Name: Ex Vivo Red Blood Cell Hemolyse Assay voor de beoordeling van de pH-responsieve Endosomolytic Agenten voor Cytosolic Levering van Biomacromoleculaire Drugs (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Leer een hemolyse-assay voor het evalueren van cytosolische levering van biomacromoleculaire geneesmiddelen met rode bloedcellen als model voor endosomale membranen. Deze methode helpt onderzoekers om drug delivery-systemen te screenen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs erkennen de financiering door het ministerie van Defensie Congressionally Medical Research Programma (# W81XWH-10-1-0445), National Institutes of Health (NIH R21 HL110056) en American Heart Association (# 11SDG4890030).

1. Voorbereiding en Sterilisatie van Buffers en Test Agenten <ol><li> 150 mM NaCl buffer: Los 4,383 g NaCl kristallen in 500 ml water nanopure. </li><li> pH Buffers: voorbereiden fosfaat buffers bij pH 5,6, 6,2, 6,8 en 7,4 door het mengen van geschikte hoeveelheden monobasisch en dibasisch natriumfosfaat. Indien monsters worden getest bij lagere pH waarden (bijvoorbeeld pH &lt;5,6) dan een geschikte buffer, zoals citraat buffer, worden gebruikt. Buffer recepten zijn direct beschikbaar, en een voorbeeld verzoek is hier voorzien. 12 </li><li> Steriliseer alle buffers zoals hierboven vermeld door middel van een fles-top vacuümfiltratie apparaten en re-check buffer pH&#39;s. </li><li> 20% Triton X-100 (positieve controle): Mix 20 ml pure Triton X-100 in 80 ml water nanopure. Vortex krachtig en ultrasone trillingen op te lossen. &#39;S nachts niet op kamertemperatuur voor gebruik. </li></ol> 2. Bereiding van Erythrocyten <ol><li> Verkrijgen van 25 ml bloed frOM een anonieme menselijke donor direct gezogen K 2-EDTA-gecoate Vacutainer buizen coagulatie te voorkomen. </li></ol> OPMERKING: Alle procedures moeten vooraf worden goedgekeurd door de bevoegde Institutional Review Board (IRB), en venapunctie en bloedafname moet worden uitgevoerd door een getrainde phlebotomist om het risico te minimaliseren voor de donor. Standaard aderlaten procedures zijn elders gepubliceerd 13. <ol start="2"><li> Centrifugeer bloed bij 500 xg gedurende 5 min, en Mark niveaus van hematocriet (rood, onderlaag) en plasma (geelachtig, bovenlaag) op de buis. </li><li> Zuig plasma via een micropipettor, toe te voegen in bleekwater, en dient het naar biologisch gevaarlijk afval. </li><li> Vul hematocriet buis gemarkeerde lijn (oorspronkelijke niveau van plasma) met 150 mM NaCl-oplossing. Cap en zwenken om voorzichtig te mengen. Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Herhaal stap 2,3-2.4 om opnieuw te wassen bloedcellen. Dan zuigen supernatant en vervangen door PBS bij pH 7,4. Omkeren om te mengen. </li><li> Split bloed gelijkmatig in vier buizen, die overeenkomen met elke pH-waarde die zal worden getest. Label de buizen volgens elk te testen pH (5,6, 6,2, 6,8, 7,4). </li><li> Centrifugeer bloedbuisjes bij 500 xg gedurende 5 minuten. Markeer niveaus op buizen, dan aspireren supernatant. </li><li> Vul elke buis voorzien overeenkomstig buffer van geschikte pH (zoals aangegeven in 2.6). </li><li> Label vier 50 ml conische buizen (een per pH test) en pipet 49 ml van PBS van geschikte pH in elke conische buis. </li><li> Voeg 1 ml van erytrocyten (zelfde pH) in corresponderende buis voor een 1:50 verdunning. Inspecteer de verdunde bloed, dat moet worden troebel en zal vestigen als ongemoeid gelaten. Als er geen pellet vormen, zijn de cellen gelyseerd. </li></ol> 3. Lysis Assay plaat met 96 putjes Setup en kwantificering <ol><li> Bereid voorraadoplossingen van alle experimentele drug delivery middelen, bij 20x de gewenste eindconcentratie te testen (Assayzal 10 pl drug delivery agent + 190 pl verdund rode bloedcellen, wat leidt tot een 1/20 verdunning van de originele drug delivery agent in de uiteindelijke testmengsel). Voorraden van 20, 100 en 800 pg / ml worden voorgesteld, resulteert in eindtest concentraties van 1, 5 en 40 ug / ml. </li><li> Pipetteer 10 ul van elke voorraadoplossing in V-bodem 96-well platen. Voor een optimaal resultaat te laden elk monster in drievoudige of viervoudige. </li></ol> OPMERKING: Voor het gemak, wordt aanbevolen dat een aparte plaat met 96 putjes worden bereid voor elke pH te testen, met elk monster (bij elke concentratie) die op n = 3-4 per plaat. <ol start="3"><li> Voor positieve controles, voeg 10 ul van 20% Triton X-100. </li><li> Voor negatieve controle putjes, voeg 10 ul fosfaatbuffer. Gebruik buffer bij dezelfde pH te testen. </li><li> Pipetteer 190 ul van verdunde erytrocyten (zie 2.10) aan elk putje, zorg ervoor dat cel-stockoplossing blijfthomogene tijdens de overdracht. Hint: Gebruik multi-channel pipet om deze taak te vereenvoudigen. </li><li> Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende een uur (Optioneel: Gebruik een schudapparaat of rocker). </li><li> Centrifugeer platen gedurende 5 minuten bij 500 xg om pellet intact erytrocyten. Opmerking: wanneer u de plaat uit de centrifuge en de afvoer ervan naar de volgende stap, voorzichtig en zeker niet aan de celpellet verstoren. </li><li> Met een multichannel pipet, breng 100 ui supernatant uit elk putje naar een heldere, platte bodem 96-well plaat. Opmerking: als de cel pellet per ongeluk wordt verstoord in een monster (s), kan men opnieuw centrifugeer de plaat en ga vervolgens verder met supernatant overdracht. </li><li> Meet de absorptie van supernatanten met een plaat lezer. Merk op dat een reeks van golflengten kunnen worden gebruikt (400-541 nm). </li></ol> OPMERKING: Verschillende plaat lezers kunnen verschillende congestie en gevoeligheden hebben, dus de keuze van een golflengte voor mijasurements afhankelijk of hemolyse resultaten van experimentele monsters betrouwbaar kan worden genormaliseerd tegen maximum hemolyse zoals geïnduceerd door detergens behandeling. Dit vereist een nauwkeurige meting van de absorptiewaarden van de positieve controle monsters. <ol start="10"><li> Microsoft Excel of soortgelijke gegevens analyse software, vindt het gemiddelde van de achtergrond absorptiemetingen van de negatieve controle monsters voor elke pH (stap 3,4) ingesteld. Trek deze achtergrond extinctie van alle andere monsters die werden gemeten bij die pH. </li><li> Na achtergrond aftrek, u de gemiddelde absorptie van de positieve controle detergens-behandelde monsters (stap 3.3). Dan normaliseren alle experimentele datapunten met deze gemiddelde absorptiewaarde, die moet 100% hemolyse te vertegenwoordigen. Tenslotte vermenigvuldigt elk putje waarde met 100%% hemolyse die zich in elk goed ten opzichte van het wasmiddel control berekenen. </li></ol>

<ol><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlberts%2C+B+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22">Molecular Biology of the Cell</a>. , 4th, Garland Science. (2002).</li>
<li>Boasson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Bacteriolysis+by+Lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">On the Bacteriolysis by Lysozyme.</a> The Journal of Immunology. 34, 281-293 (1938).</li>
<li>Convertine, A. J., Benoit, D. S., Duvall, C. L., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+endosomolytic+diblock+copolymer+for+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Development of a novel endosomolytic diblock copolymer for siRNA delivery.</a> J. Control. Release. 133, 221-229 (2009).</li>
<li>Duvall, C. L., Convertine, A. J., Benoit, D. S., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Delivery+of+a+Proapoptotic+Peptide+via+Conjugation+to+a+RAFT+Synthesized+Endosomolytic%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Intracellular Delivery of a Proapoptotic Peptide via Conjugation to a RAFT Synthesized Endosomolytic.</a> 7, 468-476 (2010).</li>
<li>Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+escape+pathways+for+delivery+of+biologicals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Endosomal escape pathways for delivery of biologicals.</a> Journal of Controlled Release. 151, 220-228 (2011).</li>
<li>Plank, C., Oberhauser, B., Mechtler, K., Koch, C., Wagner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+endosome-disruptive+peptides+on+gene+transfer+using+synthetic+virus-like+gene+transfer+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The influence of endosome-disruptive peptides on gene transfer using synthetic virus-like gene transfer systems.</a> Journal of Biological Chemistry. 269, 12918-12924 (1994).</li>
<li>Ratner, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+Cells+Are+Sensitive+Detectors+of+Bacterial+Pore-forming+Toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Epithelial Cells Are Sensitive Detectors of Bacterial Pore-forming Toxins.</a> Journal of Biological Chemistry. 281, 12994-12998 (2006).</li>
<li>Saar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptides%3A+A+comparative+membrane+toxicity+study%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptides: A comparative membrane toxicity study.</a> Analytical Biochemistry. 345, 55-65 (2005).</li>
<li>Kichler, A., Leborgne, C., Coeytaux, E., Danos, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethylenimine-mediated+gene+delivery%3A+a+mechanistic+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gene+Medicine%22%5BJournal%5D)">Polyethylenimine-mediated gene delivery: a mechanistic study.</a> The Journal of Gene Medicine. 3, 135-144 (2001).</li>
<li>Behr, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Proton+Sponge%3A+a+Trick+to+Enter+Cells+the+Viruses+Did+Not+Exploit%5BTitle%5D)+AND+%22CHIMIA+International+Journal+for+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Proton Sponge: a Trick to Enter Cells the Viruses Did Not Exploit.</a> CHIMIA International Journal for Chemistry. 51, 34-36 (1997).</li>
<li>Dawson, R. M. C., Elliot, D. C., Elliot, W. H., Jones, K. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDawson%2C+RMC+%22Data+for+Biochemical+Research%22">Data for Biochemical Research</a>. , 3rd, Oxford University Press. (1986).</li>
<li>Ernst, D. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aErnst%2C+DJ+%22Applied+Phlebotomy%22">Applied Phlebotomy</a>. , 1st, Lippincott Williams & Wilkins. (2005).</li>
<li>Bulmus, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+pH-responsive+and+glutathione-reactive%2C+endosomal+membrane-disruptive+polymeric+carrier+for+intracellular+delivery+of+biomolecular+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+controlled+release+%3A+official+journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">A new pH-responsive and glutathione-reactive, endosomal membrane-disruptive polymeric carrier for intracellular delivery of biomolecular drugs.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 93, 105-120 (2003).</li>
<li>Lackey, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolytic+Activity+of+pH-Responsive+Polymer-Streptavidin+Bioconjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hemolytic Activity of pH-Responsive Polymer-Streptavidin Bioconjugates.</a> Bioconjugate Chemistry. 10, 401-405 (1999).</li>
<li>Murthy, N., Campbell, J., Fausto, N., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinspired+pH-responsive+polymers+for+the+intracellular+delivery+of+biomolecular+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+chemistry%22%5BJournal%5D)">Bioinspired pH-responsive polymers for the intracellular delivery of biomolecular drugs.</a> Bioconjugate chemistry. 14, 412-419 (2003).</li>
<li>Murthy, N., Robichaud, J. R., Tirrell, D. A., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+and+synthesis+of+polymers+for+eukaryotic+membrane+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+controlled+release+%3A+official+journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">The design and synthesis of polymers for eukaryotic membrane disruption.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 61, 137-143 (1999).</li>
<li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+endosomal+barrier+by+amphotericin+B-loaded+dual+pH-responsive+PDMA-b-PDPA+micelleplexes+for+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+nano%22%5BJournal%5D)">Overcoming endosomal barrier by amphotericin B-loaded dual pH-responsive PDMA-b-PDPA micelleplexes for siRNA delivery.</a> ACS nano. 5, 9246-9255 (2011).</li>
<li>Nelson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+local+delivery+of+siRNA+from+an+injectable+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Sustained local delivery of siRNA from an injectable scaffold.</a> Biomaterials. 33, 1154-1161 (2012).</li>
<li>Miozzari, G. F., Niederberger, P., Hütter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+microorganisms+by+Triton+X-100%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of microorganisms by Triton X-100.</a> Analytical Biochemistry. 90, 220-233 (1978).</li>
<li>Chen, H., Zhang, H., McCallum, C. M., Szoka, F. C., Guo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unsaturated+Cationic+Ortho+Esters+for+Endosome+Permeation+in+Gene+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Unsaturated Cationic Ortho Esters for Endosome Permeation in Gene Delivery.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 50, 4269-4278 (2007).</li>
<li>Roth, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Measurements+and+Rational+Materials+Design+for+Intracellular+Delivery+of+Oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Quantitative Measurements and Rational Materials Design for Intracellular Delivery of Oligonucleotides.</a> Biotechnology Progress. 24, 23-28 (2008).</li>
<li>Blumenthal, R., Seth, P., Willingham, M. C., Pastan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH-dependent+lysis+of+liposomes+by+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">pH-dependent lysis of liposomes by adenovirus.</a> Biochemistry. 25, 2231-2237 (1986).</li>
<li>Moore, N. M., Sheppard, C. L., Barbour, T. R., Sakiyama-Elbert, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+endosomal+escape+peptides+on+in+vitro+gene+delivery+of+polyethylene+glycol-based+vehicles%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gene+Medicine%22%5BJournal%5D)">The effect of endosomal escape peptides on in vitro gene delivery of polyethylene glycol-based vehicles.</a> The Journal of Gene Medicine. 10, 1134-1149 (2008).</li>
<li>Panyam, J., Zhou, W. Z., Prabha, S., Sahoo, S. K., Labhasetwar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+endo-lysosomal+escape+of+poly%28DL-lactide-co-glycolide%29+nanoparticles%3A+implications+for+drug+and+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Rapid endo-lysosomal escape of poly(DL-lactide-co-glycolide) nanoparticles: implications for drug and gene delivery.</a> The FASEB Journal. 16, 1217-1226 (2002).</li>
</ol>

IRB goedkeuring: Procedures met mensen zijn goedgekeurd door de Vanderbilt University Institutional Review Board (IRB; Protocol # 111251). Geen belangenconflicten verklaard.

pH-gevoelige polymeren of andere middelen geschikt voor endosomolytic functie kan snel en effectief gescreend op basis van lysis van rode bloedcellen bij een pH aangetroffen in de endosoom (Figuur 1; pH 6,8 - vroege endosoom, pH 6,2 - late endosoom, pH 5,6 - lysosoom). 14-17 pH-afhankelijke hemolyse werd gebruikt om het vermogen van vervoerders endosomale afgifte Biomacromoleculaire geneesmiddelen (bijv. peptiden, siRNA, ODNs, eiwitten) bemiddelen scherm en resultaten van deze assay ...

Hoewel er vele mogelijke high-impact therapeutische targets in de cel, de intracellulaire afgifte van middelen vormt een grote uitdaging. Vaak worden drugs, vooral biologische, geïnternaliseerd door cellen en verhandeld in blaasjes die ofwel leiden tot afbraak van de inhoud door de endo-lysosomale route, of back brachten de cel via exocytose. 1 In de laatste werkwijze, de interne pH van de vesicles wordt aangezuurd tot ongeveer 5-6, met de optimale pH voor activiteit van enzymen die functioneren in dit compartiment, zoals lysozym. twee Recent zijn een aantal materialen zijn speciaal ontworpen om gebruik te maken van de verzuring van endosomen te vergemakkelijken cytosolische levering van hun lading. Een voorbeeld van deze benadering maakt gebruik van synthetische polymeer micel nanodeeltjes die kern zwitterionische en lastenneutraal bij fysiologische pH (bijv. 7,4). Echter bij pH 6,0- 6.5, de polymeren worden geprotoneerd en zich een netto positieve lading die de micel kern destabiliseert en de blootgestelde polymeersegmenten interactie met en verstoren de endosomale membraan. Deze activiteit is aangetoond dat het endosomale ontsnappen van peptide en nucleïnezuur gebaseerde geneesmiddelen bevorderen, waardoor zij hun targets cytosolische openen. 3,4 Andere voorbeelden van ontwikkelde methoden endosomale escape dat het membraan barrière verstoren bemiddelen omvatten &quot;fusogenische&quot; peptiden of eiwitten die membraanfusie of transient poriënvorming kunnen bemiddelen in de fosfolipide dubbellaag. 5 Homopolymeren van anionogene alkyl acrylzuren zoals poly (propylacrylic zuur) een goed bestudeerde benadering en in deze polymeren, de protonering staat hanger carbonzuur dicteert overgang in een hydrofoob, membraan-ontwrichtende staat in endo-lysosomale pH-bereiken. 6,7 Een bruikbaar model systeem voor het screenen van endosomolytic gedrag is het ex vivo pH-afhankelijke hemolyse assay. 8 In dit modelsysteem de erytrocytenmembraan dient als een surrogaat voor het lipidebilaagmembraan die endo-lysosomale vesicles omsluiten. Dit model generaliseerbaar is door anderen om endosomolytic gedrag van cellen binnendringen peptiden en andere polymere genafgiftesystemen evalueren. 8-11 In dit experiment menselijke rode bloedcellen en testmaterialen worden geco-incubeerd in buffers bij pH gedefinieerd dat nabootsen extracellulaire (7,4), vroege endosomale (6,8), en laat endo-lysosomale (&lt;6,8) omgevingen. De hoeveelheid hemoglobine vrijkomt tijdens de incubatieperiode wordt gekwantificeerd als een maat van rode bloedcellen lysis, die is genormaliseerd naar de hoeveelheid hemoglobine model in positieve controlemonsters gelyseerd met een reinigingsmiddel. Van het screenen van een kleine bibliotheek van potentieel endosomolytic testmateriaal, kan men afleiden dat de monsters die geen hemolyse produceren bij pH 7,4, maar significant verhoogd zoomolysis bij pH &lt;6,5, zal de meest effectieve en cytocompatible kandidaten voor cytosolische drug delivery. Materialen die deze criteria past worden naar verwachting inert en niet zonder lipide dubbellaag membranen (bijv. waardoor cytotoxiciteit) vernietigen tot blootstelling aan een daling in de lokale pH na internalisatie in endo-lysosomale compartimenten. In dit protocol worden erythrocyten geïsoleerd uit een menselijke donor en co-geïncubeerd bij pH 5,6, 6,2, 6,8 of 7,4 experimentele endosomolytic drug delivery agents. Intact erytrocyten worden gepelleteerd en de supernatanten (met hemoglobine bezit van gelyseerde erytrocyten) geanalyseerd voor de karakteristieke absorptie van hemoglobine via een plaatlezer (figuur 1).

<table border="1"><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> BD Vacutainer - K2EDTA Vacutainer buizen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-253-145 </td><td> Voor bloedafname </td></tr><tr><td> BD Vacutainer bloedafname Naalden, 20.5-gauge </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-665-31 </td><td> Voor bloedafname </td></tr><tr><td> BD Vacutainer Tube Holder / Naald Adapter </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-289-953 </td><td> Voor bloedafname </td></tr><tr><td> BD Merk Isopropyl Alcohol Swabs </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-680-63 </td><td> Voor bloedafname </td></tr><tr><td> BD Vacutainer Latexvrij Tourniquet </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-657-6 </td><td> Voor bloedafname </td&gt; </tr><tr><td> Zoutzuur (geconcentreerd) </td><td> Fisher Scientific </td><td> A144-500 </td><td> Voor regeling van de pH van D-PBS. </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8787 </td><td> Positieve controle </td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;s PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Nalgene MF75 Steriel Disposable Bottle-Top Filter Unit met SFCA Membraan </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-740-44A </td><td></td></tr><tr><td> BD 96-well platen, vlakke bodem, weefselkweek behandeld polystyreen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772-2C </td><td> Voor plaat-lezing eind van de test. </td></tr><tr><td> BD 96-well platen met ronde bodem, weefselkweek behandelde polystyreen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772-17 </td><td> Voor incubatie van rode bloedcellen met experimentele middelen. </td></tr></table&gt;

ex vivo red blood cell hemolyse assay voor de beoordeling van de ph-responsieve endosomolytic agenten voor cytosolic levering van biomacromoleculaire drugs

Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs

Fosfolipide dat endo-lysosomale blaasjes vormen kunnen vormen een belemmering voor de levering van biologische geneesmiddelen voor intracellulaire targets. Om deze barrière te overwinnen zijn een aantal synthetische drug carriers geconstrueerd om actieve verstoring het endosomale membraan en lading af te leveren in het cytoplasma. Hier beschrijven we de hemolyse assay die kan worden gebruikt als snelle, high-throughput screen voor cytocompatibility en endosomolytic activiteit van intracellulaire drug delivery systemen. In de hemolyse assay worden menselijke rode bloedcellen en testmateriaal geco-incubeerd in buffers bij pH gedefinieerd dat extracellulaire, vroege endosomale en late endo-lysosomale omgeving nabootsen. Na centrifugatie stap pellet intacte rode bloedcellen, wordt de hoeveelheid hemoglobine in het medium afgegeven spectrofotometrisch gemeten (405 nm voor de beste dynamisch bereik). Het percentage rode bloedcellen verstoord wordt dan ten opzichte van de positieve controle samp gekwantificeerdles gelyseerd met een reinigingsmiddel. In dit modelsysteem de erytrocytenmembraan dient als een surrogaat voor het lipidebilaagmembraan die endo-lysosomale vesicles omsluiten. Het gewenste resultaat is verwaarloosbaar hemolyse bij fysiologische pH (7,4) en robuust hemolyse in het endo-lysosomale pH-traject van ongeveer pH 5-6,8.

<html> Typisch het ideale middelen die pH-afhankelijk gedrag vertonen hemolytische hebben het grootste potentieel voor cytosolische toediening van geneesmiddelen, nucleïnezuren en andere biologisch actieve moleculen. Dit wordt geïllustreerd door Agent 1 als afgebeeld in figuur 2, die minimale hemolyse vertoont bij pH 7,4, maar een sterke toename van hemolytische gedrag endosomale pH bereik (&lt;6,5). Sommige middelen kunnen vertonen aanzienlijke mate hemolytische gedrag bij fysiologische pH bereik (Agent...

Een hemolyse assay kan worden gebruikt als een snelle, high-throughput screen van drug delivery systems &#39;cytocompatibility en endosomolytic activiteit intracellulaire lading levering. De test meet de verstoring van de erythrocyten membranen als functie van pH milieu.

Ex Vivo Red Blood Cell Hemolyse Assay voor de beoordeling van de pH-responsieve Endosomolytic Agenten voor Cytosolic Levering van Biomacromoleculaire Drugs

Phospholipid bilayers that constitute endo-lysosomal vesicles can pose a barrier to delivery of biologic drugs to intracellular targets. To overcome this ...

Het algemene doel van dit experiment is om het membraanverstorende potentieel van geneesmiddelafgevingsvectoren voor de intracellulaire aflevering van biologische stoffen kwantitatief te beoordelen, waarbij rode bloedcellen dienen als biologisch model voor het endosomale membraan. Deze video is geproduceerd door het Advanced Therapeutics Laboratory aan de Vanderbilt University. Alle procedures met menselijke proefpersonen zijn goedgekeurd door de Institutional Review Board van Vanderbilt.Ten eerste een korte inleiding tot endocytose, hemolyse en hemolyse. Dragers van biologische geneesmiddelen worden door de cel opgenomen in endosomen via aspecifieke of receptor-gemedieerde endocytose. Na de endocytose.De vracht wordt ofwel afgebroken in lysosomen of getransporteerd via exocytose terug naar de extracellulaire ruimte. Zoals getoond kan de dalende pH in een endosoom echter worden benut met pH-gevoelige geneesmiddeldragers die door de zure omgeving membraanverstorend worden, waardoor ze de endosomale membraan fysiek perforeren en/of destabiliseren; zodra het endosoom is verstoord, kan de geneesmiddelvracht in het cytoplasma worden vrijgegeven en diffunderen naar de doellocaties in het cytoplasma, de mitochondriën of de celkern. In deze assay worden rode bloedcellen gebruikt als model voor de endosomale membraan bij een fysiologische pH.Ideale afleveringsvoertuigen blijven stabiel en verstoren het membraan van de rode bloedcel niet. Echter, bij een daling van de pH wordt het afleveringsvoertuig instabiel, wat leidt tot hydrofobe interacties die het membraan van de rode bloedcel vernietigen, waardoor hemoglobinen vrijkomen. Het hemoglobinen kunnen vervolgens uit de rode bloedcellen worden geïsoleerd en spectrofotometrisch worden gekwantificeerd door absorptie bij 405, 450 of 541 nanometer.Hogere absorbentiewaarden zullen correleren met een potenter endolytisch gedrag. Dit kan worden gevisualiseerd met time-lapse microscopie bij een fysiologische pH. De rode bloedcellen blijven stabiel in de aanwezigheid van de drug carrier.Echter, bij een lagere pH die kenmerkend is voor het endosomale pad, ontregelen en vernietigen de afleveringsvoertuigen snel de membranen van de rode bloedcellen. De materialen die nodig zijn voor deze studie omvatten 150 millimolair natriumchloride, bereid met 500 milliliters gedeïoniseerd water en 4,383 gram natriumchloride, steriel gefilterd via een vacuümfiltratieapparaat voor flessen.De pH werd gemonitord met een pH-meter en/of pH-strips, waarbij verschillende methoden werden gebruikt om de nauwkeurigheid van de metingen te waarborgen. 20% Triton X werd bereid door 20 milliliters Triton X 102 op te lossen in 80 milliliters nanopuur water, waarna het mengsel krachtig werd geschud en gesoniceerd om volledige oplossing te verkrijgen, na goedkeuring door de institutionele toetsingscommissie. Laat uw studieverpleegkundige of flebotomist 25 milliliters volbloed van een anonieme donor verzamelen in met kalium-EDTA gecoate vacuümbuizen om stolling te voorkomen.In deze video wordt een afnamenaald van 20,5 gauge gebruikt die is verbonden met een vacutainer-adapter. Het afgenomen bloed wordt gecentrifugeerd bij 500 ×g gedurende vijf minuten. Na de centrifugatie moeten de plasmalaag en de laag met rode bloedcellen duidelijk zichtbaar zijn.Zorg ervoor dat de lagen niet worden verstoord door te schudden. Markeer de plasmaniveaus, aspireer deze vervolgens voorzichtig met een micropipet of vacuümaspirator en gooi ze weg in bleekmiddel. Vervang het plasma door 150 millimolar natriumchloride tot aan de gemarkeerde lijn.Sluit het vial af en keer het meerdere keren om om voorzichtig te mengen. Centrifugeer voor een tweede maal bij 500 G gedurende vijf minuten, gevolgd door aspiratie van het supernatant. Vul het supernatant aan tot de markeerlijn met 150 millimolair natriumchloride en keer het meerdere keren om om voorzichtig te mengen; centrifugeer voor een derde maal bij 500 G gedurende vijf minuten. Aspireer het supernatant en vul aan tot de markeerlijn met PBS met pH 7,4.Verdeel het bloedvoorraad gelijkmatig over vier buisjes. Eén voor elke te testen pH, inclusief de fysiologische pH van 7,4, de vroege endosomale pH van 6,8, de late endosomale pH van 6,2 en de pH van late endosomen of lysosomen van 5,8. Herhaal de centrifugatie voor de vierde en laatste keer bij 500 G gedurende vijf minuten.Markeer de niveaus van het supernatant en aspireer dit voorzichtig door het supernatant in bleekmiddel weg te gooien. Vervang het supernatant door PBS met de juiste pH. De uiteindelijke voorraden rode bloedcellen worden gemaakt door stokoplossingen 50 maal te verdunnen in een buffer met de juiste pH.In dit geval werd één milliliter geconcentreerde rode bloedcellen toegevoegd aan 49 milliliter PBS; keer het vial voorzichtig enkele keren om om de rode bloedcellen te mengen vóór de bloedbereiding. Bereid voorraadoplossingen van de afleveringsvoertuigen in een 20-voudige concentratie. Voor polymeren suggereren wij 2100 en 800 µg/mL als initiële testconcentraties; na verdunning zal de uiteindelijke concentratie 105 en 40 µg/mL zijn voor incubatie. Gebruik kegelvormige of rondbodemplaten zodat intacte rode bloedcellen via centrifugatie kunnen worden verwijderd. Pipetteer 10 µL van de 20-voudige polymeeroplossing in elke put.Wij raden aan om monsters in ten minste drievoud of viervoud uit te voeren om de resultaten te optimaliseren. Triton X zal alle cellen lyseren en kan als positieve controle worden gebruikt bij een eindconcentratie van 1%. PBS bij pH 7.4 kan als negatieve controle worden gebruikt; pipetteer 190 µL verdunde rode bloedcellen in elke put. Zorg ervoor dat de rode bloedceloplossing homogeen blijft, wat mogelijk licht schudden of mengen vereist om ze in suspensie te houden.Let op: zodra de rode bloedcellen zijn toegevoegd, kan er bij extreem hemolytische verbindingen al lysis optreden. Incubeer gedurende één uur bij 37 °C om de lysis te laten plaatsvinden. Neem de platen uit voor centrifugatie en centrifugeer de platen bij 500 G om de rode bloedcellen te pelletiseren.Breng vervolgens voorzichtig 100 µL van het supernatant over naar een 96-wellsplaat met een platte bodem. Het is essentieel om de pellet van rode bloedcellen niet te verstoren, dus ga uiterst zorgvuldig te werk. Meet de absorbentie van elke well met een plaatlezer bij 450 nm.Als hemoglobine te geconcentreerd is en hoge absorbentiewaarden worden verkregen, kunnen de platen ook worden uitgelezen bij 541 nanometer. Omgekeerd, als hemoglobine te verdund is en lage absorbentiewaarden worden verkregen, kunnen de platen worden uitgelezen bij 405 nanometer om de absorbentie te maximaliseren. Om de gegevens te analyseren, kan het percentage hemolyse worden berekend door ervan uit te gaan dat PBS geen rode bloedcellen zal lyseren en dat Triton X 100% van de rode bloedcellen zal lyseren.De getoonde vergelijking geeft het percentage homolyse voor elk monster. Software zoals Microsoft Excel kan worden gebruikt om experimenten uit honderden wells snel te analyseren. Hier volgen representatieve resultaten bij verschillende concentraties over de besproken pH-bereiken.Deze formulering vertoont een ideale pH-respons en demonstreert geen hemolytische activiteit bij fysiologische pH, maar vertoont een schakelachtig gedrag bij endosomale pH dat resulteert in aanzienlijke membraandestructie, zoals aangegeven door de rode pijl. U heeft zojuist de video van ons laboratorium bekeken waarin de pH-afhankelijke hemolyse-assay voor rode bloedcellen wordt beschreven. Dit is een relatief goedkope, gebruiksvriendelijke en high-throughput assay die kan worden gebruikt om combinatorische bibliotheken van polymeerseries te screenen die zijn ontworpen voor insolytische toediening van biologische geneesmiddelen.Wij stelden vast dat deze assay zeer voorspellend is voor de cytosolische aflevering en bioactiviteit van een reeks biologische geneesmiddelen, waaronder eiwitten, peptiden en nucleïnezuren. Er moet echter worden opgemerkt dat er enkele potentiële zwakheden van deze assay zijn. Men gaat ervan uit dat het een goed voorspellend instrument is voor polymeren of peptiden die de endosomale membraan daadwerkelijk fysiek verstoren.Het is echter geen goede voorspellende tool voor gebruik bij polymeren of andere systemen die werken via een mechanisme op basis van de proton-spons. Daarnaast moet men er rekening mee houden dat de samenstelling van de lipide dubbellaag van rode bloedcellen niet exact overeenkomt met die van endosomale of lysosomale membranen. Gezien de lipidencompositie en het cholesterolgehalte moet men altijd bereid zijn om vervolgonderzoeken uit te voeren.Elk resultaat van hemolyse van rode bloedcellen in combinatie met aanvullende technieken en assays. Zo kan fluorescentiemicroscopie, in samenhang met endosomale of lysosomale kleurstoffen, worden gebruikt in colocalisatiestudies om de ontsnapping van biologische geneesmiddelen uit de endo-lysosomale routes te visualiseren. Daarnaast moet de meting van de bioactiviteit of de downstream-effecten van het afgeleverde geneesmiddel of biologic altijd de laatste stap zijn.Ten slotte dient u er altijd op te letten dat biologisch gevaarlijk afval op de juiste wijze wordt behandeld en afgevoerd, zoals gedefinieerd door uw eigen instelling. Hiermee is onze video ten einde. Veel succes met uw experimenten.

ex-vivo-red-blood-cell-hemolysis-assay-for-evaluation-ph-responsive

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video describes an in vitro assay to determine calcium-ionophore-induced hemolysis or lysis of red blood cells in a human sample. The assay measures the percentage of hemolysis by quantifying hemoglobin released from ruptured erythrocytes.

Hemolysis Assay: An In Vitro Method to Measure Calcium Ionophore-Induced Lysis in Human Erythrocytes

In this video, we demonstrate the Annexin V binding assay to measure the degree of eryptosis, erythrocyte programmed cell death, using fluorescent Annexin V staining. Apoptotic erythrocytes demonstrate phosphatidylserine translocation from the inner to the outer leaflet of the cell membrane, causing the fluorophore-tagged Annexin V to bind to the translocated phosphatidylserine, thereby emitting a fluorescent signal.

Annexin V Binding Assay: A Fluorescence-Based Technique to Identify Apoptotic Erythrocytes via Phosphatidylserine Labeling

This video demonstrates an assay to study the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells. The cells are exposed to a bacterial pore-forming toxin, which forms pores in the cell membrane. In the presence of extracellular calcium ions, the pore causes calcium influx, inducing membrane-resealing events. The resealing efficiency is assessed using DNA-binding propidium iodide dye, which only enters cells without a resealed membrane.

An In Vitro Fluorescence-Based Assay to Measure Plasma Membrane Resealing Efficiency

De volbloed cytotoxiciteit assay (WCA) is een cytotoxiciteit assay ontwikkeld door het opnemen van high-throughput cell technologie voor plaatsbepaling met fluorescentie microscopie en geautomatiseerde beeldverwerking. Hier beschrijven we hoe lymfoomcellen behandeld met een anti-CD20 antilichaam kan worden geanalyseerd real-time in humaan volbloed kwantitatieve cellulaire cytotoxiciteit analyse.

Real-time cytotoxiciteitsassays in humaan volbloed

Om kankermedicijnen met hoge specificiteit en verminderde bijwerkingen naar tumorlocaties te brengen, zijn nieuwe methoden op basis van nanodeeltjes vereist. Hier beschrijven we disulfide-gekruiste micellen die gemakkelijk kunnen worden bereid door waterstofperoxide-gemedieerde oxidatie en die zich efficiënt kunnen dissociëren in een reducerende tumoromgeving om ladingen vrij te geven.

Een Facile en efficiënte aanpak voor de productie van omkeerbare Disulfide Cross-linked micellen

Er werd een doorvoer, real-time test ontwikkeld om gelijktijdig (1) eukaryotische cel-penetrante antibiotica te identificeren die zich richten op een intracellulair bacterieel pathogeen, en (2) de cytotoxiciteit van eukaryotische cellen te beoordelen. Een variatie op dezelfde technologie werd vervolgens gecombineerd met digitale doseertechnologie om gemakkelijke, hoge resolutie, dosis-respons en twee- en driedimensionale synergiestudies mogelijk te maken.

High Throughput, real-time, Dual-uitlezing Het testen van intracellulaire antimicrobiële activiteit en eukaryote cel cytotoxiciteit

Endotheelcellen mitochondriën zijn van cruciaal belang voor de bloed-hersen-barrière integriteit te behouden. We introduceren een protocol om bio-energetische functie meten cerebrale vasculaire endotheliale cellen.

Evaluatie van de Bio-energetische Function in Cerebral vasculaire endotheelcellen

In dit artikel wordt een microscopie-werkstroom voor hoge inhoud voor gelijktijdige kwantificering van intracellulaire ROS-niveaus aangeboden, evenals mitochondriale membraanpotentiaal en morfologie - gezamenlijk aangeduid als mitochondriale morfofunctie - in levend aanhechtende cellen met behulp van de celdoorlatende fluorescerende reportermoleculen 5- (en- 6) -chloormethyl-2 ', 7'-dichloordihydrofluoresceendiacetaat, acetylester (CM-H2 DCFDA) en tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

Cellular Redox Profiling Met High-Content Microscopy

Een protocol voor de inductie van eryptosis, geprogrammeerde celdood in erytrocyten, met behulp van het calcium ionophore, ionomycine, wordt verstrekt. Succesvolle eryptosis wordt geëvalueerd door het monitoren van de lokalisatie fosfatidylserine in de buitenste bijsluiter van het membraan. Factoren die van invloed zijn op het succes van het protocol zijn onderzocht en optimale omstandigheden geboden.

Inductie van Eryptosis in rode bloedcellen met behulp van een calcium-Ionophore

Het protocol beschrijft een snelle, hoge doorvoer, betrouwbare, goedkope en onpartijdige test voor het efficiënt bepalen van cellulaire levensvatbaarheid. Deze test is vooral handig wanneer de mitochondriën van cellen zijn beschadigd, wat interfereert met andere tests. De test maakt gebruik van geautomatiseerd tellen van cellen bevlekt met twee nucleaire kleurstoffen - Hoechst 33342 en propidium jodide.

Een geautomatiseerde differentiële nucleaire kleuringtest voor nauwkeurige bepaling van Mitocan Cytotoxicity

Dit protocol illustreert een in vitro endotheelceltranscytosetest als een model om de permeabiliteit van de binnenste bloed-retinale barrière te evalueren door het vermogen van menselijke retinale microvasculaire endotheelcellen te meten om mierikswortelperoxidase over cellen te transporteren in caveolae-gemedieerde transcellulaire transportprocessen.

Endotheelceltranscytosetest als een in vitro model om de permeabiliteit van de binnenste bloed-retinale barrière te evalueren

Leer een hemolyse-assay voor het evalueren van cytosolische levering van biomacromoleculaire geneesmiddelen met rode bloedcellen als model voor endosomale membranen. Deze methode helpt onderzoekers om drug delivery-systemen te screenen.

Ex Vivo Red Blood Cell Hemolyse Assay voor de beoordeling van de pH-responsieve Endosomolytic Agenten voor Cytosolic Levering van Biomacromoleculaire Drugs (Video) | JoVE Journal

Ex Vivo Red Blood Cell Hemolyse Assay voor de beoordeling van de pH-responsieve Endosomolytic Agenten voor Cytosolic Levering van Biomacromoleculaire Drugs

Meer video's verkennen