 24-well plaat. Cellen worden uitgeplaat in 500 ul volume in HG-DMEM/10% FBS. </li><li> Volgende dag transfecteren myoblasten nachts zoals eerder beschreven. Volg de fabrikant suggesties voor transfectie reagent volumes voor een 24-well plaat. Incubeer een reeks kommetjes met Lipofectamine (geen DNA) als controle. Alles cellen onder fluorescentie om adequate transfectie opgetreden. </li><li> Transfectiemedium verwijderd en incubeer myoblasten met 5 mg / ml thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) in HG-DMEM/10% FBS. Toevoegen D-luciferine acht van de getransfecteerde putjes en incubeer bij 37 ° C gedurende vier uur. </li><li> Verwijder medium uit putten. Oplosbaar blauw formazan kristallen door toevoeging 180 ul isopropanol aan elke well. Schudden bij 37 ° C gedurende 15 minuten. </li><li> Vermijden neerslag pipetoplossing in een 96-well plaat en lees absorptie bij 575 nm. </li></ol> 4. Bereiding van myoblasten voor transplantatie <ol><li> Verwijder medium, wassen myoblasten met HBSS, en trypsinize cellen zoals beschreven in 1.1. </li><li> Resuspendeer cellen in 4 ml compleet medium. </li><li> Met behulp van een hemocytometer, tel cellen om volumes met 10 6 myoblasten genereren. Pipetteer volume in steriele 1,5 ml microbuisjes. Een transfectie-efficientie van ~ 10%, deze waarden blijkt dat 100.000 luciferase tot expressie brengende cellen detecteerbaar zijn op de GE ExploreOptix scanner na transplantatie. </li><li> Bereiken van een uiteindelijk injectievolume van 15 ul, bevattende 10 6 C2C12 cellen. Eventueel gecentrifugeerd bij 2000 rpm microbuizen een minuut. Zorgvuldig aspireren supernatant met een pipet. Resuspendeer cellen in 15 ul van HG-DMEM ontbreekt FBS. </li></ol> 5. Cell Implantatie <ol><li> Verdoven muis met 2% isofluraan / 2% O 2. Pluk haar van de dorsale achterste lidmaat gebied. Anesthesie te handhaven op 1,5% isofluraan / 2% O 2. </li><li> Zorg ervoor dat C2C12 myoblasten zijn goed opgeschort. Met de muis in een liggende positie, uit te breiden het achterste lidmaat en het gebruik van een insuline spuit om cellen direct te injecteren in de laterale kop van de gastrocnemius spier in een hoek van 30 °. Injecteer getransfecteerde myoblasten in de rechter achterpoot ledemaat en ongetransfecteerde myoblasten into de contralaterale (links) achterste ledematen. </li><li> Voer een basislijn bioluminescentie scan: Snel muis over te dragen aan het podium in de optische scanner, het leggen van de muis in een buikligging. Sluit de verdoving lijn. Om ervoor te zorgen de muis onder narcose blijft, moet een tweede persoon aanwezig te zijn voor het aansluiten van de verdoving lijn, terwijl de andere plaatsen van het dier in de scanner. </li><li> Voorzichtig uit te breiden het achterste lidmaat zodat het gebied van de injectie zichtbaar is. Tape achterpoten op zijn plaats met een zachte lijm zoals medische tape. </li><li> Sluit de tank en voorkomen dat licht het inwendige van de scanner openen, omdat dit het gedetecteerde achtergrondsignaal verhogen. De scanner moet worden ingesteld op de parameters die in de instructies van de fabrikant is voor bioluminescentie beeldvorming. In het bijzonder zorgen voor &quot;geen laser&quot; is geselecteerd. </li><li> Teken een region of interest (ROI) rond de geplukte gebied en begin te scannen. </li></ol> 6. Injectie van Fluc Substraat, D-luciferine, in Mdx muis &lt;ol&gt; <li> Terwijl de muis verdoofd intraperitoneaal injecteren 150 mg / kg van vuurvlieg luciferase substraat, D-luciferine (van 40 mg / ml voorraadoplossing, gemaakt volgens de instructies van de fabrikant). </li><li> Recover muis en laat een 15 minuten opname tijd voor de voorbereiding van de muis voor de volgende scan. </li></ol> 7. BLI naar Luc-expressie mediterrane partnerlanden Target na de implantatie in muismodellen van DMD <ol><li> Na opname periode weer verdoven muis, zoals beschreven in 5.1. </li><li> Transfer terug de muis om de optische scanner en voer een scan bioluminescentie op dezelfde wijze als de achtergrond scan. </li><li> Hoewel een 20 min opname periode moet maximale intensiteit van het signaal te verschaffen, kan een volgende scan worden uitgevoerd. </li><li> Na voltooiing van het beeld acquisitie, offeren de muis volgens de richtlijnen van uw Institutionele Animal Ethics Committee en de Canadese Raad van Animal Care (CCAC). Onmiddellijk i Isoleer achterste ledematen spieren en plaatsn 10% formaline om vast te stellen voor paraffine inbedding. Voer immunohistochemie kleuring voor luciferase tot intramusculaire injectie van myoblasten bevestigen. </li></ol>

<ol><li>Emery, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">The muscular dystrophies.</a> Lancet. 359, 687-695 (2002).</li>
<li>Blake, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+and+genetics+of+dystrophin+and+dystrophin-related+proteins+in+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Function and genetics of dystrophin and dystrophin-related proteins in muscle.</a> Physiol. Rev. 82, 291-329 (2002).</li>
<li>Goldring, K., Partridge, T., Watt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Muscle stem cells.</a> J. Pathol. 197, 457-467 (2002).</li>
<li>Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+that+participate+in+regeneration+of+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Cells that participate in regeneration of skeletal muscle.</a> Gene Ther. 9, 752-753 (2002).</li>
<li>Moss, F. P., Leblond, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells+as+the+source+of+nuclei+in+muscles+of+growing+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">Satellite cells as the source of nuclei in muscles of growing rats.</a> Anat. Rec. 170, 421-435 (1971).</li>
<li>Snow, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+autoradiographic+study+of+satellite+cell+differentiation+into+regenerating+myotubes+following+transplantation+of+muscles+in+young+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">An autoradiographic study of satellite cell differentiation into regenerating myotubes following transplantation of muscles in young rats.</a> Cell Tissue Res. 186, 535-540 (1978).</li>
<li>Kuang, S., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+biology+of+satellite+cells+and+their+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential.</a> Trends Mol. Med. 14 (2), 82(2008).</li>
<li>Hoffman, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+dystrophin+in+muscle-biopsy+specimens+from+patients+with+Duchenne%27s+or+Becker%27s+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Characterization of dystrophin in muscle-biopsy specimens from patients with Duchenne's or Becker's muscular dystrophy.</a> N. Engl. J. Med. 318, 1363-1368 (1988).</li>
<li>Ray, P., Tsien, R., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+validation+of+improved+triple+fusion+reporter+gene+vectors+for+molecular+imaging+of+living+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Construction and validation of improved triple fusion reporter gene vectors for molecular imaging of living subjects.</a> Cancer Res. 67 (7), 3085(2007).</li>
<li>Ray, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tri-fusion+multimodality+reporter+gene+expression+in+living+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects.</a> Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).</li>
<li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+in+living+subjects%3A+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+lights%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new lights.</a> Genes Dev. 17, 545-580 (2003).</li>
<li>Sicinski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+muscular+dystrophy+in+the+mdx+mouse%3A+a+point+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation.</a> Science. 244, 1578-1580 (1989).</li>
<li>Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMattson%2C+MP+%22Pathogenesis+of+neurodegenerative+disorders.+In%3A+Contemporary+neuroscience%22">Pathogenesis of neurodegenerative disorders. In: Contemporary neuroscience</a>. X, Humana. Totowa, NJ. 294(2001).</li>
<li>Andersson, J. E., Bressler, B. H., Ovalle, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+regeneration+in+hind+limb+skeletal+muscle+of+the+mdx+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Muscle+Res.+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">Functional regeneration in hind limb skeletal muscle of the mdx mouse.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 9, 499-515 (1988).</li>
</ol>

Auteurs hebben niets te onthullen.

In deze studie hebben we beschreven een snelle en betrouwbare moleculaire beeldvorming, reporter-gen benadering van niet-invasieve doelwit myoblasten / mediterrane partnerlanden na transplantatie. Hoewel deze studie toont aan korte lokalisatie van getransplanteerde MTR via bioluminescense imaging (BLI), de manier waarop cellen gericht kan in feite eenvoudig worden toegepast op een longitudinale beoordeling van cel aanslaan, door de implantatie van cellen die stabiel express het reportergen. Daartoe hee...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> C2C12 myoblasten </td><td> ATCC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium </td><td> Life Technologies </td><td> 12800-017 </td><td></td></tr><tr><td> foetaal runderserum </td><td> Life Technologies </td><td> 12483020 </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% trypsine-EDTA </td><td> Life Technologies </td><td> 25.200-72 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks Balanced Salt Solution </td><td> Sigma Aldrich </td><td> H6648 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Life Technologies </td><td> 11668-019 </td><td></td></tr><tr><td> Nikon Eclipse TE2000-5 </td><td> Nikon Instruments Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Xenolight D-luciferine </td><td> PerkinElmer </td><td> 122796 </td><td> 40 mg / ml in PBS </td></tr></tbody></table>

molecular imaging te getransplanteerde muscle progenitor cellen target

Molecular Imaging to Target Transplanted Muscle Progenitor Cells

Duchenne spierdystrofie (DMD) is een ernstige genetische neuromusculaire aandoening die bij 1 op de 3500 jongens en wordt gekenmerkt door progressieve spierdegeneratie 1, 2. Bij patiënten, het vermogen van resident spier satelliet cellen (SC) om beschadigde myovezels regenereren steeds inefficiënt 4. Daarom transplantatie van spier progenitorcellen (MTR) / myoblasten van gezonde proefpersonen is een veelbelovende therapeutische benadering van DMD. Een belangrijke beperking van het gebruik van stamceltherapie is echter een gebrek aan betrouwbare beeldvormende technologieën voor langdurige bewaking van geïmplanteerde cellen en voor evaluatie van de doeltreffendheid. We beschrijven een niet-invasieve, real-time benadering van het succes van transplantatie myoblast evalueren. Deze methode maakt gebruik van een verenigd fusie reportergen samengesteld uit genen (vuurvliegluciferase [schommelingen], monomere rood fluorescerend eiwit [mrfp] en sr39 thymidinekinase [sr39tk]), waarvan de expression kunnen worden afgebeeld met verschillende beeldvormende technieken 9, 10. Een verscheidenheid van beeldvormende technieken, met inbegrip van positron emissie tomografie (PET), single-photon emission computed tomography (SPECT), magnetische resonantie beeldvorming (MRI), optische beeldvorming, en hoge frequentie 3D-echografie zijn nu beschikbaar, elk met unieke voordelen en beperkingen 11. Bioluminescentie (BLI) studies, bijvoorbeeld, hebben het voordeel dat ze relatief lage kosten en hoge doorvoer. Het is om deze reden dat, in deze studie gebruik van de vuurvlieg luciferase (schommelingen) reportergen sequentie vervat in het fusiegen en bioluminescentie (BLI) voor de korte termijn lokalisatie levensvatbare C2C12 myoblasten om na implantatie in een muis model van DMD (spierdystrofie op het X-chromosoom [mdx] muis) 12-14. Belangrijker BLI geeft ons een middel om de kinetiek van gemerkte MTR na implantatie onderzocht, en is nuttig voor herhaaldelijk volgen cellen over time en volgende migratie. Onze reporter-gen aanpak verder stelt ons in staat om meerdere beeldvormende technieken in een enkel levend onderwerp samen te voegen die, gezien de tomografische natuur, fijne ruimtelijke resolutie en de mogelijkheid om op te schalen naar grotere dieren en mensen 10,11, zal PET vormen de basis van de toekomstige werkzaamheden die wij suggereren kan vergemakkelijken een snelle vertaling van methoden die zijn ontwikkeld in de cellen om preklinische modellen en klinische toepassingen.

Bij 50-60% confluentie, C2C12 myoblasten werden voorbijgaand getransfecteerd met bovengenoemde fusie reporter genconstruct uit vuurvlieg luciferase [fluc] monomere rode fluorescente eiwit [mrfp] sr39 en thymidine kinase [sr39tk] (Figuur 1A). Transfectie efficiëntie werd berekend via fluorescentiemicroscopie (fig. 1B, C), gebruik makend van de mrfp sequentie in onze reporterconstruct. Cell overlevingskansen werd niet beïnvloed door etikettering met de ...

Een niet-invasieve middelen voor het succes van transplantatie myoblast evalueren beschreven. De methode maakt gebruik van een verenigd fusie reportergen samengesteld uit genen waarvan de expressie kan worden afgebeeld met verschillende beeldvormende technieken. Hier maken we gebruik van een<em&gt; Schommelingen</em&gt; Reportergen sequentie cellen via bioluminescentie richten.

Molecular Imaging te Getransplanteerde Muscle Progenitor Cellen Target

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe genetic neuromuscular disorder that affects 1 in 3,500 boys, and is characterized by progressive muscle ...

Het algemene doel van deze procedure is om het succes van myoblasttransplantatie niet-invasief te evalueren met behulp van een reportergenbenadering en bioluminescentie-beeldvorming. Dit wordt bereikt door eerst het tri-fusie-reportergen dat f Luke, MRFP en SR drie 90 tk tot expressie brengt onder de controle van de CMV-promotor in de geïmmortaliseerde C two C 12 myoblast-cellijn te introduceren. De tweede stap is om het aantal myoblasten dat het porter-gen tot expressie brengt te kwantificeren.In deze studie wordt de transfectie-efficiëntie berekend door MRFP-expresserende cellen te tellen onder een fluorescentiemicroscoop. Vervolgens worden 10 tot vijf geëngcineerde cellen in een volume van maximaal 15 microliter intramusculair geïmplanteerd in de achterste ledemaat van dystrofische MDX-muizen. UNT-getransfecteerde cellen worden geïmplanteerd in de contralaterale achterste ledemaat als controle, waarna een baseline-scan wordt uitgevoerd.De laatste stap is om intraperitoneaal het f Luke-reportergen-substraat Lucifer te injecteren na een opnameperiode van ongeveer 20 minuten, en vervolgens een tweede bioluminescentie-scan uit te voeren om een beeld van geïmplanteerde cellen te verkrijgen. Uiteindelijk wordt opname van Lucifer specifiek waargenomen in f Luke-expresserende cellen met geen detecteerbare bioluminescentie in controlecellen die het reportergen niet tot expressie brengen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken op het gebied van milde verliesoverdrachtstechnologie, zoals de migratie van cellen na implantatie, evenals celoverleving na transplantatie.De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot therapie voor spierziekten zoals Duchenne-spierdystrofie omdat het een snelle, betrouwbare manier is om cellen niet-invasief te targeten. Na transplantatie kunnen we dus het aangeplante gebied in de loop van de tijd beoordelen en het succes of falen van de behandeling evalueren. Het demonstreren van de procedure zal Kelly gut pe zijn, een afgestudeerde student, en Rebecca Mcg, een onderzoekstechnicus uit ons laboratorium, sorry, Cultuur C two C 12 myoblasten in hoog glucose dcos gemodificeerd eagles-medium met 10% foetaal bovien serum volgens standaardprocedures voor deze cellijn. Laat de cellen niet meer dan 80% confluent worden, omdat dit de myotische populatie zal uitputten.Om de cellen voor transfectie voor te bereiden, oogst u eerst de cellen van de voorraadflas door de HBSS-spoelcel-laag kort te bedekken met trypsine. Aspiraat vervolgens snel de trypsine en plaats de flacon gedurende vijf minuten in de weefselkweekincubator. Tijdens de incubatie bereidt u twee T 75-flacons voor, elk met negen milliliter kweekmedium.Wanneer de incubatietijd voltooid is, voegt u 10 milliliter medium toe aan de flacon en spoelt u het medium vier tot vijf keer over de bodem van de flacon om ervoor te zorgen dat alle cellen worden verzameld. Zaai vervolgens elk van de T 75-flacons met een tiende van de celsuspensie van de voorraad T 75-flacon. Bij een eerste poging van deze procedure, voert u een MTT-assay uit om het effect van cellabeling op celoverleving en differentiatie en de levensvatbaarheid van geëngcineerde myoblasten vóór transplantatie te beoordelen.Zodra de cellen 50% conflueert hebben bereikt, transfecteert u één T 75-flacon met 36 microgram van het CMV Tri-fusie-reportergen in een volume van 4,5 milliliter optimum met behulp van Lipofectamine 2000 volgens de instructies van de fabrikant. Voer bovendien een mock-transfectie uit van de tweede T 75-flacon met alleen lipo 2000 en optimum zonder DNA als negatieve controle. Laat de cellen minimaal 20 uur bij 37 graden Celsius transfecteren. De volgende dag aspirieert u het transfectiemedium en vervangt u het met het geschikte volume kweekmedium met behulp van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop.Vang zowel lichtveld- als rode fluorescentiebeelden om de transfectie-efficiëntie te berekenen. Na het oogsten van de getransfecteerde myoblast door trypsine en het opnieuw opschalken van de cellen in vier milliliter compleet medium, gebruikt u een hemo cytometer om een celtelling uit te voeren. Pipetteer 10 tot zes cellen in een steriele 1,5 milliliter microbuis met een transfectie-efficiëntie van ongeveer 10%. Dit aantal cellen zou 100.000 detecteerbare Lucifer-expresserende cellen moeten opleveren na transplantatie, het uiteindelijke injectievolume zou 15 microliter moeten zijn.Als het volume in de buis groter is dan dit, centrifugeert u de microbuisjes gedurende één minuut bij 2000 RPM, asateer de supinate en hervat u het in een maximaal volume van 15 microliter groeimedium dat geen FBS bevat. Nadat de muis is geanesthetiseerd met behulp van 2% isofluorine, schakelt u over naar 1,5% isofluorine voor anesthesiegebruik. Tijdens de procedure plaatst u de muis in rugligging en plukt u het haar van het dorsale achterste ledemaat.Zorg ervoor dat de C two C 12 myoblasten goed gesuspendeerd zijn en laad vervolgens de celsuspensie in een insulinespuit. Injecteer de cellen direct in de laterale kop van de gastro-spier onder een hoek van 30 graden. Na het injecteren van getransfecteerde myoblasten in het rechterachterbeen, herhaalt u de procedure met UNT-getransfecteerde myoblasten in het contralaterale achterste ledemaat.Voer een baseline-bioluminescentie-scan uit. Eén persoon moet de muis snel naar het podium in de optische scanner verplaatsen en de muis in rugligging leggen. Een tweede persoon sluit gelijktijdig de anesthesielijn aan om ervoor te zorgen dat de muis geanesthetiseerd blijft.Strek voorzichtig de achterste ledematen uit en gebruik medisch tape om het ledemaat op zijn plaats te houden, zodat beide injectiegebieden zichtbaar zijn. Sluit de kamer en zorg ervoor dat er geen licht de binnenkant van de scanner kan bereiken, omdat dit het achtergrondsignaal dat wordt gedetecteerd, zal verhogen. De scanner moet worden ingesteld op de parameters die in de instructies van de fabrikant voor bioluminescentie-beeldvorming zijn opgenomen.Teken een gebied van belang rond het geplukte injectiegebied en start de scan om de baseline

molecular-imaging-to-target-transplanted-muscle-progenitor-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Tracking Dynamica van Muscle innesteling in kleine dieren door In Vivo TL-Imaging

Dit artikel beschrijft een optimale volgorde van de gebeurtenissen voor de multimodale beeldvorming van cellulaire grafts in knaagdier hersenen met behulp van: (i) in vivo bioluminescentie en magnetische resonantie beeldvorming, en (ii) post mortem histologische analyse. De combinatie van deze beeldvorming op een enkel dier laat cellulaire graft evaluatie met een hoge resolutie en gevoeligheid en specificiteit.

Multimodal Imaging van Stem Cell implantatie in het centrale zenuwstelsel van Muizen

Complex weefsel massa, van organen tumoren, zijn samengesteld uit verschillende cellulaire elementen. We opgehelderd de bijdrage van cellulaire fenotypes binnen een weefsel met behulp van multi-gelabelde fluorescerende transgene muizen in combinatie met multiparameter immunofluorescentiekleuring gevolgd door spectrale unmixing naar cel oorsprong evenals karakteristieken van de cel op basis van eiwit expressie ontcijferen.

Kwantitatieve Multispectral Analyse Na Fluorescent Tissue Transplantatie voor Visualisatie van de Cel Origins, types en interacties

Geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC)-afgeleide myogene voorlopers zijn veelbelovende kandidaten voor celtherapiestrategieën om spierdystrofieën te behandelen. Dit protocol beschrijft transplantatie en functionele metingen die nodig zijn om de engraftment en differentiatie van iPSC-afgeleide mesoangioblasten (een type spiergenitors) te evalueren in muismodellen van acute en chronische spierregeneratie.

Transplantatie van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide mesoangioblast-achtige myogene voorlopers in muismodellen van spierregeneratie

We beschrijven de manier van programmeren stamcellen therapeutische angiogenese factoren overexpressie bioafbreekbare polymere nanodeeltjes. Beschreven processen omvatten polymeersynthese, transfecteren vet-afgeleide stamcellen in vitro, en valideren van de werkzaamheid van geprogrammeerde stamcellen om angiogenese te bevorderen in een muizen achterbeen ischemie model.

Programmeren stamcellen voor therapeutische angiogenese gebruik van biologisch afbreekbare polymere nanodeeltjes

De isolatie en cultuur van een zuivere populatie van rustende cellen satelliet, een spier stamcelpopulatie, is essentieel voor het begrip van spier stamcel biologie en regeneratie, en stamceltransplantatie voor therapieën spierdystrofie en andere degeneratieve ziekten.

Isolatie, Cultuur en Transplantatie van Muscle satelliet-cellen

Dit protocol beschrijft de radiolabeling van paarden mesenchymale stamcellen en hun implantatie in peesletsels bij het paard om celoverleving en weefselverdeling te bepalen met behulp van gamma-scintigrafie.

In vivo beeldvorming en bijhouden van Technetium-99m gelabelde beenmerg mesenchymale stamcellen in Equine tendinopathie

Hier gebruiken we bioluminescente, X-ray, en het positron-emissie tomografie/berekend tomography imaging te bestuderen hoe remmende mTOR activiteit beïnvloedt het beenmerg-geaccepteerd myeloma tumoren in een xenograft model. Dit zorgt voor fysiologisch relevante, niet-invasieve en multimodale analyses van het effect van de anti-myeloma van therapieën gericht op beenmerg-geaccepteerd myeloma tumoren in vivo.

Multimodale bioluminescente en positronisch-emissie tomografie/computationele Tomography Imaging van Multiple Myeloma beenmerg Xenografts in NOG muizen

We beschrijven de intraparenchymale transplantatie van menselijke neurale voorlopercellen getransduceerd met een dual reporter vector die luciferase-groen fluorescerend eiwit (GFP) in de hersenen van muizen tot expressie brengt. Na transplantatie wordt het luciferasesignaal herhaaldelijk gemeten met behulp van in vivo bioluminescentie en GFP-tot expressie brengende getransplanteerde cellen geïdentificeerd in hersensecties met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Intracerebrale transplantatie en in vivo bioluminescentie tracking van menselijke neurale voorlopercellen in de hersenen van de muis

Het hier gepresenteerde protocol maakt de identificatie en hoogdimensionale analyse van spierstam- en voorlopercellen mogelijk door middel van eencellige massacytometrie en hun zuivering door FACS voor diepgaande studies van hun functie. Deze benadering kan worden toegepast om de regeneratiedynamiek in ziektemodellen te bestuderen en de werkzaamheid van farmacologische interventies te testen.

Identificatie en analyse van myogene voorlopercellen in vivo tijdens acuut skeletspierletsel door hoogdimensionale eencellige massacytometrie

Celtherapie biedt een veelbelovende interventie voor longfibrose door voorlopercellen te gebruiken om beschadigd weefsel te herstellen en de longfunctie te verbeteren. Aangezien beeldvorming een cruciale rol speelt bij het volgen van celintegratie, beschrijven we hierin magnetische beeldvorming-geleide in vivo tracking van celtherapie voor longfibrose in een muismodel.

Beeldgeleide in vivo tracking van getransplanteerde distale longepitheliale voorlopercellen voor longfibrose met behulp van magnetische beeldvorming

Leer een niet-invasieve methode om myoblasttransplantatie te evalueren met bioluminescentiebeeldvorming en een tri-fusie reportergen in muizen. Deze techniek maakt het volgen van getransplanteerde cellen in vivo mogelijk.

Molecular Imaging te Getransplanteerde Muscle Progenitor Cellen Target

Meer video's verkennen