Cell Co-cultuur Patterning gebruiken waterige tweefasensysteem Systems

Het algemene doel van deze procedure is om cellen direct te patroonvormen in volledig waterige omgevingen. Dit wordt bereikt door eerst langketenpolymeren, zoals polyethyleenglycol en dextrine, op te lossen in afzonderlijke buisjes met celkweekmedium. De tweede stap is om de cellen te trypsiniseren, het pellet te oogsten en de cellen te resuspenderen tegen de gewenste zaaidichtheid in één of beide polymeeroplossingen.

Vervolgens worden de polymeeroplossingen op een celkweekschaal gedoseerd. De incompatibiliteit van de twee polymeren maakt ruimtelijke patroonvorming van de twee volledig waterige vloeistoffen mogelijk. Cellen kunnen in één van de polymeeroplossingen of in beide polymeeroplossingen worden opgenomen om een verscheidenheid aan patronen te produceren.

De laatste stap is het verwijderen van de polymeeroplossingen nadat de cellen vier uur of langer de tijd hebben gekregen om te hechten, en deze te vervangen door kweekmedium. Ten slotte kan brightfield- of fluorescentiemicroscopie worden gebruikt om het celpatroon te bevestigen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals micro-contactprinten, is dat cellen in een volledig waterige omgeving worden gepatroneerd met eenvoudige hulpmiddelen zoals micropijppatronen.

Deze methode kan in tissue engineering worden gebruikt om celmigratie te beoordelen en om pericriene en autocriene signalering tussen cellen te onderzoeken. De procedures worden gedemonstreerd door Abraham, een bachelorstudent, en Joshua White, een promovendus uit het Takayama-lab. Begin met het oplossen van de twee verschillende polymeren in het specifieke medium dat in uw experimenten zal worden gebruikt. In dit voorbeeld hebben polyethyleenglycol, ook bekend als PEG, en dextrine, ook bekend als Dex, respectievelijk molecuulmassa's van 35 kilodaltons en 500 kilodaltons.

Bereid 16 monsters van twee milliliter voor in conische buizen van 15 milliliter, elk met verschillende concentraties PEG en dex, conform de hier getoonde tabel. Weeg hiervoor de juiste hoeveelheden PEG en dex af volgens de tabel en meng deze in het medium door de buizen voorzichtig te schudden totdat beide polymeren volledig zijn opgelost. Dit kan enkele uren duren voordat de polymeren volledig zijn opgelost.

De oplossing moet troebel zijn. Bevestig de fasescheiding door de monsters vijf minuten te centrifugeren bij 1000 Gs. De dichtere bodemfase zal dex-rijk zijn.

De bovenste fase zal rijk zijn aan peg. Voeg vervolgens langzaam 0,1 milliliters extra medium toe aan de buisjes en vortex de monsters gedurende 20 seconden. Centrifugeer de monsters daarna opnieuw om de fasescheiding te controleren.

Indien de oplossing helder is nadat er extra volumes medium zijn toegevoegd, herhaal deze stap dan door opnieuw 0,1 milliliter medium toe te voegen, de monsters te mengen en te centrifugeren totdat de oplossing helder wordt en er geen fasescheiding meer optreedt. Dit geeft aan dat de drempelwaarde van het kritische punt voor dat specifieke mengsel is bereikt. Noteer op dit punt het uiteindelijke gewicht van elke buis.

Bepaal slutend het gewichtspercentage per gewicht van de twee polymeren op het punt van fase-scheiding. Plot de binodale curve door het gewichtspercentage per gewicht PEG op de y-as en het gewichtspercentage per gewicht dex op de x-as te plaatsen. Deze curve vertegenwoordigt de drempelconcentraties voor fasescheiding van PEG en dex in dit medium.

Om te beginnen met het exclusiepatroon van cellen, bereidt u aparte oplossingen van PEG en dex voor tegen twee keer hun kritieke puntwaarden, zoals bepaald door de binodale drempelwaarde. Voor deze experimenten worden 5% gewicht per gewicht PEG en 12,8% gewicht per gewicht dex toegevoegd aan DMEM met 10% FBS en 1% antibiotica. De buizen worden op een schudmachine geplaatst om ze volledig te laten oplossen.

Oogst vervolgens de cellen die voor het uitsluitingspatroon in dit experiment worden gebruikt; HeLa-cellen bij 80% confluentie worden getrypsiniseerd met 0,5% trypsine gedurende drie minuten. Tel na het oogsten het aantal cellen met een hemocytometer, pellet deze vervolgens en resuspendeer de cellen op 375.000 cellen per milliliter in medium waaraan 5% PEG is toegevoegd. Deze concentratie zal monsters opleveren die, wanneer ze worden gekweekt, de volgende dag confluent worden.

Dispense vervolgens met een micropipet druppels van 0,5 µL van de 12,8% dex-oplossing op een droge 96-wells plaat voor exclusie-patronering. Dex-druppels kunnen onder steriele omstandigheden worden gedroogd voor later gebruik. Dispense daarna langzaam 200 µL van de PEG HeLa-celсусpensie in de well.

Om de D-druppels te bedekken, is het belangrijk om eerst de D-druppel met de PEG-oplossing te bedekken voordat de omliggende gebieden worden ingevuld; dit voorkomt dat de druppel wordt verstoord wanneer de oplossing zich over de put verspreidt. Zodra alle putten zorgvuldig zijn gepatterned en gezaaid, wordt de celkweekplaat in een bevochtigde incubator geplaatst. Zorg ervoor dat de schaal tijdens het hanteren niet kantelt en dat deze op een vlakke plank in de incubator wordt geplaatst om te voorkomen dat de patronen worden verstoord nadat de cellen 12 uur de tijd hebben gehad om te hechten.

Verwijder de PEG-oplossing en was drie keer met 200 µL kweekmedium om eventuele resterende polymeren te verwijderen. Voeg vervolgens 200 µL vers kweekmedium toe en plaats de plaat terug in de incubator. Controleer de culturen periodiek om de celproliferatie en migratie naar de exclusiezones te observeren om te beginnen met het patroonvormen van eilanden.

Bereid oplossingen van 5% gewichtspercentage PEG en 12,8% gewichtspercentage decks in celkweekmedium. Oogst daarnaast de HeLa-cellen die gebruikt zullen worden voor het eilandpatroon en bepaal opnieuw het totaal aantal beschikbare cellen met behulp van een hemocytometer. Pelleteer de cellen vervolgens en resuspendeer ze.

Centrifugeer de cellen bij 5 miljoen cellen per milliliter in medium. Bij gebruik van 12,8% dex is mogelijk een hogere celconcentratie nodig om binnen 24 uur confluentie te bereiken als de cellen minder goed hechten dan HeLa-cellen. Pipetteer vervolgens 200 µL PEG-oplossing in elke put van een 96-wellplaat.

Voeg vervolgens langzaam een druppel van 0,5 µL cel-suspensie toe aan elke well die de PEG-oplossing bevat. De druppels zullen naar de bodem zakken en contact maken met het kweekoppervlak. Plaats de plaat daarna voorzichtig in de incubator, waarbij u er strikt op let de schaal op geen enkel moment te kantelen, aangezien dit de patronen na 12 uur kan verstoren.

Verwijder de PEG-oplossing en was drie keer met 200 µL cultuurmedium. Voeg vervolgens 200 µL vers cultuurmedium toe en plaats de plaat terug in de incubator. Controleer de culturen periodiek om de celproliferatie en migratie naar buiten vanuit de eilanden te observeren.

Begin de co-cultuurpatronering door oplossingen voor te bereiden van 5% gewichtsprocent PEG en 12,8% gewichtsprocent decks in DMEM met 10% FPS en 1% antibiotica; kweek tevens de twee celtypen die gebruikt zullen worden voor de exclusie- en eilandspatronering tot ze bijna confluent zijn. In dit geval gebruiken we Hep G2 C3-hepatocyten als eilanden met NIH 3T3-fibroblasten eromheen. Oogst vervolgens de twee celtypen en tel ze afzonderlijk met een hemocytometer.

Deze twee celtypen kunnen eenvoudig worden onderscheiden met behulp van brightfield-microscopie; pellet de Hep G twee C3 A hepatocyten voor eilandpatronering en resuspendeer deze in 12,8% dex. Pellet vervolgens de fibroblasten voor exclusie, patronering en resuspendeer deze in 5% peg. Dispenseer daarna druppels van 0,5 µL van de D-cel-suspensie op een droge 96-wells plaat en bedek de dex-druppels voorzichtig met 200 µL van de peg-celsuspensie.

Plaats de plaat na 12 uur vervolgens in een incubator. Verwijder het medium en spoel drie keer met 200 µL kweekmedium. Voeg daarna 200 µL vers kweekmedium toe en plaats de plaat terug in de incubator.

Ten slotte kan de albuminekleuringsintensiteit van de co-culturen worden gemonitord om de gunstige effecten van de fibroblast-co-cultuur te beoordelen. De polymeerconcentraties die nodig zijn om verschillende tweefasige waterige systemen te vormen, worden hier beschreven door de binodale curven; bij concentraties boven de binodale curve vormt het systeem twee fasen onder de binodale curve.

De oplossing is een transparant enkel-fase twee-fase systeem van ten minste tweemaal. De concentraties die op de binodale curve zijn gevonden, zijn voldoende voor gebruik in de waterige twee-fase systemen die in deze video worden beschreven. Het eerste voorbeeld van hun gebruik is een exclusiepatroon waarbij kleine gebieden celvrij kunnen blijven.

Eilandpatroonvorming creëert precies het tegenovergestelde van exclusiepatroonvorming, waarbij kleine regio's met cellen kunnen worden bezet. De combinatie van deze twee procedures kan worden gebruikt om een unieke co-cultuur te vormen waarbij een eiland van cellen kan worden omringd door een ander celtype, zoals hier wordt getoond. Hela-cellen die zijn uitgeplaat met behulp van exclusiepatroonvorming zullen prolifereren en migreren om de leegte op te vullen.

Na verloop van tijd kan de grootte van de opening worden gemonitord om waardevolle inzichten te verkrijgen in celmigratie en celgroei onder verschillende omstandigheden. Eilandpatronering kan daarentegen worden gebruikt om de uitgroei van cellen te meten.

De combinatie van eiland- en exclusiepatronering produceert goed gedefinieerde regio's van co-cultuur. Hier worden eilanden van hepatocyten getoond, omringd door fibroblastcellen. Er is vastgesteld dat deze koloniën hun organisatie gedurende ten minste vier dagen in cultuur behouden.

Met dit systeem kunnen meerdere eilandjes cellen op dezelfde plaat worden gekweekt. Wanneer ze als solitaire eilandjes werden gekweekt, produceerden hepatocyten iets minder albumine dan wanneer ze in co-kweek met fibroblasten werden gekweekt. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat polymeerconcentraties van twee keer de kritische concentratie moeten worden gebruikt om tweefasige oplossingen te vormen.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u een waterig tweefasesysteem formuleert en hoe u dit gebruikt om cellen te patroneren en geometrieën te definiëren.