Neonatale subventriculaire zone Elektroporatie
11 februari 2013
We tonen een minimaal invasieve techniek genoemd neonatale subventriculaire zone elektroporatie. De techniek bestaat uit het injecteren plasmide DNA in de laterale ventrikels van neonatale pups en toepassen elektrische stroom te leveren en genetisch manipuleren neurale stamcellen
Het doel van deze procedure is om de moleculaire bestanddelen van neurale stamcellen in de subventriculaire zone genetisch te labelen en te manipuleren. Dit wordt bereikt door eerst een glazen pipet gevuld met DNA in de laterale ventrikel van een P nul P in te brengen. De tweede stap is om DNA in de hersenvocht van de laterale ventrikel te spuiten. Vervolgens wordt stroom aangebracht op de P. Dit maakt de overdracht van DNA naar neurale stamcellen mogelijk die de laterale ventrikels bekleden.
Uiteindelijk worden een combinatie van moleculaire technieken, waaronder immunohistochemie, moleculaire biologie, microscopie en elektrofysiologie, gebruikt om veranderingen in bestemming, proliferatie, migratie en rijping van neuro stamcellen in de subventriculaire zone te visualiseren. Neonatale subventriculaire zone elektroporatie kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van neurogenese te beantwoorden, zoals welke moleculaire paden verantwoordelijk zijn voor het reguleren van de proliferatie, differentiatie, migratie en rijping van neuronale stamcellen en hun nakomelingen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals transgene muizen, is dat het de snelle en robuuste labeling van neuron stamcellen van de SVZ mogelijk maakt op een tijd-efficiënte en kosteneffectieve manier.
Zorg er eerst voor dat het DNA om te elektro pureren van hoge zuiverheid en concentratie is en vrij is van endotoxines. Trek 10 centimeter vuur gepolijste BO silica glas capillaire buisjes tot pipetten. Een PP acht 30 ghhi PC 10 pipette puller ingesteld op een één stap zwaar trekken bij 70,5 graden Celsius wordt hier gebruikt. Na het trekken van de pipet, gebruik cirkelvormige pincetten om de punt te breken.
Inspecteer vervolgens de pipet onder een dissectiemicroscoop om er zeker van te zijn dat er geen ruwe randen zijn. Indien nodig kan de punt worden afgeschuind met behulp van een slijpsteen. Plaats vervolgens de gegoten pipetten gedurende 15 minuten onder een UV-lamp.
Nadat de 15 minuten zijn verstreken, markeer de pipet twee millimeter vanaf de rand van de punt met een fijne punt marker. Bereid ten slotte een 0,1 gewicht per volume fast groene oplossing voor door steriele gefilterde 0,9% steriele zoutoplossing te mengen met droge, snelle groene anesthesie. Een nul tot één dag oude pup, een glazen petrischaal voorgekoeld tot vier graden Celsius en geplaatst op west ijs. Na ongeveer vijf minuten bepaalt u de staat van anesthesie door gebruik te maken van de voetprikrespons.
Als er geen beweging optreedt, begint u met de intraventriculaire injectie. Combineer de fast groene oplossing met de DNA-oplossing en pipetteer één tot twee microliters op biofilm. Het is belangrijk dat dit net voorafgaand aan de injectie wordt gedaan, aangezien de combinatie van fast groene oplossing met DNA kan resulteren in snelle verdamping en kristallisatie met de daaropvolgende blokkering van glazen pipetten, aspireer het volledige aliquotvolume met een microfilmspuit en laad de glazen pipet op een onder druk staande injector.
Vastgrijp nu zachtjes de kop van de pup tussen de duim en wijsvinger van de laatste dominante hand. Schakel vervolgens de lamp in en houd de kop van de pup net buiten de lichtbundel. Als de ventrikels niet duidelijk zichtbaar zijn, bevochtig de kop met steriele zoutoplossing om de hoeveelheid licht die door de hoofdhuid wordt gereflecteerd te verminderen.
Vervolgens brengt u met de dominante hand de naald in de nabijzijde laterale ventrikel in. De injectieplaats moet ongeveer op gelijke afstand van de OID-naad en het oog liggen, en twee millimeter lateraal van de sagittale naad. Breng de getrokken pipet naar de twee millimeter markering voor een P nul pop, wat zou moeten zorgen voor penetratie in de laterale ventrikel.
Achtervulling van CSF in de pipet kan optreden als gevolg van de afgifte van intracraniale druk. Als dit gebeurt, ontspant u de greep op de kop van de POP om de druk te verminderen en de injectie van het plasmide te vergemakkelijken. Zodra de pipet optimaal is ingebracht, injecteert u ongeveer 0,5 microliter plasmide in de laterale ventrikel.
Stel de spanning van de elektro-operatiegenerator in op vijf vierkante pulsen, 50 milliseconden per puls en 100 volt met 50 milliseconde intervallen. De ruimtelijke specificiteit van plasma-elektro-operatie wordt gegeven door de richting van de ladingsoverdracht, dus ruimtelijke overwegingen moeten worden gegeven aan de plaatsing van de elektroden gezien hoe divers de cellen van de SVZ zijn. Er zijn veranderingen gemeld in termen van cellijn en proliferatie in de ventrale dorsale naar CAU-locaties.
Na injectie van het plasmide dompelt u de pincetelektroden in PBS om de ladingsoverdracht te maximaliseren en brandwonden te voorkomen die worden veroorzaakt door resistiviteit. Plaats vervolgens de positieve elektrode op de dorsale laterale wand van de schedel nabij het oor en dompelt de laterale naar het cytoplasma injectie. Plaats vervolgens de negatieve elektrode op de contralaterale hemisfeer ventrale laterale naar de pop snuitje.
Deze figuur toont de juiste oriëntatie van negatieve en positieve elektroden ten opzichte van de x, y, Z-as op de geïnjecteerde pup. Begin de stroomoverdracht door op het pulsen voetschakelaarpedaal te drukken en veeg de elektroden van dorsaal naar lateraal met intervallen van ongeveer 25 graden. Zodra de elektroporatie voltooid is, plaatst u alle geëlektroporiseerde pups gedurende vijf minuten op een verwarmingskussen.
Draai de pups voorzichtig om de 30 seconden met milde stimulatie. Deze afbeelding toont de laterale ventrikel van een neonatale muis 24 uur na elektroporatie van een EGFP coderende vector. De elektro gewaardeerde cellen fluoresceren groen.
Hier zien we de laterale ventrikel gelabeld LV 28 dagen na elektroporatie van Cree Recombinase en GFP coderende plasmiden in muizen die een stopcode dragen op stroomopwaarts van TD tomaten recombinatie induceert expressie van TD tomaten gezien in rood, opeenvolgende verdunning van plasmide resulterend in enkele resterende EGFP positieve SVZ cellen of genomisch geëxprimeerde TD tomaten is permanent geëxprimeerd. Verdunning van plasmide, DNA getoond in groen is duidelijk gezien dat meer cellen in de granulacellaag van de reukbol gelabeld OB, het genomische marker TD to
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een minimaal invasieve techniek, bekend als neonatale subventriculaire zone elektroporatie, die genetische manipulatie van neurale stamcellen in neonatale pups mogelijk maakt. De methode omvat het injecteren van plasmide DNA in de laterale ventrikels en het toepassen van elektrische stroom om DNA-opname door de cellen te vergemakkelijken.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Genetische manipulatie
- Stamcellenonderzoek
Achtergrond
- Neurale stamcellen in de subventriculaire zone (SVZ) zijn cruciaal voor neurogenese.
- Traditionele methoden voor genetische manipulatie kunnen tijdrovend en duur zijn.
- Deze techniek biedt een snel en efficiënt alternatief voor het labelen en bestuderen van deze cellen.
- Elektroporatie verbetert de aflevering van DNA in cellen, waardoor experimentele resultaten verbeteren.
Doel van het onderzoek
- Om moleculaire bestanddelen van SVZ neurale stamcellen genetisch te labelen en te manipuleren.
- Om moleculaire paden te onderzoeken die het gedrag van stamcellen reguleren.
- Om een kosteneffectieve methode te bieden voor het bestuderen van neurogenese.
Gebruikte methoden
- Injectie van plasmide DNA in de laterale ventrikel met behulp van een glazen pipet.
- Toepassing van elektrische pulsen om DNA-opname door neurale stamcellen te vergemakkelijken.
- Gebruik van immunohistochemie en microscopie om veranderingen in celgedrag te visualiseren.
- Bewaking van celbestemming, proliferatie, migratie en rijping na elektroporatie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle labeling van SVZ neurale stamcellen met fluorescente markers.
- Aangetoonde veranderingen in celbestemming en proliferatie als reactie op elektroporatie.
- Inzichten in de moleculaire mechanismen die neurogenese beheersen.
- De voordelen van deze techniek boven traditionele methoden voor genetische manipulatie benadrukt.
Conclusies
- Neonatale subventriculaire zone elektroporatie is een waardevol hulpmiddel voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- Deze methode maakt efficiënte genetische manipulatie van neurale stamcellen mogelijk.
- Het opent nieuwe wegen voor het bestuderen van de dynamiek van neurogenese en stamcelbiologie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Neonatal subventricular zone electroporation enables rapid, cost-effective genetic manipulation of neural stem cells, supporting early-stage target validation in neurogenesis research. The technique provides a scalable alternative to transgenic models, reducing time and resource investment in preclinical target de-risking. It enhances predictive confidence by allowing direct interrogation of molecular pathways in a disease-relevant postnatal mammalian system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of molecular pathways regulating neural stem cell proliferation, differentiation, migration, and maturation.
- Operational Value: Provides rapid, robust labeling of SVZ neural stem cells and progeny for downstream phenotypic analysis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitatively assessable cellular readouts via immunohistochemistry, microscopy, and electrophysiology to evaluate genetic manipulations.
- Operational Value: Supports assay standardization through reproducible electroporation parameters and consistent DNA delivery to the lateral ventricle.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates mechanistic de-risking by linking genetic perturbations to cellular phenotypes in a postnatal rodent forebrain model.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of electroporated cells and their progeny, supporting biomarker-aligned outcome assessments.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven manipulation of neural stem cells prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports target validation through direct genetic manipulation of SVZ neural stem cells and quantification of fate, proliferation, migration, and maturation changes.
- Screening: Delivers standardized, reproducible transfection efficiency for consistent compound or genetic perturbation screening in neural stem cell-derived systems.
- Analytics: Generates multiplexed readouts (fluorescent labeling, electrophysiological migration, immunohistochemical maturation) enabling comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects discovery-phase mechanistic insights to preclinical continuity via permanent genomic reporters (e.g., TD tomato) and dilution-tracked plasmid expression.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative target interrogation across multiple genetic constructs and timepoints.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct observation of stem cell behavior changes in an intact neonatal niche.
- Operational Value: Standardization via defined electroporation parameters (5 pulses, 50 ms, 100 V) and reproducible DNA injection volumes (0.5 µL).
- Strategic Value: Reduced biological risk in go/no-go decisions by enabling rapid, cost-effective target de-risking versus transgenic model generation.
- Portfolio Impact: Accelerates prioritization of neurodevelopmental targets by providing early functional evidence in a disease-relevant system.
Implementation Considerations
- Required expertise in neonatal pup handling, microsurgery, and electrophysiology-based injection techniques.
- Need for precision instrumentation including pipette pullers, microinjectors, and electroporation generators with pulse control.
- Standardization of DNA preparation (high purity, endotoxin-free, optimal concentration) and electrode placement for consistent charge transfer.
- Adaptation considerations across rodent strains and developmental timepoints (P0-P1) to maintain ventricular access and cell targeting efficiency.
- Practical limitations include variable transfection efficiency due to ventricular anatomy and CSF dynamics, requiring operator training for reproducibility.
