Name: Een orthotope Blaaskanker Model voor Gene Delivery Studies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-01T22:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Leer een orthotopisch blaaskankermodel met MB49-celimplantatie en adenovirale gentherapie bij muizen. Deze methode maakt evaluatie van genexpressie en nieuwe behandelingen voor blaaskanker mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NIH R21 CA143505 om Christina Voelkel-Johnson.

Alle procedures waarbij dieren zijn beoordeeld en goedgekeurd door het Comite Institutional Animal Care en gebruik bij de Medische Universiteit van South Carolina. Het protocol werd goedgekeurd onder USDA categorie D voor pijn. 1. Celimplantatie <ol><li> Twee dagen voor het uitvoeren van de procedure, plaat 1 x 10 6 MB49 cellen in T-25 kolven. Met hoog-glucose DMEM aangevuld met 10% FBS (en antibiotica, indien gewenst). Een fles is voldoende voor elke groep van vijf muizen die worden verdoofd en geïmplanteerd in parallel. </li><li> Op de dag van de procedure, voor te bereiden trypsine voor instillatie door verdunning steriele 0,25% weefselkweek trypsine tot 0,125% met steriel DMEM base medium (1:02 verdunning). 1,2 ml is voldoende voor 10 muizen. Plaats in een 37 ° C waterbad in evenwicht te komen. </li><li> Voorverwarmen een verwarmingselement en leg hem onder de nosecones van de anesthesie systeem dat zal worden gebruikt om i te leverensoflurane. Plaats een schone absorberende pad over de verwarming pad. </li><li> Plaats muizen in de inductie kamer van de anesthesie-systeem en veroorzaken anesthesie met 3% isofluraan. Bij muizen bewustzijn, dat wordt gecontroleerd door het verlies van de teen-snuifje reflex hebben verloren, overbrengen naar de nosecones. Zorg ervoor dat elk dier is in een liggende positie en goed geplaatst op de verwarming pad om de lichaamstemperatuur te handhaven. </li><li> Verminder de isofluraan concentratie van 2% tot anesthesie te handhaven. </li><li> Solliciteer oogzalf in beide ogen om uitdroging te voorkomen. </li><li> Optionele stap: Verwijder abdominale haar. Haar op de onderbuik moet worden verwijderd als bioluminescentie beeldvorming zullen worden uitgevoerd. <ol><li> Breng een royale laag van ontharingscrème, zoals Veet, tot het laagste 1 op plein van bont op de buik, zorg ervoor dat u contact opnemen met de uitwendige geslachtsorganen. 3 min. wachten. </li><li> Haar te verwijderen door wrijven het gebied met een droge spons, en dan met een vochtige spons om de huid te reinigen. Eenmaal herhalen, indien nodig. </li></ol></li><li> Katheteriseren van de blaas <ol><li> Smeer een nieuwe, steriele 24 G pediatrische veneuze katheter met een niet-irriterende smerende gel zoals KY. Verwijder de naald en gooi deze weg. Indien lekken van vloeistof rond de katheter is een veel voorkomend probleem, namelijk. Het komt vaker voor dan in een van de tien muizen, grotere binnendiameter katheters (20 G) worden gebruikt. Dit kan een belangrijke overweging zijn bij muizen ouder dan 8 weken. </li><li> Houd de naaf van de katheter, gebruikt u de duim en wijsvinger van je andere hand aan de achterpoten van de muis te verspreiden en het urinekanaal bloot. Duw de katheter in de plasbuis bij een hoek van 45 °, het veranderen van de hoek om een ​​parallel met de bank om het volledig in te brengen. </li><li> Na volledige inbrenging, til de katheter voorzichtig hem parallel aan de bank en visueel bevestigen dat deze zich in de urethra en niet de vagina, hetgeen eronder. Indien juist geplaatst, zal de katheter kan in zijnvolledig ingestoken aangezien de vagina korter is dan de urethra. </li><li> Verminder de isofluraan concentratie tot 1%. </li></ol></li><li> Bevestig Tip een P200 pipet en verwijder urine uit de blaas door te zuigen aan het externe uiteinde van de katheter. Verwijder alle resterende urine van de naaf van de katheter. Gooi urine en catheter laten zitten. </li><li> Pipet voorzichtig 80 ul 0,125% trypsine-oplossing in de naaf van de katheter, het vermijden van luchtbellen. Bevestig een 1 ml spuit met lucht gevulde om de katheter hub en langzaam de zuiger 0,1-0,2 ml aan de trypsine te leveren in de blaas. </li><li> Laat de spuit en Kathetersamenstelling plaats gedurende 15 minuten. Herhaal stap 1,8-1,11 voor de resterende verdoofde muizen (tot 4). Ga door naar de volgende stap tijdens de wachttijd. TIP: In eerste instantie kan het nuttig zijn om iemand anders de voorbereiding van de cellen (stap 1.12). </li><li> Bereid MB49 cellen voor implantatie. Cellen werden uitgeplaat bij 1 x 10 6 per T-25 kolf 48 uur vóór implantatie (stap 1.1). <ol><li> Verwijder het medium en voeg 500 ul van 0,25% trypsine aan de kolf. Wanneer cellen los voeg 5 ml compleet DMEM om cellen te resuspenderen. Verwijder een 50 pi aliquot te tellen en centrifugeer de rest bij 1000 rpm gedurende 5 minuten. Tijdens het centrifugeren stap blijven stappen 1.12.2 en 1.12.3. </li><li> Tel de cellen met een hemocytometer. Bereken de cellen / ml. Bereken vervolgens het volume nodig celpellet 4 x 10 6 cellen / ml (2 x 10 5 cellen per 50 pi) brengen. </li><li> Giet supernatant van gecentrifugeerd cellen en resuspendeer de pellet in DMEM base medium met behulp van het volume dat nodig is om cellen te schorten tot 4 x 10 6 cellen / ml (zoals berekend in stap 1.12.2). Laat cellen bij kamertemperatuur. </li></ol></li><li> Toen de 15 min tijdstip voor trypsine behandeling van blazen is bereikt, maak de met lucht gevulde spuit uit de katheter het verlaten van de katheter op zijn plaats. Besteed trypsine zal normaally terugstromen via de katheter. Verwijder alle resterende trypsine vanuit de blaas door zuiging met de P200 pipet zoals in stap 1.9 hierboven en gooi. </li><li> Onmiddellijk pipet 50 pi MB49 celsuspensie in de naaf van de katheter. Bevestig de 1 ml spuit met lucht gevulde de naaf van de katheter en leveren de cellen naar de blaas door langzaam indrukken van de plunjer 0,1-0,2 ml. Herhaal deze stap tot vier keer extra om alle vijf muizen geïmplanteerd. Gooi alle ongebruikte cellen. </li><li> Het verlaten van de katheter-spuitset in de plaats, zodat de cellen te wonen in de blaas voor 50 min. </li><li> Trekken zachtjes de katheter-spuitset uit de plasbuis. Draai de isofluraan concentratie op nul en beweeg elke muis een centimeter of twee verwijderd van de neuskegel te herstellen op de verwarming pad. </li><li> Als een muis haar oprichtende reflex heeft herwonnen, terug in de kooi. </li></ol> 2. Intravesicale Levering van adenovirus (8 dagen na de implantatie van cellen) </p&gt; LET OP: Dit deel van het protocol gebruikt adenovirus, dat is een besmettelijke agent en mag onder strikte richtlijnen BSL2 worden afgehandeld (http://oma.od.nih.gov/manualchapters/intramural/3035/). Alle procedures uitgevoerd met infectieuze agentia werden goedgekeurd door de Institutional bioveiligheid Comite van de Medische Universiteit van Zuid-Carolina. <ol><li> Acht dagen na het implanteren van muizen met MB49 cellen, controleer hematurie. Pick-up individuele dieren op een wit stuk absorberend papier en druk voorzichtig op de buik om druppels urine vlek op het papier. Urine die is roze tot rood geeft hematurie en is een teken dat tumoren hebben vastgesteld. Tumor nemen bedraagt ​​ten minste 80% en met een uitstekende techniek kan oplopen tot 100%. </li><li> Ontdooi adenovirale voorraad op ijs en vul aan tot 10 9 PFU/50 pi (2 x 10 10 PFU / ml) in een steriele, kamertemperatuur PBS. </li><li> Verdoven muizen zoals beschreven in de stappen 1,3-1,6 boven. </li><li> Katheteriseren muizen zoals beschreven in stap 1.8 en verwijder urine als in stap 1.9 </li><li> Nadat urine wordt verwijderd, onmiddellijk pipet 50 ul virussuspensie in de naaf van de katheter. Bevestig de 1 ml spuit met lucht gevulde de naaf van de katheter en leveren het virus aan de blaas door langzaam indrukken van de plunjer 0,1-0,2 ml. </li><li> Het verlaten van de katheter-spuitset in de plaats, zodat het virus te wonen in de blaas voor 40 minuten. </li><li> Trekken zachtjes de katheter-spuitset van de urethra, en gooi die in 10% bleekwater oplossing om de resterende virus te inactiveren. </li><li> Draai de isofluraan concentratie op nul en beweeg elke muis een centimeter of twee verwijderd van de neuskegel te herstellen op de verwarming pad. </li><li> Als een muis haar oprichtende reflex heeft herwonnen, terug in de kooi. </li><li> Mark kooien om die muizen te geven zijn ingeprent met adenovirus. Virus zal worden afgestoten in de kooi beddengoed voor meerdere dagen en alle kooien en beddengoed moetenbehandeld en op de juiste wijze gedesinfecteerd. </li></ol>

<ol><li>Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2012%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer.+J.+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2012.</a> CA Cancer. J. Clin. 62 (1), 10-29 (2012).</li>
<li>Seager, C. M., Puzio-Kuter, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravesical+delivery+of+rapamycin+suppresses+tumorigenesis+in+a+mouse+model+of+progressive+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Prev.+Res%22%5BJournal%5D)">Intravesical delivery of rapamycin suppresses tumorigenesis in a mouse model of progressive bladder cancer.</a> Cancer Prev. Res. 2 (12), 1008-1014 (2009).</li>
<li>Chodak, G. W., Shing, Y., Borge, M., Judge, S. M., Klagsbrun, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+heparin+binding+growth+factor+in+mouse+bladder+tumors+and+urine+from+mice+with+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Presence of heparin binding growth factor in mouse bladder tumors and urine from mice with bladder cancer.</a> Cancer Res. 46 (11), 5507-5510 (1986).</li>
<li>De Boer, E. C., Teppema, J. S., Steerenberg, P. A., De Jong, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrovirus+type+C+in+the+mouse+bladder+carcinoma+cell+line+MBT-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Retrovirus type C in the mouse bladder carcinoma cell line MBT-2.</a> J. Urol. 163 (6), 1999-2001 (2000).</li>
<li>Lodillinsky, C., Rodriguez, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+invasive+orthotopic+bladder+cancer+model+with+high+cathepsin+B+activity+resembling+human+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Novel invasive orthotopic bladder cancer model with high cathepsin B activity resembling human bladder cancer.</a> J. Urol. 182 (2), 749-755 (2009).</li>
<li>Jurczok, A., Fornara, P., Soling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+to+monitor+bladder+cancer+cell+adhesion+in+vivo%3A+a+new+approach+to+optimize+a+syngeneic%2C+orthotopic%2C+murine+bladder+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+Int%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging to monitor bladder cancer cell adhesion in vivo: a new approach to optimize a syngeneic, orthotopic, murine bladder cancer model.</a> BJU Int. 101 (1), 120-124 (2008).</li>
<li>Brocks, C. P., Buttner, H., Bohle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+tumor+implantation+by+intravesical+gemcitabine+in+a+murine+model+of+superficial+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of tumor implantation by intravesical gemcitabine in a murine model of superficial bladder cancer.</a> J. Urol. 174 (3), 1115-1118 (2005).</li>
<li>Wu, Q., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+response+of+orthotopic+bladder+tumors+to+granulocyte+macrophage+colony-stimulating+factor+therapy+using+the+prostate-specific+antigen+gene+as+a+reporter.+Clin%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Monitoring the response of orthotopic bladder tumors to granulocyte macrophage colony-stimulating factor therapy using the prostate-specific antigen gene as a reporter. Clin.</a> Cancer Res. 10 (20), 6977-6984 (2004).</li>
<li>Wu, Q., Mahendran, R., Esuvaranathan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonviral+cytokine+gene+therapy+on+an+orthotopic+bladder+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Nonviral cytokine gene therapy on an orthotopic bladder cancer model.</a> Clin. Cancer Res. 9 (12), 4522-4528 (2003).</li>
<li>Bonfil, R. D., Russo, D. M., Binda, M. M., Delgado, F. M., Vincenti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+antitumor+activity+of+vinflunine+than+vinorelbine+against+an+orthotopic+murine+model+of+transitional+cell+carcinoma+of+the+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Urol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Higher antitumor activity of vinflunine than vinorelbine against an orthotopic murine model of transitional cell carcinoma of the bladder.</a> Urol. Oncol. 7 (4), 159-166 (2002).</li>
<li>Bohle, A., Jurczok, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+bladder+carcinoma+cell+adhesion+by+oligopeptide+combinations+in+vitro+and+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Inhibition of bladder carcinoma cell adhesion by oligopeptide combinations in vitro and in.</a> 167 (1), 357-363 (2002).</li>
<li>Gunther, J. H., Jurczok, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+syngeneic+orthotopic+murine+bladder+cancer+%28MB49%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49).</a> Cancer Res. 59 (12), 2834-2837 (1999).</li>
<li>Gunther, J. H., Frambach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+acetylic+salicylic+acid+and+pentoxifylline+on+the+efficacy+of+intravesical+BCG+therapy+in+orthotopic+murine+bladder+cancer+%28MB49%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Effects of acetylic salicylic acid and pentoxifylline on the efficacy of intravesical BCG therapy in orthotopic murine bladder cancer (MB49).</a> J. Urol. 161 (5), 1702-1706 (1999).</li>
<li>Dobek, G. L., Godbey, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthotopic+model+of+murine+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An orthotopic model of murine bladder cancer.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li>
<li>Tham, S. M., Ng, K. H., Pook, S. H., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+and+microenvironment+modification+during+progression+of+murine+orthotopic+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Dev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tumor and microenvironment modification during progression of murine orthotopic bladder cancer.</a> Clin. Dev. Immunol. 2011, 865684(2011).</li>
<li>Seow, S. W., Cai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactobacillus+rhamnosus+GG+induces+tumor+regression+in+mice+bearing+orthotopic+bladder+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Lactobacillus rhamnosus GG induces tumor regression in mice bearing orthotopic bladder tumors.</a> Cancer Sci. 101 (3), 751-758 (2009).</li>
<li>Mangsbo, S. M., Ninalga, C., Essand, M., Loskog, A., Totterman, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CpG+therapy+is+superior+to+BCG+in+an+orthotopic+bladder+cancer+model+and+generates+CD4%2B+T-cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">CpG therapy is superior to BCG in an orthotopic bladder cancer model and generates CD4+ T-cell immunity.</a> J. Immunother. 31 (1), 34-42 (2008).</li>
<li>Loskog, A. S., Fransson, M. E., Totterman, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AdCD40L+gene+therapy+counteracts+T+regulatory+cells+and+cures+aggressive+tumors+in+an+orthotopic+bladder+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">AdCD40L gene therapy counteracts T regulatory cells and cures aggressive tumors in an orthotopic bladder cancer model.</a> Clin. Cancer Res. 11 (24 Pt 1), 8816-8821 (2005).</li>
<li>Loskog, A., Ninalga, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+MB49+mouse+bladder+cancer+model+for+adenoviral+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Optimization of the MB49 mouse bladder cancer model for adenoviral gene therapy.</a> Lab Anim. 39 (4), 384-393 (2005).</li>
<li>Bockholt, N. A., Knudson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-Interleukin-10R1+Monoclonal+Antibody+Enhances+Bacillus+Calmette-Guerin+Induced+T-Helper+Type+1+Immune+Responses+and+Antitumor+Immunity+in+a+Mouse+Orthotopic+Model+of+Bladder+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Anti-Interleukin-10R1 Monoclonal Antibody Enhances Bacillus Calmette-Guerin Induced T-Helper Type 1 Immune Responses and Antitumor Immunity in a Mouse Orthotopic Model of Bladder Cancer.</a> J. Urol. 187 (6), 2228-2235 (2012).</li>
<li>Watanabe, F. T., Chade, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin%2C+but+not+Prima-1%2C+decreased+tumor+cell+proliferation+in+the+syngeneic+murine+orthotopic+bladder+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics%22%5BJournal%5D)">Curcumin, but not Prima-1, decreased tumor cell proliferation in the syngeneic murine orthotopic bladder tumor model.</a> Clinics. 66 (12), 2121-2124 (2011).</li>
<li>Chade, D. C., Andrade, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathological+characterization+of+a+syngeneic+orthotopic+murine+bladder+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Braz.+J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Histopathological characterization of a syngeneic orthotopic murine bladder cancer model.</a> Int. Braz. J. Urol. 34 (2), 220-226 (2008).</li>
<li>Luo, Y., Chen, X., O'Donnell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+prostate+specific+antigen+to+measure+bladder+tumor+growth+in+a+mouse+orthotopic+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Use of prostate specific antigen to measure bladder tumor growth in a mouse orthotopic model.</a> J. Urol. 172, 2414-2420 (2004).</li>
<li>Zhang, Z., Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+potential+of+SA-sCD40L+in+the+orthotopic+model+of+superficial+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Oncol%22%5BJournal%5D)">The therapeutic potential of SA-sCD40L in the orthotopic model of superficial bladder cancer.</a> Acta Oncol. 50 (7), 1111-1118 (2011).</li>
<li>Kohno, S., Luo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+type+1+mutant+HF10+oncolytic+viral+therapy+for+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Urology%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus type 1 mutant HF10 oncolytic viral therapy for bladder cancer.</a> Urology. 66 (5), 1116-1121 (2005).</li>
<li>Kikuchi, E., Menendez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+gene+delivery+for+bladder+cancers+by+intravesically+administered+replication-competent+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Highly efficient gene delivery for bladder cancers by intravesically administered replication-competent retroviral vectors.</a> Clin. Cancer Res. 13 (15 Pt 1), 4511-4518 (2007).</li>
<li>Siemens, D. R., Austin, J. C., See, W. A., Tartaglia, J., Ratliff, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+gene+transfer+efficiency+by+viral+vectors+to+murine+bladder+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of gene transfer efficiency by viral vectors to murine bladder epithelium.</a> J. Urol. 165 (2), 667-671 (2001).</li>
<li>Siemens, D. R., Crist, S., Austin, J. C., Tartaglia, J., Ratliff, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+viral+vectors%3A+gene+transfer+efficiency+and+tissue+specificity+in+a+bladder+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Comparison of viral vectors: gene transfer efficiency and tissue specificity in a bladder cancer model.</a> J. Urol. 170 (3), 979-984 (2003).</li>
<li>Black, P. C., Shetty, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validating+bladder+cancer+xenograft+bioluminescence+with+magnetic+resonance+imaging%3A+the+significance+of+hypoxia+and+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+Int%22%5BJournal%5D)">Validating bladder cancer xenograft bioluminescence with magnetic resonance imaging: the significance of hypoxia and necrosis.</a> BJU Int. 106 (11), 1799-1804 (2010).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

De in dit protocol beschreven primaire methode is catheterisatie van de muis blazen, die brede toepassingen voor het inbrengen van cellen of een agent die bestemd zijn voor de lokale levering aan de blaas epitheel heeft. De specifiek protocol hierboven beschreven is geoptimaliseerd voor de korte-termijn studies (~ 10 dagen). Implantatie van de juiste aantal cellen is cruciaal, aangezien een groter aantal cellen resulteert in een snellere tumorgroei en mogelijk verlies van dieren door grote tumorlast. Met 200.000 MB49 ce...

Blaaskanker is de tweede meest voorkomende kanker van het urogenitale kanaal met bijna 75.000 nieuwe gevallen en 15.000 sterfgevallen verwacht in 2012 1. Hoge tarieven van herhaling vereisen levenslange follow-up, die blaaskanker een van de duurste vormen van kanker te behandelen maakt. Blaaskanker dat de spierlaag is binnengedrongen kan uitzaaien naar de lever, de longen of het bot via het lymfestelsel. Multimodale behandeling van gevorderde tumoren resulteert in slechts 20-40% overleving na 5 jaar. Daarom zijn effectieve behandeling strategieën die gericht zijn op het verminderen van de herhaling en de progressie van oppervlakkige blaaskanker evenals het verbeteren van de therapeutische resultaten bij patiënten met gevorderde ziekte dringend nodig. Ontwikkeling van nieuwe therapieën nodig preklinische modellen om de werkzaamheid na de eerste in vitro evaluatie evalueren. De tumormicromilieu kan aanzienlijk invloed op de ontwikkeling en het reactievermogen van kanker, die de noodzaak voor preclinic hoogtepuntenal modellen waarin tumoren ontstaan ​​of kan in het orgaan van oorsprong worden vastgesteld. Een benadering is de ontwikkeling van transgene modellen waarin tumoren spontaan ontstaan ​​of kunnen worden geïnduceerd in een orgaan-specifieke wijze. Een uitstekende protocol van een transgeen blaaskanker model is onlangs gepubliceerd 2. Het nadeel van transgene modellen is dat tumoren vaak langzaam en met minder uniformiteit dan gewenst ontwikkelen. Bovendien onderhoudskosten voor een kolonie te worden beschouwd. Een alternatief voor transgene modellen orthotope implantatie van tumorcellen, die het voordeel van korte termijnen voor tumor vestiging in commercieel verkrijgbare muizen heeft. Terwijl sommige menselijke blaaskanker cellijnen orthotopically kan worden gekweekt (wij hebben met succes gebruikt UM-UC-3), kan het wenselijk zijn om tumoren te vestigen in immunocompetente muizen zijn. Twee muizen blaaskanker cellijnen die orthotopically groeien zijn MBT-2 en MB49 3. Omdat MBT-2 cellen worden besmet met het replicerentype C retrovirus 4, hebben we gekozen MB49 cellen voor onze studies. Het is belangrijk op te merken dat MB49 cellen werden geïsoleerd uit een mannelijke muis en orthotope implantaties zijn anatomische redenen uitgevoerd bij vrouwelijke muizen. Dit heeft het voordeel van gemakkelijke identificatie van de geïmplanteerde cellen met markers van het Y-chromosoom, maar het geslacht mismatch kan een nadeel voor immunologische studies. De blaas epitheel wordt omzoomd door een glycosaminoglycaan (GAG) laag, die fungeert als een barrière voor infectie door micro-organismen. Deze barrière kan ook interfereren met de implantatie van tumorcellen en verscheidene methoden ontwikkeld om dit probleem (tabel 1) te overwinnen. Elektrocauterisatie is uitgebreid gebruikt als fysieke middelen voor de GAG-laag 5-13 en een protocol demonstreren elektrocauterisatie is onlangs gepubliceerd in Jupiter 14 verstoren. Echter moet een elektrocauterisatie apparaat niet beschikbaar, chemische middelen aan de G vernietigenAG laag, zoals zilvernitraat of poly-L-lysine kan ook 15-24. Tumoren effectief vastgesteld door een korte blootstelling van de blaas een kleine hoeveelheid zilvernitraat (5-10 pl, 0,15-1,0 M, ~ 10 seconden) of langer contact met poly-L-lysine (100 pl 0,1 mg / ml gedurende 20 min) (tabel 1). Hier beschrijven we een werkwijze die trypsine gebruikt geïmplanteerd MB49 cellen vergemakkelijken. In een poging om therapeutische toepassingen voor blaaskanker verbeteren heeft gentherapie veel aandacht vergaard. Vanuit een klinisch standpunt, blaaskanker is een ideaal doel voor gentherapie vanwege gemakkelijke toegankelijkheid van het orgaan en zich lokaal leveren van de lading. Virale vectoren die zijn onderzocht voor blaaskanker gentherapie omvatten een oncolytische herpes simplex virus 25, retrovirus 26, kanariepokkenvirus 27, vaccinia virus, AAV, en adenovirus 28. In het tweede deel van ons protocol beschrijven we een werkwijze voor virale aflevering die vrijwel identiek is aan instillatie van de tumorcellen. Van belang in ons lab is de ontwikkeling van nieuwe benaderingen om genaflevering, die wij beoordelen via bioluminescentie met een adenovirale vector die een luciferase transgen uitdrukt. Echter, de methode van blaaskatheterisatie worden gebruikt voor levering van verschillende agentia en daarom heeft brede toepasbaarheid.

<table><tbody><tr><td> Naam reagens </td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td> Opmerkingen </td></tr><tr><td> 6-8 weken oude vrouwelijke muizen </td><td>Jackson Laboratories</td><td>Stamnaam: C57BL/6J Voorraadnummer: 000664</td><td> </td></tr><tr><td> Trypsine* </td><td>MediaTech</td><td>MT25-053-CI</td><td> Verkregen via Fisher </td></tr><tr><td> DMEM* </td><td>MediaTech</td><td>MT10-017-CV</td><td> Verkregen via Fisher </td></tr><tr><td> FBS </td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td> Warmte-geïnactiveerd </td></tr><tr><td> T25 kolven* </td><td>Corning Costar</td><td>Corning No.:3056 Fisher: 07-200-63</td><td> Verkregen via Fisher </td></tr><tr><td> MB49 cellen </td><td>N/A</td><td>N/A</td><td> Verkregen van Dr. Boehle (zie referentie11) </td></tr><tr><td> Puralube Vet Ointment* </td><td>Pharmaderm</td><td>Henry Schein Company No.:036090-6050059 Fisher: NC9676869</td><td> Verkregen via Fisher </td></tr><tr><td> Depilatiecrème: Veet </td><td>plaatselijke apotheek</td><td></td><td> </td></tr><tr><td> Smeermiddel: K-Y Jelly </td><td>plaatselijke apotheek</td><td></td><td> </td></tr><tr><td> Katheters* </td><td>Exel International</td><td>Exel International No.:26751; Fisher: 14-841-21</td><td> Verkregen via Fisher </td></tr><tr><td> Isofluraan </td><td>Terrell</td><td>NDC 66794-011-25</td><td> Verkregen via ziekenhuisapotheek </td></tr><tr><td> 1 ml slip tip TB-spuit </td><td>Becton Dickinson</td><td>BD309659 Fisher:14-823-434</td><td> </td></tr><tr><td> D-Luciferine </td><td>Gold Biotechnologies</td><td>L-123-1</td><td> </td></tr><tr><td> Ad-CMV-Luc </td><td>VectorBiolabs</td><td>1000; Vraag om grootschalige versterking en CsCl-zuivering voor in vivo gebruik</td><td> Besmettelijk agens dat BSL2-containment vereist </td></tr><tr><td> Steady-Glo&nbsp;Luciferase Assay System </td><td>Promega</td><td>E2510 (10 ml), E2520 (100 ml) of E2550 (10 x 100 ml)</td><td> </td></tr><tr><td colspan="4">*beschikbaar via meerdere leveranciers</td></tr><tr><td colspan="4">UITRUSTING</td></tr><tr><td> Anesthesiesysteem </td><td>E-Z Systems, Euthanex Corporation</td><td>Anesthesiesysteem: EZ7000 5-poorts muis herademingsapparaat: EZ109</td><td> Verkregen via Fisher </td></tr><tr><td> Xenogen IVIS 200 </td><td>Caliper Life Sciences</td><td>http://www.caliperls.com/products/preclinical-imaging/ivis-imaging-system-200-series.htm</td><td> </td></tr><tr><td> FLUOstar Optima </td><td>BMG Labtech</td><td>http://www.bmglabtech.com/products/microplate-reader/instruments.cfm?product_id=2</td><td> </td></tr></tbody></table>

een orthotope blaaskanker model voor gene delivery studies

An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

Blaaskanker is de tweede meest voorkomende kanker van het urogenitale kanaal en nieuwe therapeutische benaderingen die kunnen verminderen herhaling en progressie nodig zijn. De tumormicromilieu kan significante invloed op tumorontwikkeling reactie. Het is derhalve vaak wenselijk om tumorcellen groeien in het orgaan waaruit zij afkomstig. Dit protocol beschrijft een orthotopic model van blaaskanker, waarin MB49 muizen blaascarcinoom cellen worden bijgebracht in de blaas via katheterisatie. Succesvolle tumorcel implantatie bij dit model moet verstoring van de glycosaminoglycaan beschermende laag, die kan worden bereikt door fysische of chemische middelen. In ons protocol de blaas wordt behandeld met trypsine vóór cel instillatie. Catheterisatie van de blaas kan ook gebruikt worden om geneesmiddelen te leveren zodra de tumoren vastgesteld. Dit protocol beschrijft de afgifte van een adenovirale construct dat een luciferase reportergen tot expressie. Terwijl our protocol is geoptimaliseerd voor de korte-termijn studies en richt zich op gentherapie, de methodologie van muis blaaskatheterisatie heeft brede toepassingen.

Hematurie waargenomen in vrijwel alle muizen binnen 8 dagen na implantatie van 200.000 MB49 cellen. Zoals getoond in figuur 1, blaas gewicht meer dan verdubbeld van 34,7 ± 3,3 mg (bereik 31-37 mg, n = 4) in nontumor muizen met 87,5 ± 19,2 mg (range 77-120 mg, n = 10) bij muizen die zijn geïmplanteerd MB49 cellen. In termen van genlevering, vonden we dat het afbeelden van muizen 24 uur na virale instillatie levert een sterker signaal dan na 48 uur (figuur 2). Adenovirale levering is zeer...

Implantatie van kankercellen in het orgaan van oorsprong kan dienen als een nuttige preklinisch model om nieuwe therapieën te evalueren. MB49 blaascarcinoom cellen kunnen worden gekweekt in de blaas na intravesicale instillatie. Dit protocol toont katheterisatie van de blaas muis behoeve van tumor implantatie en adenovirale levering.

Een orthotope Blaaskanker Model voor Gene Delivery Studies

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

Het algemene doel van deze procedure is om consistent en snel tumoren te produceren in de bladders van muizen, die vervolgens kunnen worden gebruikt om therapieën tegen blaasjeskanker te testen. Dit wordt bereikt door eerst kankercellen in de bladders van muizen in te brengen via catheterisatie. Acht dagen later wordt de catheterisatie herhaald om een adenovirus in te brengen dat een luciferase-reportergen tot expressie brengt.Vervolgens wordt 24 uur later de virale genexpressie gemeten met een luciferase-assay. De resultaten tonen de condities aan waarbij een optimale genexpressie kan worden bereikt. Een visuele demonstratie van deze techniek is cruciaal, omdat de stappen van de catheterisatie en installatie moeilijk aan te leren zijn en vanwege het risico op beschadiging van de blaas en/of het lekken van het geïnstalleerde materiaal.Twee dagen voor het uitvoeren van de celimplantatie worden 1 × 10⁶ MB 49-cellen geplaatst in T 25-flesjes met hoog-glucose DMEM aangevuld met 10% FBS. Bereid op de dag van de procedure tripsine voor door steriele 0,25% trypsin (tissue culture grade) te verdunnen met DMEM-basismedium. Plaats de oplossing in een waterbad van 37 °C om deze te equilibreren, verwarm een warmtemat voor en positioneer deze onder de neuskegels van het anesthesiesysteem dat wordt gebruikt voor de toediening van isofluoraan.Plaats een schoon absorberend matje op het warmtekussen nadat de muizen zijn geanestheseerd met 3% isofluraan. Voer een teenknijptest uit om de sedatiegraad te verifiëren. Plaats ze in rugligging op het warmtekussen en bevestig een neusmasker met 2% isofluraan.Gebruik een niet-irriterende glijmiddelgel om een nieuwe steriele 20 4G pediatrische veneuze catheter te smeren. Verwijder vervolgens de naald die de hub van de catheter vasthoudt en gooi deze weg. Gebruik de duim en wijsvinger van uw andere hand om de achterpoten van de muis te spreiden en de urethrale mucosa bloot te leggen.Voer de katheter voorzichtig onder een hoek van 45 graden in de urethra in; pas de hoek aan naar parallel aan de tafel om de katheter volledig in te brengen na volledige insertie. Til de katheter voorzichtig op terwijl deze parallel aan de tafel wordt gehouden en bevestig visueel dat deze in de urethra is geplaatst en niet in de vagina, die zich eronder bevindt. Herhaal dit bij de overige geanestheseerde muizen.Verlaag vervolgens de isofluoranenconcentratie tot 1%. Bevestig een tip aan een P 200 pipet en verwijder de urine uit de blaas door zuiging uit te oefenen op het externe uiteinde van de katheter. Verwijder eventueel resterende urine uit de aansluiting van de katheter, gooi de urine vervolgens weg en laat de katheter op zijn plaats. Pipetteer voorzichtig 80 µL van de warme trypsinesolutie in de aansluiting van de katheter, waarbij luchtbellen worden vermeden.Bevestig een met lucht gevulde spuit van 1 CC aan de catheterhub en druk de zuiger langzaam in. Gebruik 0,1 tot 0,2 ccs om de trypsine in de blaas te injecteren. Laat de spuit en de catheterassemblages 15 minuten op hun plaats zitten.Om cellen voor implantatie voor te bereiden. Verwijder het medium van de eerder geplaatte MB 49-cellen en voeg 500 µL 0,25%trypsine toe aan de fles. Zodra de cellen loslaten, voeg vijf ml compleet DMEM toe om de cellen te resuspenderen; neem een aliquot van 50 µL voor het tellen en centrifugeer de rest bij 1000 RPM gedurende vijf minuten terwijl de cellen centrifugeren.Gebruik een hemocytometer om de cellen te tellen en bereken het aantal cellen per milliliter, evenals het volume medium dat nodig is om het celpellet op vier keer 10⁶ cellen per liter te brengen. Giet het supernatant van de gecentrifugeerde cellen af en resuspendeer het pellet in DMEM-basismedium.Houd de cellen bij kamertemperatuur. Koppel na de tripsinebehandeling van 15 minuten de luchtspuit los van de katheter, terwijl de katheter op zijn plaats blijft. Gebruik een P 200 pipet om eventuele resterende tripsine uit de blaas te verwijderen via aspiratie en gooi dit onmiddellijk weg. Pipetteer 50 µL MB 49 cel-suspensie in de hub van de katheter.Bevestig vervolgens de luchtgevulde spuit van 1 cc aan de aansluiting van de katheter en breng de cellen naar de blaas door de zuiger langzaam in te drukken. 0,1 tot 0,2 cc. Laat de katheter-spuitassemblage op zijn plaats.Laat de cellen gedurende 50 minuten in de blaas verblijven. Trek vervolgens voorzichtig de katheter-spuitassemblage uit de urethra. Verlaag het isofluoraan naar 0% en laat de muizen herstellen van de anesthesie op het warmteplateau.Zodra de muis zijn schrijfreflex heeft teruggekregen, plaatst u deze terug in de kooi. Let op: dit protocol maakt gebruik van adenovirus, wat een infectieus agens is en strikt volgens de BSL-2-richtlijnen moet worden behandeld. Alle procedures die met infectieuze agentia zijn uitgevoerd, zijn goedgekeurd door de institutionele commissie voor biologische veiligheid van de Medical University of South Carolina.Acht dagen na het implanteren van muizen met MB 49-cellen werd er op hematurie gecontroleerd door individuele dieren op een wit stuk absorberend papier te plaatsen en voorzichtig op de buik te drukken om druppels urine op het papier te blotten. Urine die roze tot rood is, duidt op hematuria en is een teken dat tumoren zijn ontstaan. Ontdooi de adenovirale voorraad op ijs en gebruik steriele PBS op kamertemperatuur om deze te verdunnen tot 10⁹ pfu per 50 µL. Na het anesthetiseren en catheteriseren van de muizen en het verwijderen van de urine zoals eerder in deze video beschreven, worden onmiddellijk 50 µL van de virussuspensie in de hub van de katheter gepipetteerd; bevestig vervolgens een luchtgevulde spuit en druk de zuiger in om het virus in de blaas te brengen. Laat de katheter-spuitassemblage op zijn plaats en laat het virus gedurende 40 minuten in de blaas verblijven.Trek vervolgens voorzichtig de samenstelling van de katheter en spuit uit de urethra en gooi deze weg in een 10% bleekmiddeloplossing om eventueel overgebleven virus te inactiveren. Laat de muis herstellen van de anesthesie voordat deze terug in de kooi wordt geplaatst; markeer de kooien om aan te geven dat de muizen zijn geïnstilleerd met adenovirus. Het virus zal gedurende enkele dagen in de kooi-bedekking worden uitgescheiden en alle kooien en bedekking moeten op passende wijze worden behandeld en gedesinfecteerd. Hematurie wordt bij bijna alle muizen waargenomen binnen acht dagen na implantatie van 200.000 MB 49-cellen, zoals hier getoond.Het gewicht van de blaas is meer dan verdubbeld, van 34,7 ± 3,3 milligram bij muizen zonder tumor tot 87,5 ± 19,2 milligram bij muizen waarin MB 49-cellen zijn geïmplanteerd. Wat betreft de genoverdracht levert beeldvorming van de muizen 24 uur na virale installatie een sterker signaal op dan na 48 uur. Adenovirale overdracht is zeer variabel tussen dieren, wat in rekening moet worden gebracht bij het bepalen van de groepsgrootte voor statistische doeleinden.Indien een beeldvormingssysteem voor kleine dieren niet beschikbaar is, is een alternatieve benadering om de expressie van het luciferase-transgen te meten het verwijderen en homogeniseren van de blaas voor in vitro analyse, zoals hier gedemonstreerd. Een vergelijking tussen de in vivo analyse met behulp van het IVUS 200 systeem voor kleine dieren en de in vitro analyse met gebruik van de steady glow kit wijst op een uitstekende correlatie tussen de datasets. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een muizenblaas kunt catheteriseren en tumorcellen of therapeutische middelen kunt instralen.

an-orthotopic-bladder-cancer-model-for-gene-delivery-studies

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Blaastumoren zijn gevestigd in vrouwelijke muizen in een minimaal invasieve wijze via catheterisatie, lokale cauterisatie, en de daaropvolgende aanhechting van carcinoom cellen om de branden sites.

Een orthotope Model van Murine Blaaskanker

De oprichting van een orthotope blaas tumor model om anti-tumor effecten van intravesicaal geleverd Sarna en monitoring groei van de tumor door middel van ultrageluid en bioluminescente beeldvorming te evalueren.

Een orthotope Blaas Tumor Model en de evaluatie van Intravesicale Sarna behandeling

In this video, we describe the orthotopic transplantation of cultured bladder tumor organoids into the murine bladder to study the role of the organ environment on developing tumors.

Bladder Tumor Organoid Model: A Method for Orthotopic Transplantation of Bladder Organoids into Recipient Murine Bladder

In this video, we describe the intravesical procedure of delivering cancer cells into the bladder of a mouse model. This procedure helps generate an orthotopic bladder tumor model that can be used to develop therapeutic strategies.

Modeling Orthotopic Bladder Tumor in Mouse Model: A Procedure for Intravesical Administration of Cancer Cells into Murine Bladder

De gevestigde techniek om primaire invasieve orthotoop blaaskanker xenotransplantaten te enten vereist laparotomie en mobilisatie van de blaas. Deze procedure toebrengt significante morbiditeit op de muizen, technisch uitdagend en tijdrovend. Daarom hebben wij een hoge precisie, percutane benadering gebruik te maken van echografie begeleiding.

Minimaal Invasieve Oprichting van Muriene Orthotope Blaas Xenografts

Dit protocol beschrijft de generatie van muizen orthotope blaastumoren bij vrouwelijke C57BL / 6J muizen en de monitoring van tumorgroei.

Een muizen orthotope Blaas Tumor Model en Tumor Detection System

Beschrijven we een nieuwe methode voor de levering van DNA plasmide in de cellen van de urothelial van muis blaas in vivo via de urinebuis catheterisatie en electroporation. Het biedt een snelle en gemakkelijke manier voor het genereren van autochtone Muismodellen van ziekten van de blaas.

Nieuwe methode van plasmide DNA levering aan muis blaas Urothelium door Electroporation

Dit protocol beschrijft de generatie van door patiënten afgeleide orthotopic xenotransplantaatmodellen is-modellen door intra-vesisch bijbrengen van hoogwaardige urotheelcelcarcinoom cellen of intra-rectale injectie van colorectale kankercellen in niet-zwaarlijvige diabetische/ernstige gecombineerde immunodeficiëntie (NOD/SCID) muizen voor primaire tumorgroei en spontane metastasen onder invloed van lymfeklier stromale cellen, die de progressie van humane gemetastaseerde ziekten nabootst.

Patiënt-afgeleide Orthotopic xenograft modellen voor humaan Urotheelcelcarcinoom en colorectale kanker tumor groei en spontane metastasen

Dit protocol biedt gedetailleerde experimentele stappen om een driedimensionale in vitro cultuur van blaastumororganoïden afgeleid van kankerverwekkende murineblaaskanker vast te stellen. Cultuurmethoden zoals passaging, genetische manipulatie en orthotopische transplantatie van tumororganoïden worden beschreven.

Cultuur, manipulatie en orthotopische transplantatie van mouse bladder tumor organoïden

Dit protocol beschrijft het proces van het genereren en karakteriseren van muis urotheliale organoïden die deleties in genen van belang herbergen. De methoden omvatten het oogsten van muizenurotheelcellen, ex vivo transductie met adenovirus dat Cre-expressie drijft met een CMV-promotor, en zowel in vitro als in vivo karakterisering.

Ex Vivo Organoïde model van Adenovirus-Cre gemedieerde gendeleties in muizen urotheelcellen

Leer een orthotopisch blaaskankermodel met MB49-celimplantatie en adenovirale gentherapie bij muizen. Deze methode maakt evaluatie van genexpressie en nieuwe behandelingen voor blaaskanker mogelijk.

Een orthotope Blaaskanker Model voor Gene Delivery Studies

Meer video's verkennen