Name: Neonatale subventriculaire zone Elektroporatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Leer neonatale subventriculaire zone-elektroporatie voor genetische manipulatie van neurale stamcellen in muizen. Deze methode biedt een snelle en kosteneffectieve manier om neurogenese te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Ministerie van Defensie (Idee ontwikkeling award, W81XWH-10-1-0041, AB), CT stamcellen subsidie ​​(AB) en een National Institute of Health NRSA 10668225 (DMF). De huidige materiaal is gebaseerd op het werk mede ondersteund door de staat Connecticut in de Connecticut Stem Cell Research Grants Program. De inhoud ervan is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigen niet noodzakelijk de officiële standpunten van de staat Connecticut, het ministerie van Volksgezondheid van de staat Connecticut of CT Innovations, Inc De financiers hadden geen rol in de opzet van het onderzoek, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit tot publicatie, of de bereiding van het manuscript.

Deze procedure is in overeenstemming met Yale IACUC eisen. Wetenschappers moeten ervoor zorgen dat IACUC richtlijnen worden goedgekeurd en gevolgd op basis van hun institutionele eisen. 1. Afdeling 1. Bereiding van DNA, oplossingen en glazen pipetten <ol><li> Genereer hoge zuiverheid (OD 260/280&gt; 1,80) hoge concentratie (ug / ul&gt; 2.5) endotoxine-vrij DNA. </li><li> Bereid 0,9% zoutoplossing en steriel gefiltreerd door een 22 pm filter. </li><li> Plaats 10 cm brand gepolijst borosilicaatglas capillaire buizen (OD: 1,5 mm, ID: 1,10 mm) in een model PP-830 Narishige PC-10 glazen pipet trekker met een Kanthal draad. Stel trekker om een ​​een stap gewogen pull bij 70,5 ° C. Break tips met ronde tang en inspecteren onder een dissectie microscoop voor gekartelde randen. Bevel tips en plaats onder een UV-lamp gedurende 15 minuten. Getrokken pipetten worden gemarkeerd op 2 mm van de rand van de tip. </li><li> Bereid 0,1% gewicht / volume snel groen Solutidoor mengen steriel gefiltreerd 0,9% zoutoplossing met droog snel groen. </li></ol> 2. Sectie 2. Animal Voorbereiding, glazen pipet met laden en Plasmide Injectie <ol><li> Verwijder postnatale dag 0-1 pups individueel uit kooien, plaats op een glazen petrischaal voorgekoeld tot 4 ° C, en daarna op nat ijs. </li><li> Na ongeveer 5 min, is de stand van verdoving door gebruikmaking van de voet pinch reactie. Als er geen beweging optreedt, onder voorbehoud van pups tot intraventriculaire injectie. </li><li> Het is belangrijk op te merken dat de combinatie van fast green, DNA en zoutoplossing kan resulteren in een snelle verdamping, kristallisatie en blokkade van glazen pipetten. Daarom het genereren van een stockoplossing aanwezig zijn en aliquot 1 tot 2 pl op parafilm onmiddellijk voorafgaand aan injecties. </li><li> Zuig het hele hoeveelheden verdeeld volume met de getrokken glazen pipet. </li><li> Houd de kop van de pup tussen uw duim en wijsvinger van uw minder dominante hand. </li><li> Zet lamp eend Houd het hoofd van pup net buiten lichtbundel. Indien nodig zoutoplossing op het hoofd van de hoeveelheid licht die gereflecteerd door pup verminderen. De ventrikels nu branden. </li><li> Met je dominante hand, steek de naald in laterale ventrikel het dichtst bij u (Figuur 1A en 1B). De plaats van injectie ongeveer gelijke afstand van de lambdoïde hechtdraad en oog en 2 mm lateraal van de pijlnaad. Plaats getrokken pipet om de 2 mm voor een merk P0 pup die moet doordringen in het laterale ventrikel. Toevallig, ziet u wellicht terug vullen van CSF in de pipet uit de release van intracraniale druk. Om intracraniale druk, die helpt bij injectie van plasmide te verminderen, maak je grip op het hoofd van de pup.Step 2.8. Injecteer ongeveer 0,5 ul van plasmide in laterale ventrikel met behulp van een lucht-druk injector (Picospritzer, Parker). </li></ol> 3. Sectie 3. Elektroporatie en Herstel <ol><li> Set de spanning van de generator voor elektroporatie 5 vierkante pulsen, 50 msec / puls bij 100 volt met 950 msec intervallen. De ruimtelijke specificiteit van elektroporatie plasmide wordt bepaald door de richtingsgevoeligheid van ladingsoverdracht. Bijzondere aandacht moet worden besteed aan de plaatsing vanwege de heterogeniteit van stamcelpopulaties langs de SVZ 8. Verschillen in de tarieven van de proliferatie en lot van de cel zijn geïdentificeerd voor ventrale-dorsale en rostrale-caudale locaties 9,10. </li><li> Zodra het plasmide wordt geïnjecteerd, duik pincet elektroden in PBS. Deze stap is om overdracht van lading te maximaliseren en brandwonden veroorzaakt door weerstand te voorkomen. </li><li> Plaats de positieve elektrode op de dorsale laterale wand van de pup bij het ​​oor ipsilaterale de site van plasmide injectie (figuur 1C en 1D). Plaats de negatieve elektrode op de contralaterale hemisfeer ventrale lateraal van de pup snuit. </li><li> Start stroomoverdracht door te drukken op de pols footsheks pedaal en de elektroden vegen van dorsale laterale met ~ 25 ° hoek intervallen. </li><li> Plaats geëlektroporeerd pups op een verwarming pad gedurende 5 minuten. Voorzichtig rondgedraaid pups elke 30 seconden met een milde stimulatie. </li></ol>

<ol><li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).</li>
<li>Imayoshi, I., Sakamoto, M., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+methods+to+identify+and+manipulate+newly+born+neurons+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetic methods to identify and manipulate newly born neurons in the adult brain.</a> Frontiers in Neuroscience. 5, 64(2011).</li>
<li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i120-i125 (2009).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li>
<li>Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+vivo+electroporation+of+the+postnatal+rodent+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain.</a> PloS ONE. 3, e1883(2008).</li>
<li>Chesler, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+gene+expression+by+postnatal+electroporation+during+olfactory+interneuron+nurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis.</a> PloS ONE. 3, e1517(2008).</li>
<li>Platel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptors+activated+by+subventricular+zone+astrocytic+glutamate+are+critical+for+neuroblast+survival+prior+to+entering+a+synaptic+network%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network.</a> Neuron. 65, 859-872 (2010).</li>
<li>Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heterogeneity+of+adult+neural+stem+cells+and+the+emerging+complexity+of+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Symposia+on+Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 73, 357-365 (2008).</li>
<li>Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+electroporation+of+defined+lateral+ventricular+walls%3A+a+novel+and+rapid+method+to+study+fate+specification+during+postnatal+forebrain+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis.</a> Neural Development. 6, 13(2011).</li>
<li>de Chevigny, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-7a+regulation+of+Pax6+controls+spatial+origin+of+forebrain+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">miR-7a regulation of Pax6 controls spatial origin of forebrain dopaminergic neurons.</a> Nature Neuroscience. 15, 1120-1126 (2012).</li>
<li>Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+recording+subventricular+zone+progenitor+cells+in+live+tissue+of+postnatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice.</a> Frontiers in Neuroscience. 4, (2010).</li>
<li>Feliciano, D. M., Quon, J. L., Su, T., Taylor, M. M., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+neurogenesis+generates+heterotopias%2C+olfactory+micronodules+and+cortical+infiltration+following+single-cell+Tsc1+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Postnatal neurogenesis generates heterotopias, olfactory micronodules and cortical infiltration following single-cell Tsc1 deletion.</a> Human Molecular Genetics. 21, 799-810 (2012).</li>
<li>Iguchi, T., Yagi, H., Wang, C. C., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tightly+controlled+conditional+knockdown+system+using+the+Tol2+transposon-mediated+technique%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">A tightly controlled conditional knockdown system using the Tol2 transposon-mediated technique.</a> PloS ONE. 7, e33380(2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen mededelingen te doen.

Hier detail de techniek van neonatale SVZ elektroporatie, een techniek om snel en krachtig labelen en manipuleren SVZ stamcellen en hun nakomelingen. Er zijn verschillende voordelen die elektroporatie heeft in vergelijking met andere technieken. Eerste, gezien de focale kenmerken van cellen, een cel kan zelfstandige en niet-cell autonome effecten onderscheiden. Tweede genetische manipulatie met behulp van induceerbare systemen kan een vergelijking effecten vóór of na synaptische integratie. Verder kan een bypass het geb...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> Zware Gepolijst Borosilicate Tubing </td><td> Sutter Instrument </td><td> BF150-110-10 </td><td></td></tr><tr><td> Dual-Stage Glas Micropipet Puller </td><td> Narishige </td><td> PC-10H </td><td></td></tr><tr><td> Fast Green </td><td> Fischer Scientific </td><td> 0521192205 </td><td></td></tr><tr><td> ECM 830 blokgolf generator </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 45-0.052 </td><td></td></tr><tr><td> Tweezertrodes </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 45 tot 0488 </td><td></td></tr><tr><td> Fiber-Optic Light Source </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-562-36 </td><td></td></tr><tr><td> Tungsten Halogeenlamp </td><td> USHIO America, Inc </td><td> 1002247 </td><td></td></tr><tr><td> Picospritzer II </td><td> Parker Instrumenten </td><td> 052-0312-900 </td><td></td></tr></tbody></table>

neonatale subventriculaire zone elektroporatie

Neonatal Subventricular Zone Electroporation

Neurale stamcellen (NSC&#39;s) langs de postnatale laterale ventrikels en leiden tot verschillende celtypen die neuronen, astrocyten en ependymale cellen 1 omvatten. Inzicht in de moleculaire routes die verantwoordelijk zijn voor de NSC zelfvernieuwing, betrokkenheid, en differentiatie is van cruciaal belang voor het benutten van hun unieke potentieel om de hersenen te herstellen en beter te begrijpen het centraal zenuwstelsel. Eerdere methoden voor het manipuleren van zoogdiersystemen vereist de tijdrovende en dure onderneming van genetische manipulatie in het gehele dier level 2. Zo hebben de meeste studies onderzocht de functies van NSC moleculen in vitro of in ongewervelden. Hier tonen we de eenvoudige en snelle techniek om neonatale NPCs die wordt aangeduid als neonatale subventriculaire zone (SVZ) elektroporatie manipuleren. Vergelijkbare technieken werden tien jaar geleden ontwikkeld om embryonale NSCs studeren en hebben geholpen studies over cortical ontwikkeling 3,4. Meer recent werd dit toegepast op de studie van de postnatale knaagdier voorhersenen 5-7. Deze techniek resulteert in robuuste etikettering van SVZ NSCs en hun nageslacht. Zo postnatale SVZ elektroporatie zorgt voor een kosten-en tijdbesparende alternatief voor zoogdieren NSC genetische manipulatie.

Neonatale subventriculaire zone elektroporatie resulteert in de etikettering van bijna alle radiale glia grenst aan de dorsale, laterale dorsale en laterale subventriculaire zone na de &quot;vegen&quot; beweging van de pincet elektrode (figuur 1E). Echter, elektroporatie worden afgestemd op de eisen van de respectieve experiment maar niet vegen de elektrode en met specifieke plaatsing en richting zoals beschreven in de video. Bijvoorbeeld, omdat dorsaal gelokaliseerde radiale glia afwijken van de bekled...

We tonen een minimaal invasieve techniek genoemd neonatale subventriculaire zone elektroporatie. De techniek bestaat uit het injecteren plasmide DNA in de laterale ventrikels van neonatale pups en toepassen elektrische stroom te leveren en genetisch manipuleren neurale stamcellen

Neonatale subventriculaire zone Elektroporatie

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal ...

Het doel van deze procedure is om de moleculaire bestanddelen van neurale stamcellen in de subventriculaire zone genetisch te labelen en te manipuleren. Dit wordt bereikt door eerst een glazen pipet gevuld met DNA in de laterale ventrikel van een P nul P in te brengen. De tweede stap is om DNA in de hersenvocht van de laterale ventrikel te spuiten. Vervolgens wordt stroom aangebracht op de P. Dit maakt de overdracht van DNA naar neurale stamcellen mogelijk die de laterale ventrikels bekleden.Uiteindelijk worden een combinatie van moleculaire technieken, waaronder immunohistochemie, moleculaire biologie, microscopie en elektrofysiologie, gebruikt om veranderingen in bestemming, proliferatie, migratie en rijping van neuro stamcellen in de subventriculaire zone te visualiseren. Neonatale subventriculaire zone elektroporatie kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van neurogenese te beantwoorden, zoals welke moleculaire paden verantwoordelijk zijn voor het reguleren van de proliferatie, differentiatie, migratie en rijping van neuronale stamcellen en hun nakomelingen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals transgene muizen, is dat

neonatal-subventricular-zone-electroporation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In Utero Intraventriculaire injectie en elektroporatie van de E16 Rat embryo&#39;s

In Utero Intraventriculaire injectie en elektroporatie van de E15 muizenembryo&#39;s

In utero elektroporatie zorgt voor een snelle genafgifte in een ruimtelijk-temporeel en gecontroleerde wijze in de zich ontwikkelende centrale zenuwstelsel (CZS). Hier beschrijven we een groot aanpassingsvermogen in utero electroporatie protocol dat gebruikt kan worden om expressie constructen te leveren in meerdere embryonale CNS domeinen, waaronder de telencephalon, diencephalon en netvlies.

Efficiënte gen delivery in meerdere CNS Gebieden Het gebruik van In Utero Elektroporatie

Regelen van de groei van somatische stamcellen is een belangrijke factor die de studie en het gebruik in therapie. Hier beschrijven we een systeem tijdelijk controle neurale stamcellen expansie en volwassen, die kunnen worden gebruikt om het aantal neuronen gegenereerd in muizenhersenen verhogen.

Uitbreiding van embryonale en adulte neurale stamcellen door<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporation of Viral stereotactische injectie

Dit protocol beschrijft een verbeterde explantaat procedure die inhoudt...

Ex utero elektroporatie en Whole halfrond Explantaten: Een eenvoudige experimentele methode voor bestudering van vroege corticale ontwikkeling

Neuroblast migratie is een fundamentele gebeurtenis in postnatale neurogenese. We beschrijven een protocol voor efficiëntie-etikettering van neuroblasts door in vivo postnatale elektroporatie en de daaropvolgende visualisatie van hun migratie met behulp van time-lapse imaging van acute hersenen plakjes. Wij beschikken over een beschrijving van de kwantitatieve analyse van neuroblast dynamiek door video-tracking.

In vivo Postnatale Elektroporatie en time-lapse imaging van neuroblast Migratie in Muis Acute Brain Slices

De pial oppervlak is een uniek voorlopercellen zone in het CZS, die krijgt steeds meer aandacht. Hierin hebben we gedetailleerd een methode voor snelle genetische manipulatie van deze voorlopercellen zone met een aangepaste elektroporatiewerkwijze. Deze procedure kan worden gebruikt voor cellulaire en moleculaire analyses van cellijnen en signaalwegen betrokken bij celdifferentiatie en het lot en de eigenschappen van dochtercellen helderen.

Neonatale Pial Surface Elektroporatie

Deze procedure laat zien hoe interneuronen in de zich ontwikkelende voorhersenen van muizen kunnen worden gericht door middel van in utero elektroporatie. Deze techniek was bijzonder efficiënt om selectieve genexpressie in interneuron-subtypen te bereiken die bestemd zijn voor de oppervlakkige lagen van de cortex.

Subtype-selectieve Electroporatie van corticale Interneurons

Dit manuscript biedt protocollen die gebruik maken van in de baarmoeder elektroporatie (IUE) om de structurele connectiviteit van neuronen te beschrijven op het single-cell niveau en de prikkelbaarheid van fluorescent gelabelde neuronen. Histologie wordt gebruikt dendritische en axonale uitsteeksels karakteriseren. Whole-cell opname in acute plakjes wordt gebruikt om prikkelbaarheid te onderzoeken.

In Utero Elektroporatie benaderingen om de prikkelbaarheid van neuronale subpopulaties en Single-cell Connectivity Studie

Hier gepresenteerd is een protocol om genetische manipulatie uit te voeren in de embryonale fret hersenen met behulp van in utero elektroporatie. Deze methode maakt het mogelijk om neurale voorlopercellen in de neocortex in vivo te targeten.

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex door In Utero Electroporation

De elektroporatie van cerebrale organoïden van primaten biedt een nauwkeurige en efficiënte benadering om voorbijgaande genetische modificatie (s) te introduceren in verschillende voorlopertypen en neuronen in een modelsysteem dat dicht bij de ontwikkeling van primaat (patho) fysiologische neocortex ligt. Dit maakt de studie van neurologische ontwikkelings- en evolutionaire processen mogelijk en kan ook worden toegepast voor ziektemodellering.

Gerichte micro-injectie en elektroporatie van cerebrale organoïden van primaten voor genetische modificatie

Leer neonatale subventriculaire zone-elektroporatie voor genetische manipulatie van neurale stamcellen in muizen. Deze methode biedt een snelle en kosteneffectieve manier om neurogenese te bestuderen.

Neonatale subventriculaire zone Elektroporatie

Meer video's verkennen