Name: Stereotactische injectie van MicroRNA expressie Lentivirussen om de muis Hippocampus CA1 regio en Evaluatie van de Behavioral Outcome (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Leer stereotactische injectie van microRNA-expressie lentivirussen in de hippocampus CA1-regio van muizen. Deze methode maakt gerichte genoverexpressie mogelijk voor het bestuderen van cognitieve effecten en gedragsuitkomsten in neurowetenschappelijk onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door de Edmond en Lily Safra Center for Brain Sciences (SB fellowship), The Legacy Heritage Biomedical Science Partnership Program van de Israel Science Foundation (Grant No 378/11, naar HS) en de Duitse Israëlische Stichting Wetenschappelijk Onderzoek en ontwikkeling (GIF) (Grant No 1093-32.2/2010, naar HS).

1. Lentivirus Voorbereiding <ol><li> Grow HEK-293FT cellen tot 90% confluentie. </li><li> Op de dag van transfectie verandering celmedium aan serum-vrij DMEM aangevuld met 1 mM glutamine en 50 mg / ml penicilline-streptomycine. </li><li> Co-transfecteren van de cellen met een pLKO.1-Puro vector en plasmiden coderend voor de delta R8.2 en VSV-G groepen en miRNA plaats, met 10 ui van 1 mg / ml polyethyleenimine als drager 9. </li><li> Verzamel verpakte lentiviruses bij 24 uur en 48 uur na transfectie, filter door 0,45 urn filter. </li><li> Concentreer de lentivirussen met ultracentrifuge bij 70.000 xg gedurende 2 uur en 15 ° C, hoeveelheid en bewaar bij -70 ° C. </li><li> Maatregel virustiter door het infecteren HEK-293T cellen met serieel verdunde virus preparaten (1-10 -6 ml van vector per putje). De resulterende titer (minimaal 1 x 10 ~ 9 infectieuze deeltjes per ml wordt aanbevolen) geëvalueerd voor expressie van de gene van belang zijn, met behulp van puromycineselectie en door het kwantificeren van GFP uiten van virussen door het tellen van fluorescerende cellen. </li></ol> Voor meer gedetailleerde protocol van lentivirus bereiding zie 10. 2. Voorbereiding Dieren voor Heelkunde <ol><li> Chirurgen gewaad moeten omvatten chirurgische toga, steriele handschoenen, muts en masker. </li><li> Weeg het dier verdoven vervolgens met een IP-injectie van Ketamine mengsel, waarbij het volume evenredig met het gewicht van het dier zoals voor elk geneesmiddel. Voor een Ketamine / Xylazine mengsel wordt een dosisbereik van 80-200 mg / kg ketamine en 7-20 mg / kg xylazine meestal gebruikt voor muizen. </li><li> Wacht totdat het dier volledig verdoofd, controleer dan bij gebrek aan terugtrekking reflex in de achterste ledematen van het dier door de uitbreiding van de ledematen en dan drukken met uw vinger. </li><li> Injecteer het dier subcutaan met Rimadyl, zoals vermeld op de doos, voor pijnbestrijding. Typische dosisbereik voor Rymadil is 5-10 mg. </li><li> Plaats het dier op een verwarmingselement om een ​​constante lichaamstemperatuur te houden en bevochtig de ogen met zalf. </li><li> Scheren het gebied tussen de twee oren met een afkortzaag. </li><li> Ontsmetten van de huid met betadine. </li></ol> 3. Blootstelling van de Skull and Drilling <ol><li> Plaats het dier in de stereotact door aanpassing van de staven in de spleten anterieure oren van het dier. </li><li> Gebruik een scalpel om een ​​anterieure-posterieure incisie van ongeveer 1,5 cm tussen de oren te maken en open houden met chirurgie klemmen (serfines). </li><li> Reinig het oppervlak van de schedel met een wattenstaafje schoon totdat het kruispunt tussen de coronale hechtdraad en sagittale hechtingen, namelijk het bregma en de kruising tussen de coronale en lambdoïde hechtingen, dwz lambda, zijn zichtbaar. </li><li> Richt de tip van de injectiespuit, die de stereotact, de bregma punt bij alle drie assen. Noteer de coördinaten. Dit punt zou worden beschouwd als de nul-point in alle drie assen. </li><li> Til de spuit in de verticale as, zodat een vlakke beweging niet zou krassen op de schedel en beweeg de spuit kop naar de juiste locatie. Hippocampus CA1 injecties nodig de volgende coördinaten ten opzichte van de bregma in mm: -2 op de voorste / achterste as, ± 1.8 aan de laterale / mediale as en -1,5 op de dorsale / ventrale as. </li><li> Laat de punt van de spuit totdat deze tegen de schedel en markeer de plek met een marker. Verwijder de spuit weer om te voorkomen dat steken. </li><li> Boor een ondiep gat, alleen in de schedel bot met een fijne boor. Houdt de boormeester gestage dus het zou niet blijven boren in het zachte weefsel eronder. U kunt dit voorkomen door stil houden enerzijds met de andere en door het boren in korte pulsen. </li></ol> 4. Injectie van de Lentivirus <ol><li> Zuig 0,5 ml van de geconcentreerde oplossing lentivirus. </li><li> Plaats de spuit boven het gat en langzaam lager het verticale stand tot het reaches het oppervlak van de schedel. Doorgaan met de spuit laten zakken in de hersenen heel langzaam. Bij deze stap kan enige bloeding voordoen die niet noodzakelijkerwijs hoeft te houden dat mislukt penetratie. Als bloeden optreedt dweilen het met een wattenstaafje. </li><li> Stel de digitale pomp tot 0,02 ml / min (0,5 pl worden geïnjecteerd in 25 min) en infuus starten. Langzame infusie maakt effectieve verspreiding van het virus in het weefsel en verhindert terugstroming. Bij sommige soorten spuit overwegen het plaatsen van de spuit voor een extra diepte van 0,5 mm, voordat u aan originele coördinaten en infusie. </li><li> Na infusie voltooid wachten extra 5 minuten om het materiaal te verspreiden in de hersenen plaats terugtrekkende terug in het kanaal gevormd door de spuit. </li><li> Verwijder de spuit heel langzaam en kijk voor terug stromen. Als een terugstroming wordt waargenomen bij deze stap, werd een fractie van de geïnjecteerde materiaal waarschijnlijk verloren. </li></ol> 5. Wond Afdichting en herstel <ol><li> Afdichting the wond met Histoacryl. Zorg ervoor dat u voorkomen dat lekken van de Histoacryl in de ogen. </li><li> Injecteer het dier intraperitoneaal (IP) met 1 ml voorverwarmd zoutoplossing, om uitdroging te voorkomen. </li><li> Plaats het dier in een herstelkooi die is geplaatst op een verwarmd kussen. Kijken naar het dier, terwijl het herstelt nog een uur. </li></ol> In het geval van gewichtsverlies, gebrek aan eetlust, moet zwakte / onvermogen om voer of water, stervende toestand of infectie, euthanasie van het dier te verkrijgen worden uitgevoerd. Aanvaardbare methoden voor euthanasie van knaagdieren zijn barbituraten, inhalatie anesthetica, CO 2, CO, of kaliumchloride in combinatie met algehele anesthesie. Na 4 tot 6 weken, beoordeelt navigatie geheugen van het dier wordt beoordeeld in de Morris Water Maze. De lentivirus meestal infecteren meeste cellen in de injectie bol. 6. Behavioral Assessment in de Morris Water Maze <ol><li> Train de dieren in de Mlis Water Maze. Voor exacte opleidingen en testprotocol zie 11. Na elke proef, droogt het dier met een droge handdoek, te vervangen in zijn kooi en verversen van het water in de tank. </li><li> Test de dieren in de Morris Water Maze gedurende 3 opeenvolgende dagen, 4 tests per dag. Elke dag plaatst u het dier in de doolhof in elk van de 4 richtingen van het doolhof (noord, zuid, oost en west) in een veranderende volgorde, bijvoorbeeld een dag: oost-west-noord-zuid, dag twee: west-zuid -Noord-Oost. Veeg de dieren na elke proef. </li><li> Tijdens de proef studies volgen het dier met een volgsysteem zoals Noldus volgsysteem. </li><li> Na de 12 e proefproces, plaatst u het dier in het waterreservoir zonder het platform voor een minuut. Dit wordt gebruikt om het zoeken strategie het dier neemt analyseren. </li><li> Analyseer de gegevens zoals voorgesteld in 12. </li></ol>

<ol><li>Siegel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+screen+implicates+microRNA-138-dependent+regulation+of+the+depalmitoylation+enzyme+APT1+in+dendritic+spine+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A functional screen implicates microRNA-138-dependent regulation of the depalmitoylation enzyme APT1 in dendritic spine morphogenesis.</a> Nature Cell Biology. 11, 705-716 (2009).</li>
<li>Jin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+genetic+interaction+between+the+fragile+X+mental+retardation+protein+and+the+microRNA+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway.</a> Nature Neuroscience. 7, 113-117 (2004).</li>
<li>Simon, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA+miR-1+regulates+a+MEF-2-dependent+retrograde+signal+at+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The microRNA miR-1 regulates a MEF-2-dependent retrograde signal at neuromuscular junctions.</a> Cell. 133, 903-915 (2008).</li>
<li>Consiglio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+therapy+of+metachromatic+leukodystrophy+by+lentiviral+vectors%3A+correction+of+neuropathology+and+protection+against+learning+impairments+in+affected+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vectors: correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice.</a> Nature Medicine. 7, 310-316 (2001).</li>
<li>Jakobsson, J., Lundberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+for+use+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%3A+The+Journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors for use in the central nervous system.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13, 484-493 (2006).</li>
<li>Berson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic-associated+loss+of+hnRNP-A%2FB+in+Alzheimer%27s+disease+impairs+cortical+splicing+and+cognitive+function+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cholinergic-associated loss of hnRNP-A/B in Alzheimer's disease impairs cortical splicing and cognitive function in mice.</a> EMBO Molecular Medicine. , (2012).</li>
<li>Haramati, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+as+repressors+of+stress-induced+anxiety%3A+the+case+of+amygdalar+miR-34%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">MicroRNA as repressors of stress-induced anxiety: the case of amygdalar miR-34.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14191-14203 (2011).</li>
<li>Shaltiel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+microRNA-132+mediates+stress-inducible+cognitive+deficits+through+its+acetylcholinesterase+target%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+%26+Function%22%5BJournal%5D)">Hippocampal microRNA-132 mediates stress-inducible cognitive deficits through its acetylcholinesterase target.</a> Brain Structure & Function. , 10-1007 (2012).</li>
<li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo%3A+polyethylenimine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7297-7301 (1995).</li>
<li>Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Packaging+HIV-+or+FIV-based+lentivector+expression+constructs+%26+transduction+of+VSV-G+pseudotyped+viral+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs & transduction of VSV-G pseudotyped viral particles.</a> J. Vis. Exp. (62), e3171(2012).</li>
<li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morris+Water+Maze+Experiment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Morris Water Maze Experiment.</a> J. Vis. Exp. (19), e897(2008).</li>
<li>Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morris+water+maze+test+for+learning+and+memory+deficits+in+Alzheimer%27s+disease+model+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer's disease model mice.</a> J. Vis. Exp. (53), e2920(2011).</li>
<li>Regev, L., Ezrielev, E., Gershon, E., Gil, S., Chen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+approach+for+intracerebroventricular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genetic approach for intracerebroventricular delivery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 4424-4429 (2010).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Stereotactische injectie van een lentivirus is een relatief snelle methode voor in vivo evaluatie voor zowel up-of down-regulatie van verschillende genen en miRNAs. Het belangrijkste alternatief is een genetisch gemanipuleerde muis wat een veel meer arbeidsintensief en tijdrovend techniek dan direct lentivirus injectie. Bovendien, de omhoog regulering, in lentivirus injectie plaats op een bepaald tijdstip in de volwassen muis en de mogelijkheid van lekkage omvat niet tijdens de ontwikkeling, zoals meestal het g...

De rol van bepaalde miRNA&#39;s in het zenuwstelsel functioneren is onlangs uitgedaagd door lentivirale injectie in verschillende studies. MiRNAs zijn gevonden van cruciaal belang voor het behoud en het opnieuw vormgeven synaps structuur 1, synaptogenese 2 en synaps verbouwing en onderhoud 3 te zijn. Deze studies suggereren sterk dat miRNAs betrokken zijn, via multileveled regulerende effecten in zowel de vormgeving en het behoud van de hoofduitgang van het zenuwstelsel, cognitieve functie. Stereotactische injectie van lentivirus deeltjes in specifieke regio&#39;s in de knaagdieren hersenen in staat stelt te zoeken naar veranderingen in de synaps morfologie en neuronale activiteit, en werd gebruikt voor het vaststellen van de functionele betekenis van overexpressie gebrachte transcripten 4,5. Directe infectie van neuronen bij welbepaalde hersengebieden met miRNA-expressie lentiviruses kunnen worden betrokken bij studies van veroudering, hersenaandoeningen en neurodegeneratie; Studies van miRNAs in het gebied van 6-8 gedragregulatie zijn dan veel minder gevorderd stadium en stereotactische injectie van miRNA-expressie lentivirus deeltjes gevolgd door gedragstesten kunnen nuttig zijn voor deze doeleinden. Een aanzienlijk meer bewerkelijke methode voor het induceren van over-of onder-expressie impliceert genetisch gemanipuleerde knock-in of knock-out muizen. Genetische systemen kan verder zorgen voor voorwaardelijke en temporele controle van expressie (bijv. Cre-Lox, Tet systemen), maar deze hebben nauwelijks ruimtelijke specificiteit van de injectieprocedure en er is bijna altijd een zekere mate van lekkage. Ook moet je de technische procedures niet operatie nodig en kan over laboratoria met een relatief goede reproduceerbaarheid worden gebruikt, maar ze zijn langzamer en vereisen veel meer mankracht en financiële middelen. Bovendien, de temporele controle van de over-of onder-expressie in muizen geïnjecteerd veel nauwkeuriger vergelijking met genetisch gemanipuleerde muizen.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Rodent weigh scale</td><td>Burtons (UK)</td><td>115-455</td><td></td></tr><tr><td>heating pad</td><td>FIRstTechnology</td><td>DCT-25</td><td></td></tr><tr><td>trimming machine</td><td>Stoelting</td><td>51465</td><td></td></tr><tr><td>stereotact</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel and blades</td><td>Kent scientific</td><td>INS500348</td><td></td></tr><tr><td>Harland syringe</td><td>Hamilton</td><td>7632-01</td><td></td></tr><tr><td>driller</td><td>Stoelting</td><td>51449</td><td></td></tr><tr><td>digital pump</td><td>Harvard apparatus</td><td>704507</td><td></td></tr><tr><td>Water tank and platform</td><td>Stoelting</td><td>60135</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>ketamine </td><td>Vetoquinol(Lure France)</td><td>3055503</td><td></td></tr><tr><td>domitor</td><td>Orion pharma</td><td>107140-10</td><td></td></tr><tr><td>Rimadyl</td><td>Pfizer animal health</td><td>24751</td><td></td></tr><tr><td>moisture ointment - Synthomycine 5%</td><td>Rekah Pharmaceutical</td><td>195</td><td> </td></tr><tr><td>histoacryl</td><td>Braun</td><td>112101</td><td></td></tr><tr><td>saline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr></tbody></table>

stereotactische injectie van microrna expressie lentivirussen om de muis hippocampus ca1 regio en evaluatie van de behavioral outcome

Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

MicroRNAs (miRNAs) zijn kleine reglementaire enkelstrengs RNA-moleculen ongeveer 22 nucleotiden lang, dat kan elke doelgroep talrijke mRNA-transcripten en dim een ​​hele genexpressie traject door het induceren van vernietiging en / of het remmen van vertaling van deze doelstellingen. Verschillende miRNAs een belangrijke rol spelen bij het handhaven van neuronale structuur en functie en in hogere hersenfuncties, en methoden worden gezocht voor het manipuleren van hun niveaus voor het verkennen van deze functies. Hier presenteren we een directe in-vivo methode voor de behandeling van de cognitieve gevolgen van gedwongen miRNAs overtollige bij muizen door stereotactische injectie van miRNA-codering virusdeeltjes. In het bijzonder, het huidige protocol omvat injectie in de hippocampus CA1 regio, wat bijdraagt ​​aan zoogdieren geheugen consolidatie, leren, en stressrespons, en biedt een handige injectieplaats. De coördinaten worden gemeten volgens de muis bregma en virus perfusie digitaal gestuurd en zeer traag gehouden.Na injectie, wordt de operatie wond verzegeld en de dieren herstellen. Lentiviruses coderen geluiddempers van de overeenkomstige mRNA doelen dienen om de specifieke miRNA / target interactie verantwoordelijk zijn voor het waargenomen effect impliceren, met naïeve muizen, muizen geïnjecteerd met een zoutoplossing en muizen geïnjecteerd met &quot;lege&quot; lentivirus vectoren als controles. Een maand na de injectie worden de dieren onderzocht in het Morris Water Maze (MWM) voor het beoordelen van hun navigatie leren en geheugen capaciteiten. De MWM is een ronde tank gevuld met gekleurd water met een klein platform ondergedompeld 1 cm onder het wateroppervlak. Gestage visuele aanwijzingen rond de tank zorgen voor ruimtelijke navigatie (geluid en magnetische veld van de aarde kan ook de dieren te helpen navigeren). Videocamera controle maakt het meten van de route van zwemmen en de tijd te vinden en bedraagt ​​het platform. De muis wordt eerst geleerd dat het monteren van de verborgen platform biedt een ontsnapping aan de gedwongen zwemmen, het wordt dan getest voor het gebruik van deze ontsnapping en fenslotte, wordt het platform verwijderd en probetesten onderzoeken of de muis onthoudt de vorige locatie. Herhaalde tests een aantal dagen achtereen markeren verbeterde prestaties van de geteste muizen op kortere wachttijden te vinden en monteren van het platform, en als meer directe routes naar het platform of de locatie te bereiken. Bij no-show dergelijke verbetering vertegenwoordigt slechtzienden leren en geheugen en / of angst, die dan specifiek kan worden getest (bv. in de verhoogde plus maze). Deze aanpak maakt validatie van specifieke miRNAs en target transcripten in de bestudeerde cognitieve en / of stress-gerelateerde processen.

Injectie van 0,5 ul lentivirus in het CA1 gebied in de muis hippocampus, de stroomsnelheid die in de paragraaf protocol levert een geïnfecteerde gebied van ongeveer 1 mm in de rostrale-caudale as en ongeveer 0,5 mm in de mediale-laterale en anterieure -posterieure as (figuur 3). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/50170/50170fig1.jpg" /> Figuur 1. Bregma point en injectie-inrichting. (A) Afgebeeld is een sche...

MicroRNA een belangrijke rol spelen in hersenstructuur en functie. Hier beschrijven we een methode om hippocampus miRNA dwingen over-expressie met behulp van stereotactische injectie van een aangelegde miRNA-expressie lentivirus. Deze benadering kan dienen als een relatief snelle manier om te beoordelen<em&gt; In vivo</em&gt; Effecten van over-expressie miRNA&#39;s in specifieke hersengebieden.

Stereotactische injectie van MicroRNA expressie Lentivirussen om de muis Hippocampus CA1 regio en Evaluatie van de Behavioral Outcome

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de neurologische en cognitieve effecten van micro RNA-overexpressie bij muizen te beoordelen. Dit wordt bereikt door in een tweede stap lentivirus te prepareren dat micro RNA tot expressie brengt. Het lentivirus wordt geïnjecteerd in een specifiek hersengebied, waardoor het micro RNA tot overexpressie kan komen en regulatie kan uitoefenen op de doelwitmoleculen.Er zijn resultaten verkregen die cognitieve effecten aantonen van micro RNA-overexpressie als gevolg van de anatomisch gerichte aflevering van het lentivirus in de muizenhersenen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals genetische modificatie, is dat genetische modificatie een veel arbeidsintensievere en tijdrovendere techniek is dan directe lentivirusinjectie. Bovendien maakt lentivirusinjectie volledige ruimtelijke en temporele controle en follow-up mogelijk van het molecuul dat tot overexpressie wordt gebracht.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van neuromirrors, zoals wat het effect zou zijn van een overexpressie of underexpressie van een specifieke mirror op het leren en het geheugen, beoordeeld via gedragstests. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van neurodegeneratieve ziekten, aangezien microRNA's geschikt zijn voor therapeutische interventies. Incubeer de uitgeplaatte packaging-cellen tot ze 90% confluentie bereiken, transfecteer ze vervolgens en vervang hun medium door serumvrij DMEM aangevuld met 1 mM glutamine en 50 mg/mL.Voeg penicilline-streptomycine toe en cotransfecteer de cellen vervolgens met A-P-L-K-O 0.1 pur vectorplasmid dat codeert voor de delta R 8.2 en VSVG-componenten en een plasmid met het micro-RNA van belang. Gebruik 10 µL van 1 mg/mL polyethyleen als drager gedurende 24 uur en 48 uur. Verzamel na transfectie de gepackagde lentivirussen en filtreer deze door een 0,45 µm filter.Concentreer het filtraat met lentivirussen via ultracentrifugatie bij 15 °C en 70.000 G gedurende twee uur. Verwijder het supernatant en suspendeer het lentivirus in net zoveel gedeïoniseerd gedestilleerd water als nodig is om het pellet volledig op te lossen, zodat er geen zichtbare klonten meer zijn. Maak vervolgens aliquoten van het concentraat om deze bij -70 °C te bewaren.Meet vervolgens de virusiter door verpakkingscellen te infecteren met serieel verdund virus. Gebruik hiervoor een 12-well plaat met een volume van 1 ml vector tot 1 µL vector per well. De resulterende titer moet ten minste 1 miljard infectieuze deeltjes per milliliter bedragen.Weeg het dier en anesthetiseer het met een IP-injectie van een ketamine-mengsel. Gebruik het volume dat proportioneel is aan het gewicht van het dier, zoals gespecificeerd voor elk middel. Wacht tot het dier volledig is geanestheseerd.Controleer vervolgens op de afwezigheid van de terugtrekreflex in de achterpoot wanneer er geen reflex optreedt. Injecteer het dier subcutaan met het pijnstille middel IL zoals gespecificeerd op de verpakking. Plaats het dier onder een warmtelamp of op een warmtemat en bevochtig de ogen met zalf.Scheer tot slot het gebied tussen de twee oren met een trimmachine en desinfecteer de huid met 70% ethanol. Plaats het dier in de stereo T en pas de staven aan in de spleten, net binnenwaarts van de oren van het dier. Maak vervolgens met een scalpel een anterieur-posterieure incisie van ongeveer 1,5 centimeter tussen de oren en houd de incisie open met chirurgische klemmen.Reinig vervolgens het oppervlak van de schedel met een wattenstaafje totdat de kruising tussen de coronale naad en de sagittale naden zichtbaar is. Dit omvat de bgma en de kruising tussen de coronale en lambdoïde naden of de lambda. Positioneer nu de punt van de spuit, die in het stereotaxieframe is geplaatst, langs alle drie de assen precies op de coördinaten van het bgma-punt.Dit zijn de nulpunten. Til vervolgens de spuit op langs de verticale as, zodat een vlakke beweging de schedel niet zou beschadigen vanaf de bgma. Verplaats de spuit naar de vereiste locatie voor hippocampale ca één, bijvoorbeeld twee millimeter naar beneden in de AP-as, 1,8 millimeter omhoog en omlaag in de LM-as en 1,5 millimeter naar beneden in de DV-as.Laat vervolgens de punt van de spuit zakken tot deze de schedel raakt. Markeer de plek en trek de spuit daarna terug om ruimte te maken voor de boor op die plek. Maak met een fijne boor een ondiep gat in het schedelbot.Houd de boor stabiel en boor niet in het zachte weefsel. Tijdens het boren kan het helpen om in korte pulsen te boren. Zorg ervoor dat u met de ene hand de andere hand ondersteunt, zodat het boren door het bot niet dieper in het zachte weefsel doordringt.Trek een halve milliliter van de geconcentreerde lentivirusoplossing op in de spuit. Plaats de spuit boven het gat en laat deze langzaam verticaal zakken tot het oppervlak van de schedel is bereikt. Laat de spuit vervolgens zeer langzaam verder in de hersenen zakken.Stel de digitale pomp in op 0,02 milliliters per minuut om het volume langzaam in 25 minuten te injecteren. Dit voorkomt terugstroom en garandeert een succesvolle verspreiding. Start de infusie bij bepaalde typen spuiten.Overweeg om de spuit een extra halve millimeter in te brengen voordat u terugkeert naar de oorspronkelijke coördinaten en begint met de infusie terwijl de stof wordt toegediend. Bevochtig het blootgestelde gebied met PBS om dehydratie van het weefsel te voorkomen. Wanneer dit is voltooid, wacht u vijf minuten voordat u de spuit terugtrekt.Dit zorgt ervoor dat het materiaal zich in de hersenen verspreidt in plaats van terug te vloeien langs het traject van de spuit. Verwijder vervolgens de spuit zeer langzaam en let op terugstroom. Als er terugstroom wordt waargenomen, is er waarschijnlijk een fractie van het geïnjecteerde materiaal verloren gegaan.Sluit de wond af met histo acron en zorg ervoor dat er geen histo acron in de ogen van het dier lekt. Injecteer vervolgens één milliliter verwarmde zoutoplossing intraperitoneaal om uitdroging van het dier te voorkomen. Plaats het dier in een herstelkooi op een warmtemat.Houd het dier een uur lang in de gaten terwijl het herstelt. Beoordeel na vier tot zes weken het navigatiegeheugen van het dier, zoals in de Morris water maze. Het lentivirus zal de meeste van de doelcellen hebben geïnfecteerd. Tegen deze tijd is een injectie van 0.5 µL lentivirus in de ca.Eén regio van een muizenhippocampus werd geprepareerd zoals beschreven in het protocol. Het dier werd vervolgens geofferd en coupes van het brein met een dikte van 40 micron werden geanalyseerd. Voor de GFP-expressie is de DAPI-kleuring in het rood zichtbaar.Samenvattend resulteerde dit in een geïnfecteerde sfeer van ongeveer één millimeter op de rostrale caudale as en ongeveer 0,5 millimeter op de mediaal-laterale en anterieur-posterieure AE's. Muizen die waren geïnjecteerd met een micro-RNA-coderende lente-vector werden vergeleken met controles in het Morris water maze. Na drie dagen training was het traject van een representatieve controlemuis naar het ondergedompelde platform, weergegeven in het groen, veel korter dan dat van een experimenteel dier in het rood.Over het algemeen hadden de experimentele dieren meer moeite om de taak aan te leren dan de controlegroep. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in ongeveer 40 minuten per muis worden uitgevoerd, waarbij de stroomsnelheid de enige beperkende factor is na het volgen van deze procedure.Andere methoden, zoals systematische injectie van oligonucleotiden, kunnen worden uitgevoerd om vragen te beantwoorden zoals in welke mate deze procedure de communicatie tussen de hersenen en het lichaam verandert. Vergeet niet dat het werken met lentivirussen uiterst gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals een wegwerpbare Tyvec-labjas en neutrale handschoenen, moeten worden genomen. Daarnaast moet glaswerk en plasticware dat vloeibaar afval bevat, worden gedecontamineerd vóór verwijdering in een biohazard-zak.

stereotactic-injection-microrna-expressing-lentiviruses-to-mouse

Research

JoVE Journal

Behavior

Gedrag

This video demonstrates microRNA-mediated inhibition of excitatory synaptic currents in mouse hippocampal brain slices. The CA3 neurons were infected with a recombinant viral vector harboring a construct for expressing a fluorescent reporter, a light-activated membrane channel, and a microRNA that downregulates the expression of voltage-gated calcium channels. Upon placing a slice in a recording chamber and patching a CA1 neuron with a recording pipette, light pulses were used to stimulate the...

MicroRNA-Mediated Inhibition of Excitatory Postsynaptic Currents in Mouse Hippocampal Slices

Source: Chen, S., et al., Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the stereotaxic injection of a viral vector encoding Cre recombinase and green fluorescence protein or GFP into the striatum of a genetically modified mouse pup to achieve gene manipulation by excising a loxP-flanked STOP cassette, activating red fluorescence protein or RFP as a reporter.

Stereotactic Microinjection of a Viral Vector for Gene Manipulation in a Mouse Pup Striatum

Source: Pereira, M. et. al., In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates stereotaxic injection of an adeno-associated virus into the cerebral cortex of a transgenic mouse to deliver Cre-dependent neuronal reprogramming and fluorescent reporter genes into glial cells.

Stereotaxic Injection of Viral Vectors for Glial Cell Reprogramming in a Mouse Model

Source: Fricano-Kugler, C. J., et al. Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates stereotaxic viral injection for precise neuronal gene editing in the mouse brain. The protocol ensures accurate virus delivery to the dentate gyrus, enabling fluorescent labeling and CRISPR-mediated gene knockout to study neural circuits, gene function, and disease mechanisms in vivo.

Stereotaxic Viral Injection for Targeted Neuronal Gene Editing in the Mouse Brain

In dit artikel wordt beschreven hoe u virale vectoren microinject in de hersenen van muizen en vervolgens te testen in een geconditioneerde voorkeur paradigma plaats die een overname, uitsterven en herstel fase omvat.

Stereotactische Micro-injectie van virale vectoren uitdrukken Cre Recombinase om de rol van Target Genen in Cocaine Geconditioneerd Place Voorkeur Studie

Stereotactische injectie van lentivirussen uiten cDNAs of shRNAs kan genexpressie moduleren in specifieke hersengebieden van muizen. Hier presenteren we een protocol om stereotactische injecties te combineren met gedragsproblemen taken, zoals het open veld Test (OFT) en de Gedwongen Swim Test (FST).

Het toepassen van stereotactische injectie techniek om genetische effecten op Animal Gedrag Studie

Hier presenteren we een protocol voor directe stereotactische herseninfusie van amyloid-beta. Deze methodologie biedt een alternatief in vivo muismodel om de kortetermijneffecten van amyloid-beta op hersenneuronen aan te pakken.

Stereotaxische Infusion van Oligomere amyloid-beta in de Mouse Hippocampus

MicroRNA's spelen een cruciale rol in de hersenen en zijn potentiële doelen voor het modelleren van neurodegeneratie. Het verstoren van miRNA-niveaus is echter een uitdaging vanwege de korte lengte van miRNA en de ontoegankelijkheid van hersenweefsel. Deze video presenteert een methode voor het ontwerpen van antagomir en specifieke levering aan de hersenen met behulp van een neuropeptide bij muizen.

Een eenvoudig alternatief voor stereotactische Injectie voor Brain Specifieke Knockdown van miRNA

De CRISPR / Cas9 systeem biedt de mogelijkheid om gerichte genoom bewerken toegankelijk en betaalbaar voor de wetenschappelijke gemeenschap. Dit protocol is bedoeld om te demonstreren hoe virussen die een gen van belang met behulp van de CRISPR / Cas9 systeem zal knock-out, en dan injecteren ze stereotaxically in de volwassen hersenen van muizen te creëren.

Ontwerpen, Verpakkingen en Levering van hoge titer CRISPR Retro en Lentivirussen via Stereotaxische Injection

Het doel van dit protocol is om een aanpak te beschrijven voor het analyseren van gedrag van volwassen neurale stam/voorlopercellen in reactie op chemogenetische manipulatie van een specifiek lokaal neuraal circuit.

Asgezegde circuit specifieke regulering van volwassen Hippocampal neurale precursor cellen

Dit artikel demonstreert de voorbereiding van een op maat gemaakt beeldvormingsvenster aangevuld met infusiekanule en de implantatie ervan op het CA1-gebied van de hippocampus bij muizen.

Craniotomie procedure voor het visualiseren van neuronale activiteiten in Hippocampus van zich gedragende muizen

Leer stereotactische injectie van microRNA-expressie lentivirussen in de hippocampus CA1-regio van muizen. Deze methode maakt gerichte genoverexpressie mogelijk voor het bestuderen van cognitieve effecten en gedragsuitkomsten in neurowetenschappelijk onderzoek.

Stereotactische injectie van MicroRNA expressie Lentivirussen om de muis Hippocampus CA1 regio en Evaluatie van de Behavioral Outcome (Video) | JoVE Journal

Stereotactische injectie van MicroRNA expressie Lentivirussen om de muis Hippocampus CA1 regio en Evaluatie van de Behavioral Outcome

Meer video's verkennen