Name: Murine Spinotrapezius model om de invloed van arteriolaire Ligatie beoordelen op microvasculaire functie en Remodeling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 43 s
Description: Leer een murine spinotrapezius ligatiemodel om microvasculaire functie en remodeling te bestuderen met intravitale en confocale microscopie. Dit model onderzoekt ischemische vaataanpassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij erkennen Kevin Macleod voor het gebruik van zijn creatieve commons licentie muziek in de bijbehorende video, met inbegrip van (in volgorde van verschijning) zijn tracks &quot;Airport Lounge&quot;, &quot;Achtergrond&quot; en &quot;Evening Melodrama.&quot; We willen ook graag Ndubisi Okeke en Frederick Torstrick erkennen voor hun hulp bij de operatie video.

1. Spinotrapezius Feed Artery Ligatie Chirurgie <ol><li> Verdoof de muis door intraperitoneale injectie. In een 0,5 ml injectiespuit formuleren: 0,06 ml van 100 mg / ml ketamine 0,03 ml van 20,0 mg / ml xylazine 0,01 ml van 0,4 mg / ml Atropine 0,30 ml 0,9% zoutoplossing. Dosis: 0,01 ml * per gram lichaamsgewicht, ip </li></ol> * Dosis variabele op muizenstam en voorraad, dienovereenkomstig aan te passen, zodat de muis herstel is binnen een uur van inductie. <ol start="2"><li> Breng standaard oogzalf om het hoornvlies uitdroging te voorkomen. </li><li> Verwijder haar van de rug met behulp van knippen klippers, gevolgd door korte toepassing van ontharingscrème. </li><li> Desinfecteer het chirurgische veld met chloorhexidine of povidon-jodium. Alternatieve povidonjood met ethanol drie keer, eindigend met povidonjood. </li><li> Breng de muis om de eerder bereide chirurgische werkblad, met verwarming pad en steriel lakenop zijn plaats. </li><li> Maak een lineaire incisie (3-5 mm) door de dorsale huid ongeveer 5 mm caudaal van de benige prominentie van het schouderblad met iris schaar en standaard patroon pincet (bijvoorbeeld FST, 11271-30) door tenting het weefsel en het snijden parallel aan de wervelkolom. Het doel incisie site kan worden geïdentificeerd door transdermale visualisatie van de dorsale vetkussentje als pigmentatie van de huid toelaat; gesneden op de caudale rand van het vet pad. Vouw de incisie als nodig is, en uit te breiden door middel van secundaire huidlagen met behulp van de lente schaar. <ol><li> Anatomische kennis - De spinotrapezius spier ligt dorsaal en strekt zich uit van T4 naar L3 langs weerszijden van de wervelkolom. De voorste rand strekt zich zijdelings tot ongeveer het schouderblad. De spier versmalt in de caudale richting zodat de dorsale rand mediaal ligt aan de voorste rand en kan liggen gelijk met de wervelkolom. Twee dikke pads zijn ook belangrijk om op te merken, het leggen direct dorsaal en ventraal van de spinotrapeziusspieren naar de craniale half. </li><li> Ontsteking door de incisie is aangetoond geen effect op de vasculaire remodellering reactie als sham operatie ligatie toonde geen verandering in hermodellering van het spinotrapezius vasculatuur. Twee ruimtelijke factoren dragen bij tot dit resultaat. Eerst wordt de incisie wordt verwijderd door 5 mm in de craniale richting van het gebied waar de vasculaire respons in de spier kenmerkend onderzocht. Bovendien wordt de incisie op de dorsale huid gescheiden van het vaartuig ligatieplaats door een ventrale vetkussentje dat ligt bovenop de craniale derde van de spinotrapezius spier. </li></ol></li><li> Spoel de incisie met de oplossing verwarmd Ringer&#39;s om spieren uitdroging te voorkomen. Toepassing van vasodilatoren zoals papaverine zal helpen bij het visualiseren van de beoogde slagader voor ligatie. </li><li> Onder een dissectiemicroscoop een tang om bot te ontleden en te scheiden (maar niet verwijderen) de dorsale witte vet pad van de onderliggende muscheid weefsel om de vasculatuur visualiseren als het binnenkomt en verlaat de spinotrapezius op de zijkant. </li><li> Zoek de beoogde slagader, die samen met een of twee gepaarde aderen, passeert het vetkussentje die ventraal van de spinotrapezius op weg in de zijrand van de spier. Deze slagader voedt een aanzienlijk deel van de caudale helft van de spier, die kan worden bevestigd door het afwegen en het vervangen van de spieren om het pad van de slagader nemen in de spier. De doellocatie voor ligatie het deel van de slagader die uit de ventrale vetkussentje en die in de spieren, en is vrij toegankelijk in deze regio. De slagader-ader pair moeten voorzichtig worden gescheiden van de ventrale vetkussentje in deze regio. Merk op dat de spinotrapezius wordt gevoed door meerdere slagader-ader paren, met inbegrip van schepen die dwars ofwel de dorsale en ventrale vetkussentjes. Zorg ervoor dat u deze schepen verstoren. <ol><li> Meerdere indicatoren kunnen worden gebruikt om onderscheid slagadervan ader. Een van de beste methoden is om voorzichtig bloedstroom belemmeren de microprobe en weg stroomopwaarts bewegen van de spier; stroom wordt niet hervat in de slagader totdat de obstructie wordt losgelaten. Kleur kan ook worden gebruikt als vaatwanden bevatten witte omhulsel van bindweefsel dat slagaders missen. Verder kan men overwegen de diameter vóór de toepassing van vasodilator als aderen doorgaans groter. </li></ol></li><li> De slagader is typisch dicht bij de gekoppelde ader; stompe dissectie met een microprobe en # 5 forceps om een ​​ongeveer 5 mm segment isoleren, door het passeren van de microprobe achter de slagader en met de punt naar een grotere afstand in de natuurlijke make kloof tussen de slagader en ader. Dit is de opening waardoor de hechting wordt geregen. </li><li> Met 10-0 enkeldraadse hechtdraad en naaldhouder plaats een ligatie in de voeding slagader (~ 70 urn diameter) naar het proximale uiteinde van het segment ontleed met een chirurg knoop. Place extra ligatie naar het distale uiteinde van de slagader ontleed segment voldoende scheiding tussen ligaturen zorgen voor doorsnijden van de slagader. <ol><li> De kleinschalige geassocieerd met de voeding spinotrapezius slagader leidt tot verhoogde chirurgische moeilijkheden tegen ligatie van een groter vat zoals de femorale arterie. Onervaren chirurgen in het bijzonder zullen hoge tarieven van avulsie, onbedoelde bloedingen en andere chirurgische complicaties. Van bijzonder belang is de moeilijkheid om en snij de kleurloze slagader na doorstroming is belemmerd net voor het snijden. Om deze redenen is het plaatsen van 2 ligaturen aangeraden voor gewend aan de procedure, omdat de chirurg een visuele in plaatsbepaling waarbij de slagader en een bevestiging van de snede met de gemakkelijk waarneembare scheiding van de 2 ligaturen doorsnijden. Echter kan een ervaren chirurg vindt een ligatuur voldoende, mits zij kunnen duidelijkidentificeren en snijd de slagader stroomafwaarts van de ligatuur. Hoewel deze techniek vermindert het risico van onopzettelijk een nabijgelegen knikken vaartuig met de scherpe ligatie hechting is niet zonder nadelen, zoals verhoogde moeilijkheid bevestiging van de arterie werd doorsneden. </li></ol></li><li> Controleer ligatie door het observeren vermindering van bloedstroom (verhinderd RBC kolom) stroomafwaarts van de ligatieplaats (dwz in de spier). </li><li> Schaar doorsnijden met de geligeerde slagader tussen de ligaturen. Als er slechts een ligatuur werd geplaatst (11a), gesneden met uiterste zorg in stroomafwaartse richting. </li><li> Geneesmiddel beladen plain-film (1 mm) kan worden geplaatst stroomafwaarts (caudaal) als onderdeel van experimentele procedure. </li><li> Plaats de ontheemden fascia en vetweefsel naar hun oorspronkelijke stand. </li><li> Sluit de huid incisie met behulp van 8-0 niet-resorbeerbare hechtingen. Plaats dan de muis in een voorbereide verwarmde herstel kooi onder observatie en het toedienen van een appropriate analgeticum zoals bupivacaïne, 0,02-0.05 ml 0,25% lokale infiltratie. </li></ol> 2. Spinotrapezius intravitale Microscopy, in situ <ol><li> Verdoven de muis in een inductiekamer met 3-4% isofluraan verdampt in 100% zuurstof met een debiet van 3-4 L · min -1. <ol><li> Het gebruik van inhalatie anesthesie voorkeur functionele metingen omdat er minder cardiovasculaire depressie dan met injecteerbare anesthetica. Als inhalatie verdoving niet beschikbaar, langwerkende injecteerbare anesthetica, zoals natriumpentobarbital de voorkeur aan herhaalde injecties voorkomen wanneer het dier is gepositioneerd. </li></ol></li><li> Eenmaal verdoofd, voortdurend isofluraan te leveren door middel van een verdoving masker (aka neuskegel) bij het ​​onderhoud concentraties (meestal ~ 2%) en het debiet van 0,5-1 L · min -1. <ol><li> Muizen voornamelijk ventileren door middel van hun neus, dus het is alleen negessary om hun neus te bedekken met de narcose masker middenrif. </li></ol></li><li> Verwijder indien nodig haar van de rug met behulp van knippen clippers en ontharingscrème. </li><li> Vervoer het dier om de warmte pad. <ol><li> Het is belangrijk om muizen in een euthermic toestand te houden om koude-geïnduceerde vasoconstrictie voorkomen, dit kan worden bereikt door lichten, water hete lucht pads, magnetron verwarmt pads, etc. </li></ol></li><li> Steek de rectale temperatuur probe en stel thermo-controller tot 35 ° C. </li><li> Maak een incisie in de huid aan het caudale einde van de spinotrapezius met iris schaar en standaard patroon tang. </li><li> Craniaal Verleng de incisie om het vet pad, het creëren van een hoefijzer incisie, en bedek de huid flap met plastic omslag om uitdroging te voorkomen. </li><li> Blunt ontleden het onderhuids bindweefsel met een pincet en de lente schaar om de zichtbaarheid te maximaliseren. </li><li> Plaats stimulerende elektroden zo dicht Together mogelijk de grootte van het huidige veld te minimaliseren en plaats ze op het caudale einde van het blootgestelde spier juist lateraal aan de wervelkolom. </li><li> Voer een test stimulatie om plaatsing van de elektroden te bevestigen met behulp van een elektrode data-acquisitiesysteem, elektrode stimulus isolator, en computer controller, met vierkante golven van een 200 psec duur, 2 mA amplitude, geleverd met 1 Hz. </li><li> Plaats plastic folie over de blootliggende spieren om uitdroging te voorkomen. </li><li> De tijdsduur van een 30 min periode waarin het vaartuig diameters zal evenwicht. </li><li> Plaats de intravitale microscoop over de spinotrapezius spier aan de vasculaire architectuur te bekijken. <ol><li> Als u een immersie lens, plaats een druppel PBS tussen de doelstelling en de plastic verpakking. </li></ol></li><li> Starten van boven de belangrijkste arteriole (het grootste schip zichtbaar), manipuleren van de fase in het XY-vlak naar het schip van belang vinden. <ol><li> Visualiseren kleine arterioles met gereflecteerd licht microscopie vereist meer contrast dan door de rode cel kolom. We gebruiken primair een zijstroom dark-field imaging microscoop microvasculaire contrast, maar ook het contrast kan worden verbeterd met een gereflecteerd-licht fluorescentiemicroscoop na de intraveneuze injectie van een hoog molecuulgewicht fluorescent dextran. </li></ol></li><li> Na de 30-min evenwicht, het nemen van een foto / video van het schip van belang. </li><li> Stimuleren spier met blokgolven van 200 psec duur 2 mA amplitude leveren op 8 Hz, gedurende 90 sec, zoals hierboven beschreven. </li><li> Leg een ander beeld / video direct na stimulatie en blijven elke minuut vast te leggen tot het schip is teruggekeerd naar de rustdiameter, ~ 10 minuten. </li><li> Herhaal stap 6-18 via de contralaterale spier. </li><li> Data analyse kan worden uitgevoerd in real time video beugels of off-line met beeldanalyse software. </li><li> Euthanaseren de muis te volgening IACUC protocol. </li></ol> 3. Spinotrapezius Tissue Oogst en fixatie <ol><li> Verdoven muizen door intraperitoneale injectie; samenstelling als in Spinotrapezius Feed Artery Ligatie stap 1. </li><li> Maak een insnijding enkele millimeters craniaal van de benige prominentie van de schouder van de muis mes met iris schaar en standaard patroon tang. Vouw de incisie lateraal en caudaal aan beide zijden. </li><li> Laat de huid van dorsale romp door voorzichtig als gevolg van de huid en het snijden van de oppervlakkige fascia. </li><li> Stompe dissectie tot dorsale vetweefsel met standaard forceps verwijderen en vervolgens de spier geven en eveneens ontleden ventrale vetweefsel. </li><li> Verwijder fascia bovenliggende de spier met behulp van een tang en de lente schaar. Deze stap kan moeilijk en tijdrovend zijn, maar is belangrijk voor het verbeteren immunofluorescentie kleuring en beeldvorming. Het houden van het weefsel gehydrateerd kunnen verlichten verwijdering van de fascia. </li><li> Plaatsende laterale rand van de spier en stompe dissectie tot de spinotrapezius spier scheiden van het vet pad dat ligt ventrale aan. </li><li> Ga verder met de stompe dissectie in een craniaal naar caudaal. Merk op dat een aantal bloedvaten in en uit dit ventrale oppervlak van de spier, als perfusie nodig is, dient te worden uitgevoerd voordat doorsnijden deze schepen. Merk ook op dat in de caudale helft van de spier, de laterale rand inserts in de spier liggende ventrale aan. Sommige snijden kan nodig zijn langs deze grens om volledig te definiëren en te bevrijden van de rand. </li><li> Accijnzen de spinotrapezius spier. Om dit te doen: <ol><li> Vrije de zijrand van de spier zoals hierboven beschreven. </li><li> Snijd dwars over de meeste craniale de spier mate. </li><li> Snijd langs de mediale rand (langs de ruggengraat), in het sagittale vlak. </li></ol></li><li> Herhaal de procedure stappen 4-9 op de contralaterale spier, en dan euthanaseren de mouse door een IACUC goedgekeurde methode. </li><li> Bevestig de weefsels op met gelatine beklede objectglaasjes door onderdompeling in gekoelde methanol (4 ° C) of in een 4% paraformaldehyde / gedeïoniseerd water oplossing bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. <ol><li> Alternatief kan perfusiefixatie worden. Voorafgaand aan stap 2, doet een thoracotomie een insnijding in het rechter atrium en perfuseren vasculatuur met 5 ml 1 x Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1 mM CaCl2 en 2% heparine via de linker ventrikel, gevolgd door 5 ml van 4 % paraformaldehyde voor schip fixatie en tenslotte 5 ml van 1 x Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1 mM CaCl2 7. </li></ol></li><li> Onmiddellijk na fixatie, wassen specimen vier keer 20 min elk met 0,01 M fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met 0,1% saponine. </li></ol>

<ol><li>Bailey, A. M., O'Neill, T. J., Morris, C. E., Peirce, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arteriolar+Remodeling+Following+Ischemic+Injury+Extends+from+Capillary+to+Large+Arteriole+in+the+Microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Arteriolar Remodeling Following Ischemic Injury Extends from Capillary to Large Arteriole in the Microcirculation.</a> Microcirculation. 15, 389-404 (2010).</li>
<li>Bruce, A. C., Peirce, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+Thrombin+Delivery+Promotes+Collateral+Capillary+Arterialization+and+Tissue+Reperfusion+in+the+Murine+Spinotrapezius+Muscle+Ischemia+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Exogenous Thrombin Delivery Promotes Collateral Capillary Arterialization and Tissue Reperfusion in the Murine Spinotrapezius Muscle Ischemia Model.</a> Microcirculation. 19, 143-154 (2012).</li>
<li>Mac Gabhann, F., Peirce, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collateral+capillary+arterialization+following+arteriolar+ligation+in+murine+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Collateral capillary arterialization following arteriolar ligation in murine skeletal muscle.</a> Microcirculation. 17, 333-347 (2010).</li>
<li>Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+Model+of+Hindlimb+Ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine Model of Hindlimb Ischemia.</a> J. Vis. Exp. (23), e1035(2009).</li>
<li>Madeddu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+myocardial+and+limb+ischemia%3A+diagnostic+end-points+and+relevance+to+clinical+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Vascul.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Murine models of myocardial and limb ischemia: diagnostic end-points and relevance to clinical problems.</a> Vascul. Pharmacol. 45, 281-301 (2006).</li>
<li>Cardinal, T. R., Kurjiaka, D. T., Hoying, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+hindlimb+ischemia+impairs+functional+vasodilation+and+vascular+reactivity+in+mouse+feed+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Physio%22%5BJournal%5D)">Chronic hindlimb ischemia impairs functional vasodilation and vascular reactivity in mouse feed arteries.</a> Front. Physio. 2, 91(2011).</li>
<li>Sefcik, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Activation+of+Sphingosine+1-Phosphate+Receptors+1+and+3+Promotes+Local+Microvascular+Network+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Selective Activation of Sphingosine 1-Phosphate Receptors 1 and 3 Promotes Local Microvascular Network Growth.</a> Tissue Eng. Part A. 17, 617-629 (2011).</li>
<li>Deindl, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Ischemia+and+of+Hypoxia-Inducible+Genes+in+Arteriogenesis+After+Femoral+Artery+Occlusion+in+the+Rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Role of Ischemia and of Hypoxia-Inducible Genes in Arteriogenesis After Femoral Artery Occlusion in the Rabbit.</a> Circulation Research. 89, 779-786 (2001).</li>
<li>Chalothorn, D., Zhang, H., Smith, J. E., Edwards, J. C., Faber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+Intracellular+Channel-4+Is+a+Determinant+of+Native+Collateral+Formation+in+Skeletal+Muscle+and+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Chloride Intracellular Channel-4 Is a Determinant of Native Collateral Formation in Skeletal Muscle and Brain.</a> Circulation Research. 105, 89-98 (2009).</li>
<li>Scholz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+Arteriogenesis+and+Angiogenesis+to+Postocclusive+Hindlimb+Perfusion+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Contribution of Arteriogenesis and Angiogenesis to Postocclusive Hindlimb Perfusion in Mice.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 775-787 (2002).</li>
<li>McClung, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle-specific+genetic+determinants+contribute+to+the+differential+strain-dependent+effects+of+hindlimb+ischemia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle-specific genetic determinants contribute to the differential strain-dependent effects of hindlimb ischemia in mice.</a> Am. J. Pathol. 180, 2156-2169 (2012).</li>
<li>Dokun, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+trait+locus+%28LSq-1%29+on+mouse+chromosome+7+is+linked+to+the+absence+of+tissue+loss+after+surgical+hindlimb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia.</a> Circulation. 117, 1207-1215 (2008).</li>
<li>Faber, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+causes+collateral+rarefaction+and+increased+severity+of+ischemic+injury+in+multiple+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Aging causes collateral rarefaction and increased severity of ischemic injury in multiple tissues.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31, 1748-1756 (2011).</li>
<li>Peng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender+differences+affect+blood+flow+recovery+in+a+mouse+model+of+hindlimb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Gender differences affect blood flow recovery in a mouse model of hindlimb ischemia.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 300, 2027-2034 (2011).</li>
<li>Li, Y., Guan, H., Hazarika, S., Liu, C., Annex, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+angiogenesis+following+hind-limb+ischemia+in+diabetes+mellitus+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Chin.+Med.+Sci.+J%22%5BJournal%5D)">Impaired angiogenesis following hind-limb ischemia in diabetes mellitus mice.</a> Chin. Med. Sci. J. 22, 232-237 (2007).</li>
</ol>

De auteurs verklaren zij hebben geen concurrerende financiële belangen.

De muis spinotrapezius ligatie hier gepresenteerde model is een effectieve klein diermodel om de functionele en structurele aanpassingen die het gevolg zijn bestuderen vanuit een arteriële occlusie. Dit model is een aanvulling op de veel gebruikte achterbeen ischemie model 4, in dat het een hele spier uitzicht intact microvasculaire netwerken met een hoge ruimtelijke resolutie. Bovendien, omdat deze spier bevindt zich net onder de dorsale huid, het is toegankelijk voor seriële beeldvorming met intravitale microscopie, en aan de lokale drug delivery via superfusie of dunne film implantatie 2. Deze eigenschappen maken het een aantrekkelijk klein diermodel om de effecten van nieuwe therapeutische targets op vasculaire remodellering en functionele vasodilatatie na arteriële occlusie bestuderen. Merk op dat voorzichtigheid moet worden gebruikt bij het vergelijken van gegevens verkregen in de spinotrapezius ligatie model gegevens verkregen in het achterbeen ligatie model te wijten aan een aantal belangrijke derschillen. Ten eerste worden de spinotrapezius spieren stabiliserende spieren, en ze verschillen van de beenspieren in termen van functie en type vezel distributie. Onze groep eerder aangetoond dat het arteriolaire ligatie in de spinotrapezius spier minder of verwaarloosbare hypoxie in stammen met goed ontwikkelde zekerheid arteriolaire netwerken ten opzichte van de hypoxie waargenomen in de achterpoot na de dijslagader ligatie in de achterpoot model 1,8 creëert - 10. We hebben ook aangetoond dat de ligatie model spinotrapezius een andere remodeling respons in Balb / c muizen in vergelijking met C57BL / 6 muizen met Balb / c muizen netwerken remodeling door capillaire collateralization en C57BL / 6 remodeling door vergroting van bestaande verbindingen arteriolaire 3 levert. Er is een interessante parallel tussen deze observaties en de gegevens op achterbeen ligatie modellen, waarin Balb / c muizen ervaren een langdurige perfusie herstel na ligatie in vergelijking met C57BL / 6 muizen 9,11,12 &lt;/ Sup&gt;. In andere modellen van weefsel ischemie, muis 13 jaar geslacht 14 en de aanwezigheid van de ziekte 15 ook invloed hebben op de weefsels &#39;reacties op arteriolaire occlusie, hoewel we nog niet getest deze voorspellers in de spinotrapezius ligatie model. Anderzijds de grootte van de slagader die wordt geligeerd in de spinotrapezius model is aanzienlijk kleiner dan de femorale slagader, en dus de invloed ligatie een kleiner volume weefsel die verder downstream, dus op een lager niveau van de bloedsomloop boom in de spinotrapezius opzichte van de achterpoot 3. Daarom moet de anatomische verschil in de locatie van de ligatie van deze twee modellen worden beschouwd als vergelijking van de respectieve fysiologische reacties (bv. vasculaire remodellering) deze interventie. Ten derde kan de dikte van de spinotrapezius mogelijk zuurstof naar de unperfused gedeelte van het weefsel te bereiken van naburigeweefsel, vergeleken met de gecombineerde ischemie en hypoxie in de achterpoot model zoals hierboven 3. Vierde, het herstel van stroom naar het deel van de spinotrapezius stroomafwaarts van de ligatie is sneller dan in de achterpoot ligatie. De spinotrapezius ligatie model is een uniek chronische model en moet niet verward worden met andere modellen van voorbijgaande arteriële occlusie of modellen van ischemie-reperfusie schade. Wij het mogelijk dit model aan dit soort voorwaarden passen, maar dit valt buiten het toepassingsgebied van werk hier voorgesteld zijn. Tenslotte we waarschuwen rechtstreeks verband pre-klinisch onderzoek in dit model klinische verschijnselen van ischemische ziekte in mensen, vooral bij gebruik van jonge en overigens gezonde muizen en vanwege de inherente fysiologische grenzen zoals hogere hartslag 5. Toch beschouwen wij dit nieuwe model als een waardevol instrument voor het blootleggen van de basismechanismen van weefsel reacties op ligatie en het identificeren van de mogelijkheden van derapeutic targets in een in vivo omgeving. Naast de chirurgische aantekeningen in de voeding spinotrapezius slagader ligatie procedure (anatomische noot (6a), onderscheiden van de slagader ader (9a) en het gebruik van een ligatuur (11a)), nog andere aspecten van de procedure voordeel discussie. Eerst wordt de eerste incisie gemaakt over de dorsale vetkussentje rand (of meerdere mm caudaal van het schouderblad als transdermale visualisatie niet mogelijk is) idealiter zo klein als de chirurg voelt, en uitgebreid in de procedure indien nodig. Deze praktijk minimaliseert het hechten moeten de incisie, die handig voor de chirurg sluiten vermindert procedure tijd en ook minder irriterend aan het dier tijdens herstel. Alternatief kan een grotere incisie nodig zijn volgens voorkeur van de chirurg omdat de spier kunnen gemakkelijker te vinden met een geëxpandeerde veld. In dit geval kan de insnijdingprofiteren van een hoefijzer vorm met een mediale open gezicht te laten vouwen naar de wervelkolom. Tijdens het maken van de huid incisie en die zich uitstrekt door de secundaire huidlagen, als een oppervlakte-beschadigd en veroorzaakt bloedingen, oefen lichte druk met een steriel gaasje en bieden tijd voor hemostase. Ook van belang is het belangrijk om het weefsel te behandelen met de minimum vereiste kracht, en waar mogelijk houden met forceps dichter bij de spier laterale rand en de beoogde afstand van ischemische zone. Deze praktijk kan worden voorkomen crush, wat kan leiden tot extra-gemedieerde inflammatoire weefselreacties dat de vasculaire remodellering respons opgewekt door de arteriële ligatie kunnen beïnvloeden. Concluderend hebben we aangetoond dat het gebruik van de murine spinotrapezius spier als model voor de behandeling van chirurgische vasculaire en weefsel reacties op arteriolaire ligatie. Dit model is geschikt voor intravitale beoordeling van vasculaire wijzigingen (Zo functionele vasodilatatie) en voor ex vivo bepaling van vasculaire veranderingen (bijvoorbeeld immunofluorescente imaging en kwantificatie van vasculaire netwerken). Zowel preklinische en klinische studies hebben aangetoond dat een individu reactie arteriolaire obstructie (zoals via ligatie in muizen of atherosclerotische plaques bij mensen) hangt af van hun leeftijd de aanwezigheid of afwezigheid van ziekte (bijvoorbeeld diabetes mellitus) de diameter van de verstopte slagader de genetische samenstelling van het individu en de metabolische vraag van het weefsel 11-15. Murine modellen, zoals de hier gepresenteerde, gebruik maken van de onderzoeker van stam-specifieke anatomische en genetische verschillen en ziekte-specifieke fenotypes, die onderzoek faciliteert in deze complexe relaties.

Diermodellen van chronische ischemie waardevolle hulpmiddelen voor onderzoek naar de pathofysiologie van ischemische ziekten, zoals perifere vaatziekte, kransslagaderziekte en cerebrovasculaire ziekte. In knaagdieren, zoals de mens, arteriële occlusie leidt tot structurele remodellering van het vasculaire netwerk, inclusief arteriogenese en angiogenese. Bij gezonde en jongere patiënten, kan het remodelleren voldoende zijn om weefsel te redden van ischemie geïnduceerd letsel, maar co-morbiditeit, zoals diabetes kunnen ernstig in gevaar brengen remodeling en herstel. Inzicht in de mechanismen die ten grondslag liggen aan vasculaire remodellering gebeurtenissen is essentieel voor het ontwikkelen van therapieën die deze endogene revascularisatie processen te stimuleren. Momenteel dijbeenslagader ligatie of resectie in de achterpoot is de standaard techniek voor het bestuderen chronische ischemie geïnduceerde vasculaire remodellering in kleine dieren 4,5. Analyse van de diameter, connectiviteit, en de reactiviteit vande microvaatjes die het vasculaire netwerk stroomafwaarts van de geligeerde femorale slagader is echter moeilijk vanwege de dikte van de spieren. We hebben een arterieel ligatie model in de muis spinotrapezius muscle: eenzijdige ligatie van de zijdelingse invoer slagader in deze stabiliserende rugspier 1. De relatief dunne spinotrapezius (60-200 micrometer) vatbaar is voor en face immunokleuring voor de beoordeling van hele netwerk topologie met single-cell resolutie, waardoor een gedetailleerd onderzoek van vasculaire remodellering evenementen in de hele weefsel. De spinotrapezius is oppervlakkig en toegankelijk, en daarmee de schepen gemakkelijker door intravitale microscopie efficiënte karakterisering van het effect van remodeling en arteriolaire ligatie op vasculaire reactiviteit. In dit rapport beschrijven we in detail en demonstreren de muis spinotrapezius arteriolaire ligatie model. Zowel in vivo en ex vivo methods beoordeling na een operatie worden beschreven, waaronder meting van functionele vasodilatatie, waarvan is aangetoond worden verminderd onder ischemische condities 6 en immunofluorescente beeldvorming van gehele spier microvasculaire netwerk. We ook resultaten van twee afzonderlijke proefstudies om het nut van het model te tonen. Eerst hebben we gebruik gemaakt van de arteriële ligatie model een statistisch significante toename in vat tortuositeit in C57BL / 6 muizen (Figuur 2B) induceren. Tortuositeit stijgt tijdens arteriogenese in arteriole collateralen. In andere muizenstammen die kwetsbaarder zijn ischemie door het ontbreken van zekerheid arteriolen (bijvoorbeeld Balb / c) is waargenomen capillaire arterialization 10. Capillaire arterialization wordt door verhoogde diameters en de ontwikkeling van α-gladdespieractine reactiviteit. Tweede functionele elektrische stimulatie van de spier tot vasodilatatie in arteriolen van de terminal spinotrapezius (Figuur 3B).

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Iris schaar </td><td> FST </td><td> 14.090-09 </td><td> Type: Tool </td></tr><tr><td> Maat 7 tang </td><td> FST </td><td> 11.271-30 </td><td> Type: Tool </td></tr><tr><td> Maat 5 tangen </td><td> FST </td><td> 11.251-20 </td><td> Type: Tool </td></tr><tr><td> Lente schaar </td><td> Roboz </td><td> RS5671 </td><td> Type: Tool </td></tr><tr><td> Microprobe </td><td> FST </td><td> 10.140-03 </td><td> Type: Tool Kan zijn gesubstitueerd met rechte probe </td></tr><tr><td> Naaldhouder </td><td> FST </td><td> 12.500-12 </td><td> Type: Tool </td></tr><tr><td> Inductie kamer </td><td> JD Medical Dist. Co, Inc </td><td> IC-1086 </td><td>Type: Apparatuur </td></tr><tr><td> Eye Gel </td><td> Dechra </td><td> NDC 17033-211-38 </td><td> Type: Reagens </td></tr><tr><td> Warmte-pad </td><td> FST </td><td> 21.060-01 </td><td> Type: Apparatuur </td></tr><tr><td> Rectale temperatuursonde </td><td> FST </td><td> 21.060-01 </td><td> Type: Apparatuur </td></tr><tr><td> Stimulatie-elektroden </td><td> FHC </td><td> UEWSGCSE0N1M </td><td> Type: Apparatuur </td></tr><tr><td> Artisan&#39;s Polymer Clay </td><td> Polyform </td><td> N / A </td><td> Type: Apparatuur </td></tr><tr><td> PowerLab data-acquisitiesysteem </td><td> ADInstruments </td><td> ML 845 </td><td> Type: Apparatuur </td></tr><tr><td> Stimulus isolator </td><td> ADInstruments </td><td> FE 180 </td><td> Type: Apparatuur </td></tr><tr><td> LabChart </td><td> ADInstruments </td><td> ML S060 / 7 </td><td> Type: Software </td></tr&gt; <tr><td> Gereflecteerde licht fluorescentie microscoop </td><td> Olympus </td><td> BFXM </td><td> Type: Apparatuur </td></tr><tr><td> High MW fluorescent dextran </td><td> Sigma </td><td> FD250S-100MG </td><td> Type: Reagens </td></tr><tr><td> Video remklauwen </td><td> Colorado Video </td><td> 308 </td><td> Type: Apparatuur </td></tr><tr><td> Geautomatiseerde Vasculaire Analysis (AVA) </td><td> Microvision Medical </td><td></td><td> Type: Software </td></tr><tr><td> Anti-αSMA Geconjugeerd fluorofoor </td><td> Sigma </td><td> 1A4-Cy3 </td><td> Type: Reagens Klonale, 1:100 </td></tr><tr><td> Fluorescentiemicroscoop </td><td> Olympus </td><td> BFXM </td><td> Type: Apparatuur </td></tr><tr><td> Hoogmoleculaire fluorescent dextran </td><td> Sigma </td><td> FD250S-100MG </td><td> Type: Reagens </td></tr></tbody></table>

murine spinotrapezius model om de invloed van arteriolaire ligatie beoordelen op microvasculaire functie en remodeling

Murine Spinotrapezius Model to Assess the Impact of Arteriolar Ligation on Microvascular Function and Remodeling

De muizen spinotrapezius is een dunne, oppervlakkige skelet ondersteuning spier die zich uitstrekt van T3 tot en met L4, en is gemakkelijk bereikbaar via dorsale incisie in de huid. De unieke anatomie maakt de spinotrapezius nuttig voor het onderzoek van ischemische schade en de daaropvolgende microvasculaire remodellering. Hier tonen we een arterieel ligatie model in de muis spinotrapezius spier die werd ontwikkeld door ons onderzoeksteam en eerder gepubliceerde 1-3. Voor bepaalde kwetsbare muizenstammen, zoals Balb / c muis deze ligatie operatie maakt betrouwbaar skeletspier ischemie en dient als platform voor het onderzoeken van therapieën die revascularisatie stimuleren. Evaluatiemethoden ook aangetoond, inclusief het gebruik van confocale microscopie en intravitale. De spinotrapezius is zeer geschikt om een ​​dergelijke beeldvorming studies door zijn toegankelijkheid (oppervlakkige dorsale anatomie) en de relatieve slankheid (60-200 pm). De spinotrapezius spier kan worden gemonteerd en face, het vergemakkelijken vanbeeldvorming van hele spier microvasculaire netwerken zonder histologische coupes. We beschrijven het gebruik van intravitale microscopie metrics na een functionele vasodilatatie procedure verwerven; bijzonder de toename arterilar diameter als gevolg van spiercontractie. We tonen ook de procedures voor het oogsten en bevestigen van de weefsels, een noodzakelijke voorloper immunokleuring studies en het gebruik van confocale microscopie.

Een chirurgische gezien de hoofdader voeden van de spinotrapezius spier die ligatie ondergaat wordt getoond in figuur 1, met een etiket interessegebieden. Een voorbeeld confocaal beeld van het geoogst en immunogekleurd regio spier direct stroomafwaarts van de arterie geligeerd een week na ligatie gelegen is weergegeven in figuur 2A. Vergrote zekerheid arteriolen die gladde spier alfa-actine expressie gladde spiercellen (rood) beeldkarakteristiek tortuositeit na ligatie. Tortuositeit vaartuig, weergegeven als de verhouding tussen vaartuig weglengte en koord afstand (de lijn die over hetzelfde vat pad eindpunten), in de geligeerde spier (rechts) ten opzichte van geligeerde contralaterale spier verbeterd (Figuur 2B, n = 8) . Figuur 3 toont de resultaten van een studie waarbij terminal arteriole functionele vasodilatatie werd gemeten met intravitale microscopie. Zoals verwacht, arteriolaire di<html> ameter verhoogt na elektrische stimulatie geïnduceerde spiercontracties. <img src="/files/ftp_upload/50218/50218fig1.jpg" alt="Figuur 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50218/50218fig1highres.jpg"/> Figuur 1. Chirurgische veld van gereflecteerde spinotrapezius spier en diervoeders slagader. Het voer slagader wordt geligeerd op de twee plaatsen aangegeven A0. Tussen deze ligaturen en na belemmering van bloedstroom, wordt de slagader doorsneden ter plaatse aangegeven met A. De gerichte deel van de slagader overgangen van de ventrale vetkussentje, beschreven door C, in het spinotrapezius spier, beschreven door D, op de plaats aangegeven met pijl B. De stromingsrichting is aangeduid door gestippelde pijl E. ghres.jpg &quot;/&gt; Figuur 2. Confocale beeld van spinotrapezius spier microvasculaire netwerk voor pilot-studie van tortuositeit. (A) Geoogst en hele gemonteerde spier werd immunogekleurd voor gladde spier alfa-actine en belichte met behulp van confocale microscopie. Het gezichtsveld toont het gebied van spier direct achter de geligeerde arteriole 1 week na ligatie gelegen. Kronkelige vaten zijn duidelijk in de spier als gevolg van de ligatie (B) Pilot study resultaten tonen significant verhoogd (p = 0,035; een eenzijdige Student&#39;s t-test). Tortuositeit vertoond door microvaatjes in de geligeerde spier gemeten door vaartuig padlengte koord afstand verhouding voor een proef van C57BL / 6 muizen (n = 8) ten opzichte van contralaterale controle. <img src="/files/ftp_upload/50218/50218fig3.jpg" alt="Figuur 3" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50218/50218fig3highres.jpg"/> Figuopnieuw 3. Intravitale microscopie van functionele vasodilatatie in spinotrapezius arteriolen in vivo. (A) Vertegenwoordiger microfoto van spinotrapezius terminal arteriolen in rust (links) en onmiddellijk na beëindiging van 8 Hz spiercontractie (rechts). (B) Terminal arteriole diameter in rust ( 8,5 ± 0,5 urn, links) en direct daarna (11 ± 1 pm, midden) 90 sec spiercontractiemechanismen, aanmerkelijk gestegen arteriolaire diameter (p = 0,032, 1-tailed gepaarde t-test) in Balb / C muizen (n = 6). Procentuele verandering aangegeven (rechts).

We demonstreren a novel arteriële ligatie model in muizen spinotrapezius spier, inclusief een stap-voor-stap procedure en beschrijving van de vereiste instrumenten. We beschrijven de operatie en relevante uitkomstmaten met betrekking tot vasculaire netwerk remodeling en functionele vasodilatatie met intravitale en confocale microscopie.

Murine Spinotrapezius model om de invloed van arteriolaire Ligatie beoordelen op microvasculaire functie en Remodeling

The murine spinotrapezius is a thin, superficial skeletal support muscle that extends from T3 to L4, and is easily accessible via dorsal skin incision. ...

Perifeer vasculair lijden treft ongeveer 12 tot 14% van de populatie en komt vooral veel voor bij tabaksgebruikers en personen met diabetes, obesitas, hypertensie, een gevorderd stadium of atherosclerose. Het doel van deze chirurgische ingreep is om een model voor ischemie van de skeletspier te creëren door één van de drie voedende arteriën naar de caudale helft van de spiegelende spino trapezius-spier af te binden. Deze animatie toont de algemene locatie van deze arteriën en geeft de beoogde ligatieplaats aan in reactie op ischemie.Vasculair weefsel zal veranderingen ondergaan die kenmerkend zijn voor arterio-agenese, afhankelijk van de muizenstam. Dit omvat de vorming van overbruggende collateralen of een toenemende vaattortuositeit. We laten u ook zien hoe u een functionele vasodilatatieprocedure uitvoert op de spinale trapezius met behulp van intravitale microscopie.Dit omvat het zorgvuldig blootleggen van de spier, het plaatsen van de stimulerende elektroden met hun stroombron en controller, en vervolgens het opstellen van het beeldvormingsapparaat. Tot slot laten we zien hoe de spier wordt uitgesneden en beschrijven we een fixatieproces dat geschikt is voor immunochemische kleuring en beeldvorming. Hallo, mijn naam is Shane Pierce Kotler en ik ben associate professor aan de afdeling Biomedical Engineering van de University of Virginia in Charlottesville.Hoi, ik ben Kyle Martin. Ik ben een promovendus in het lab van Shane en ik zal het model voor spinale trapezius-ligatie uitvoeren. Ons lab bestudeert microvasculaire groei en remodellering, met name in de context van ischemische aandoeningen zoals hartaandoeningen, perifeer arterieel levyziekte en beroerte.We hebben dit spiegelbeeldige ligatiemodel van de musculus trapezius ontwikkeld om te bestuderen hoe lokale obstructie van de arteriële bloedstroom structurele adaptaties teweegbrengt in stroomafwaartse microvasculaire netwerken. We beschouwen dit model als complementair aan het gevestigde en veelgebruikte model voor ischemie van de achterpoten, aangezien het een volledig netwerkoverzicht biedt van arteriogenese en angiogenese in een zeer dunne spier die geen histologische doorsneden vereist voor analyse. Omdat deze spier zo dun is en omdat de ligatie een reproduceerbare vermindering van de bloedstroom veroorzaakt, kunnen we de effecten van de arteriële ligatie over het gehele microvasculaire bed visualiseren met een resolutie op enkelcelniveau.Nadat Kyle ons stap voor stap door de procedure voor het spino trapezius-ligatie-model heeft geleid, zullen onze partners bij Cal Poly ons laten zien hoe zij dit model gebruiken om functionele vasodilatatie te bestuderen. Zodra we dat hebben gezien, keren we terug naar de University of Virginia om de spino trapezius te oogsten, wat moet gebeuren voorafgaand aan de beeldvorming en kleuring. Hallo, mijn naam is Trevor Cardinal.Ik ben assistent-professor bij de afdeling Biomedical Engineering aan de Cal Poly State University in San Luis Obispo, Californië, en mijn naam is Josh Cutz. Ik ben een masterstudent biomedische technologie aan Cal Poly in San Luis Obispo. De primaire interesse van ons onderzoekslaboratorium is het begrijpen van de impact van chronische ischemie, zoals voorkomt bij perifeer arterieel vaatlijden, op de functionele capaciteiten van de resistentievaatstelsels.Nadat de ligatie van de spinale trapezius-toevoeringsslagader is uitgevoerd, zal Josh de procedure voor functionele vasodilatatie demonstreren die in ons laboratorium wordt gebruikt. In ons laboratorium passen we de procedure voor functionele vasodilatatie toe om het effect van arteriële occlusie op de vasculaire reactiviteit en de bloedstroomcontrole te onderzoeken. De benodigdheden voor de voorbereiding omvatten 10-0 ligatuurhechtmateriaal, een sluithechting, een naaldhouder, irisscharen, standaard pincetten, veerscharen en een gebogen microsonde.Nadat de chirurgische instrumenten zijn voorbereid, wordt de muis geanestheseerd; we maken hier gebruik van de weergegeven formule en dosering. Bevestig de anesthesie via de knijpreflextest van de teen en verwijder vervolgens met een elektrisch scheerapparaat een groot stuk vacht van de rug van het dier ter bescherming van de IGEL. Hoewel voor de spinale trapeziusligatie slechts een klein gebied nabij het schouderblad hoeft te worden vrijgemaakt, is voor de oogst van het spinale trapeziusweefsel, die enkele dagen later zal plaatsvinden, een veel groter vrijgemaakt oppervlak vereist.Spoel overtollige vacht weg en breng vervolgens ontharingscrème aan volgens de instructies van de fabrikant. Was de rug met een natte spons. Breng daarna drie sets afwisselende alcohol- en Betadine-doekjes aan, waarbij wordt afgesloten met Betadine.Onder goede lichtomstandigheden kan de optimale incisieplaats worden bepaald door transdermale identificatie van het dorsale vetkussen. Aangezien de voedende slagader uiteindelijk abrupt door de spinale trapeziusspier loopt, spant de rand van het vetkussen de huid op deze locatie op; breng een irisschaar direct van bovenaf loodrecht op de rug van het dier in en maak een lineaire incisie van drie tot vijf millimeter. Indien de verlichting of huidpigmentatie transdermale identificatie niet mogelijk maken.Plaats de incisie vijf millimeter caudaal van de benige uitstulping van het schouderblad, breid de incisie uit door de huidlagen en vergroot deze lateraal indien nodig om de musculus trapezius van de ruggengraat te lokaliseren. Disseceer de bovenliggende fascia om de ligatieplaats te bereiken. Indien een oppervlakkig vat beschadigd is en bloedt zoals in dit geval, laat de bloeding dan stoppen en oefen indien nodig druk uit, spoel met saline om uitdroging te voorkomen.De aangegeven slagader loopt langs de dorsale zijde van de musculus trapezius spinalis en loopt vervolgens dwars door de spier naar het ventrale vetkussen. Zoek de laterale rand van de musculus trapezius spinalis en reflecteer deze door hem omhoog te tillen zodat hij bijna is omgekeerd. Dit onthult de ventrale zijde en de plek waar de slagader dwars doorloopt; dissecteer het ventrale vetkussen dat het vat aan het zicht onttrekt.Wees voorzichtig met de druk van de pincet om kneuzingsletsels te voorkomen. Hier geeft de chirurg de arteria spina trapezius aan die moet worden afgebonden. Let op de aanwezigheid van aderparen; een vaatverwijder zoals kortwerkend adenosine of langwerkend papaverine kan worden toegediend.In dit geval bevindt de slagader zich tussen twee andere vaten, zoals aangegeven door de pijlen. Eén vat is vergelijkbaar in grootte met de slagader en zou lateraal gelegen zijn als de spier niet was teruggeslagen, terwijl het andere vat veel groter is en zich meer direct bevindt. De twee ligatieplaatsen zijn gemarkeerd met ai.De eerste ligatuur wordt in stroomafwaartse richting ten opzichte van de tweede geplaatst. Dit zorgt ervoor dat het vat nog steeds met bloed is gevuld en zichtbaar blijft tijdens het plaatsen van de tweede ligatuur. A geeft de regio aan die getransecteerd moet worden.Let locatie B op, waar de slagader en de bijbehorende ader het ventrale vetkussen binnenkomen, omlijnd door C. Hieraan kunnen we vaststellen dat het tweede, kleinere vat een ader is. Let ook op de m. trapezius van de spinale arterie zelf, omlijnd door D. In het bijbehorende tekstprotocol worden enkele aanwijzingen gegeven om de slagader van de ader te onderscheiden. Kort samengevat is onze voorkeursmethode om de bloedstroom te blokkeren door druk uit te oefenen met een microprobe.Als het vat een slagader is, zal de bloedstroom in stroomafwaartse richting naar de reflecterende spier worden belemmerd. De hier beschreven techniek sluit het grotere vat uit. Gebruik indien nodig de microprobe met een buiging van 80 graden om de slagader van de andere vaten te scheiden.Dit wordt gedaan door door het bindweefsel onder het vat te prikken en korte laterale bewegingen te maken om een opening te vergroten. Zodra de sonde gemakkelijk kan worden doorgevoerd, kan de hechteenaald nu eenvoudiger onder de slagader worden geregen. In dit geval werd een kleine ader geraakt, wat leidde tot geringe bloedingen.Dit vat bevindt zich ver genoeg verwijderd van de ischemische zone om minimale impact te hebben. Voor de procedure wordt een enkele chirurgische knoop gelegd en de volgende hechting voorbereid. Vervolgens wordt er opnieuw door de vooraf gemaakte opening gegaan en een tweede chirurgische knoop gelegd enkele millimeters stroomopwaarts van de vorige ligatuur.Houd er rekening mee dat de spier is teruggeslagen en de stroomrichting mogelijk tegenovergesteld is aan wat wordt verwacht. Nadat beide ligaturen zijn geplaatst, moet er worden gezocht naar aanwijzingen voor een geblokkeerde kolom rode bloedcellen. Als de stroom niet is gestopt, is een extra ligatuur nodig.Doorsnij anders het vat tussen de ligaturen; let op of er bloedingen optreden. In dit geval was de ligatie succesvol en is er geen arteriële bloeding zichtbaar. Een alternatieve methode maakt gebruik van één enkele ligatuur en doorsnijding in stroomafwaartse richting. Raadpleeg de bijbehorende literatuur voor situaties waarin deze methode bij voorkeur wordt toegepast.Breng de spier terug in de oorspronkelijke oriëntatie, positioneer het verplaatste vetweefsel en de fascia opnieuw en sluit de wond met een niet-resorbeerbare hechting. Plaats de muis vervolgens in een verwarmde herstelkooi onder observatie en analgesie voor spino-trapezius intravitale microscopie. De muis wordt eerst geanestheseerd met isofluraan in een inductiekamer en vervolgens aangesloten op een continue stroom isofluraan via een neusmasker.Voer de rectale temperatuursensor in en stel de thermocontroller in op 35 °C. Bereid vooraf de instrumenten voor, waaronder irisscharen, standaard pincetten, veerscharen en een bevochtigd PBS-wattenstaafje. Maak met een irisschaar en standaard pincetten een huidincisie aan het caudale uiteinde van de spinalis trapezius. Breid de incisie craniaal uit tot aan het vetkussen, waardoor een hoefijzervormige incisie ontstaat, en dek de huidflap af met plastic folie om uitdroging te voorkomen. Dissecteer het subcutane bindweefsel bot door middel van fijne pincetten om de zichtbaarheid te maximaliseren.Plaats de stimulerende elektroden zo dicht mogelijk bij elkaar om de grootte van het stroomveld te minimaliseren; positioneer ze aan het caudale uiteinde van de blootgelegde spier, net lateraal van de wervelkolom. Veranker deze met klei. Voer een teststimulatie uit om de plaatsing van de elektroden te bevestigen met gebruik van een PowerLab-data-acquisitiesysteem, een stimulus-isolator en LabChart-software, ingesteld op vierkante golven met een duur van 200 microseconden, een amplitude van 2 milliampère en afgegeven met een frequentie van 1 hertz.Bedek de blootgestelde spier opnieuw met vershoudfolie. Om uitdroging te voorkomen, dient men 30 minuten per vatdiameter te wachten voor equilibratie alvorens de afbeelding of video vast te leggen. Positioneer de intravitale microscoop boven de spinale trapeziusspier om de architectuur van de vasculatuur te bekijken.Indien er een immersielens wordt gebruikt, breng dan een druppel PBS aan tussen het objectief en de plastic folie, beginnend boven de hoofdslagader, wat het grootste zichtbare vat is. Verplaats de tafel in het XY-vlak om het betreffende vat te lokaliseren. Stimuleer de spier met blokgolven van de eerder genoemde duur en amplitude, maar lever deze op acht hertz en gedurende 90 seconden direct na de stimulatie.Maak beelden van het vat en doe dit elke minuut totdat het teruggekeerd is naar de rustdiameter. De data-analyse kan in real-time worden uitgevoerd met videocalipermetingen of offline met beeldanalysesoftware. Herhaal de procedure van de initiële incisie tot de beeldvorming met de contralaterale spier.Wanneer voltooid, wordt de muis geëuthanaseerd volgens het standaard ACUC-protocol voor de oogst van het musculus trapezius-weefsel. Hiervoor zijn irisscharen, standaard pincetten en veerscharen nodig.Anestheseer de muis zoals eerder beschreven. Begin met het maken van een incisie enkele millimeters craniaal van het schouderblad van de muis. Verbreed de incisie lateraal en scheid vervolgens het weefsel aan beide zijden.Het doel is om de musculus trapezius van de wervelkolom vrij te leggen, die zich na het maken van de incisie uitstrekt van T3 tot L4. De huid kan van de rug worden gescheiden door voorzichtig te trekken of door het bindweefsel zorgvuldig door te snijden, waarbij de huid op zijn plaats wordt gehouden en wordt bevochtigd met zoutoplossing om uitdroging te voorkomen en de weefselhandtering te vergemakkelijken. Gebruik botte dissectie om het dorsale vetweefsel te verwijderen en de musculus trapezius van de wervelkolom bloot te leggen.Verwijder op soortgelijke wijze het ventrale vetweefsel. Na het terugklappen van de spier wordt hier de rechter spinalis trapezius van het dier geïdentificeerd. Verwijder vervolgens zoveel mogelijk van de overliggende fascia.Dit deel van de procedure kan tijdrovend zijn, maar is essentieel om artefacten tijdens de microscopie te voorkomen. Zodra het bindweefsel is verwijderd, wordt het weefsel geëxciteerd zoals getoond, door eerst de laterale rand ruwweg parallel aan het dorsum door te snijden in craniaal-caudale richting. Snijd vervolgens transversaal over het meest craniale uiteinde en tot slot langs de mediale rand, het dichtst bij de wervelkolom, om de contralaterale spier te verzamelen.Volg dezelfde procedure. Verwijder eerst het dorsale vetweefsel, daarna het ventrale vetweefsel en tenslotte de bovenliggende fascie tijdens het snijden. Het kan gemakkelijker zijn om de instrumenten naar de minder dominante hand te wisselen.Uitgesneden weefsel kan worden gefixeerd en gewassen volgens de hier beschreven procedure nadat het dier is geëuthanaseerd. Dit gebeurt volgens een verbeterd A CUC-protocol. Zie de bijbehorende literatuur voor details over een alternatieve perfusiefixatieprocedure.Hier tonen we een gelabeld diagram van de gereflecteerde m. spini trapezius. Na het blootleggen van de voedende slagader geven de letters de regio's aan zoals eerder beschreven. Houd er rekening mee dat elk dier een unieke anatomie heeft.Deze specifieke muis wordt als vrij lastig beschouwd voor deze procedure vanwege de nabijheid van de twee andere vaten. Hier wordt een meer typisch dier getoond. Let op de relatief grote afstand tussen de aangegeven slagader en de daarboven gelegen vene, en de afwezigheid van een derde vat.Hier zien we een confocale microscoopmontage van een geligeerde rechter spinale trapeziusspier die is gekleurd voor glad spier alpha actine. Onder ischemische omstandigheden heeft er remodellering plaatsgevonden in het aangegeven gebied stroomafwaarts van de ligatieplaats. Deze veranderingen kunnen worden gekwantificeerd met beeldanalyse-software, die we hier gebruiken om de tortuositeit te meten als de verhouding tussen de weglengte van de slagader en de afstand tot de kern.Enkele hier getoonde voorbeeldgegevens wijzen op een statistisch significant resultaat voor een toegenomen vaattortuositeit in vergelijking met de contralaterale controle. We demonstreren daarnaast functionele metingen van vaatreactiviteit met behulp van de MicroVision medische software een VA op een offline dark-field microscoop. Videovaatdiameters worden gemeten voor en na stimulatie en vervolgens met elkaar vergeleken als een procentuele verandering.De hier getoonde voorbeeldgegevens wijzen op een statistisch significant resultaat voor een verhoogde vatdiameter van terminale arteriën na stimulatie. Hallo, ik ben Alexander Ell en ik ben de bachelorstudent in het laboratorium van Pierce Scholer die deze video heeft gemonteerd. Samen hebben we zojuist laten zien hoe u een model voor ischemie van de skeletspieren creëert in de mirroring spin trapezius-spier.Vervolgens hebben we een functionele vasodilatatieprocedure gedemonstreerd die geschikt is voor het meten van vasculaire reactiviteit en bloedstroomcontrole. Tot slot hebben we laten zien hoe de spier kan worden uitgesneden ter voorbereiding op fixatie die geschikt is voor immunochemische kleuring en beeldvorming. Namens mijn medewerkers in San Luis Obispo en hier in Charlottesville wil ik u bedanken voor het kijken en wens ik u het beste en veel succes met uw onderzoek.

murine-spinotrapezius-model-to-assess-impact-arteriolar-ligation-on

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Ex vivo analyse van arteriële laesies uit diermodellen van hart- en vaatziekten is klassiek gebaseerd op histologische en immunohistochemische technieken. Deze bieden 2-dimensionale metingen in 3-dimensionale laesies. Dit manuscript beschrijft de generatie van arteriële laesies voor kwantitatieve analyse in 3-dimensies met behulp van optische projectietomografie.

Generatie en 3-dimensionale kwantificering van arteriële laesies in Muizen met behulp van optische projectie Tomografie

We introduceren een chirurgische methode experimentele ischemie / reperfusie (I / R) letsel veroorzaken simuleren myocardiaal infarct (MI) in muismodellen die zorgt voor meer duidelijkheid in positionering van de ligatie van de LAD (LAD) om de reproduceerbaarheid te verhogen MI van experimenten in muizen.

Een muizenmodel van myocard ischemie-reperfusie schade door de eileiders van de LAD

De muis dijbeenslagader draad letsel model van restenose is technisch uitdagend. In dit protocol laten we de belangrijkste technische gegevens van essentieel belang voor het succesvol uitvoeren van draad letsel aan consistente neointima voor studies van restenose induceren.

Een muizenmodel van slagaderrestenose: technische aspecten van Femorale Wire Injury

Het begrijpen van de cellulaire en moleculaire mechanismen van re-endothelialisatie na arteriële ontbloting letsel is van het grootste belang bij het voorkomen van trombose en restenose van slagaders. Hier beschrijven we een protocol voor reproduceerbare arteriële erosie letsel van de infrarenale abdominale aorta. De procedure werd ontwikkeld om de onderliggende mechanismen die endotheliale regeneratie met behulp van muismodellen te regelen onderzoeken.

Reproduceerbare Arteriële ontbossing en erosie Letsel door infrarenale abdominale aorta vastklemmen in een Murine Model

Restenosis na cardiovasculaire procedures (bypass operatie, angioplastie of stenting) is een significant probleem waardoor de duurzaamheid van deze procedures wordt verminderd. Een ideale therapie zou de proliferatie van gladde spiercellen (VSMC) verhinderen, terwijl het bevorderen van regeneratie van het endothelium. We beschrijven een model voor gelijktijdige beoordeling van VSMC proliferatie en endotheliale functie in vivo.

Murine Aortic Crush Injury: Een Efficiënt<em&gt; In Vivo</em&gt; Model van gladde spiercel proliferatie en endotheliale functie

Dit manuscript wordt beschreven in vitro videomicroscopie protocollen voor de beoordeling van de vasculaire functie in rat weerstand van de cerebrale bloedvaten. Het manuscript wordt ook beschreven technieken voor het evalueren van microvessel dichtheid met fluorescently geëtiketteerde lectine en weefsel perfusie met behulp van Laser Doppler flowmetrie.

Evaluatie van vasculaire controlemechanismen met behulp van videomicroscopie van geïsoleerde resistentie slagaders van ratten

Hier wordt een kritisch hindledemaat ischemie-experimentele model gepresenteerd, gevolgd door een batterij met functionele, histologische en moleculaire tests om de effectiviteit van angiogene therapieën te beoordelen.

Beoordeling van therapeutische angiogenese in een Muriene model van Hindledemaat ischemie

Hierin beschrijven we een chirurgische ingreep die laat zien hoe u permanente ligatie van de linker-anterieure aflopende coronaire slagader bij muizen bereikt. Dit model is van groot belang om de pathofysiologie van myocardiaal infarct en de gelijktijdige biologische processen te onderzoeken.

Murine myocardinfarct model met behulp van permanente Ligatie van linker anterieure aflopende coronaire slagader

Dit artikel demonstreert een efficiënte chirurgische aanpak om acute ischemie vast te stellen bij muizen met een kleine incisie. Deze aanpak kan door de meeste onderzoeksgroepen worden toegepast zonder laboratoriumupgrades.

Een gewijzigd chirurgisch model van ischemie van de achterpoten in ApoE-/- Muizen met behulp van een miniatuurincisie

De rekrutering van leukocyten en bloedplaatjes vormt een essentieel onderdeel dat nodig is voor de effectieve groei van collaterale slagaders tijdens arteriogenese. Multifotonenmicroscopie is een efficiënt hulpmiddel voor het volgen van celdynamica met een hoge spatio-temporele resolutie in vivo en minder fototoxiciteit om leukocytenrekrutering en extravasatie tijdens arteriogenese te bestuderen.

Multifoton intravitale beeldvorming voor het monitoren van leukocytenrekrutering tijdens arteriogenese in een Murine Hindlimb-model

Hier presenteren we een muizenmodel voor anastomose van de dijbeenslagader, en bieden we onderzoekers een waardevol diermodel om vasculaire anastomosestenose te bestuderen en te simuleren. Deze ontwikkeling is cruciaal voor het vergroten van ons begrip van de pathofysiologie die aan deze aandoening ten grondslag ligt en voor het mogelijk maken van nauwkeuriger en effectiever onderzoek naar vaatziekten.

Ontwikkeling van een muizenmodel voor anastomosestenose van de dijbeenslagader

Leer een murine spinotrapezius ligatiemodel om microvasculaire functie en remodeling te bestuderen met intravitale en confocale microscopie. Dit model onderzoekt ischemische vaataanpassingen.

Murine Spinotrapezius model om de invloed van arteriolaire Ligatie beoordelen op microvasculaire functie en Remodeling

Meer video's verkennen