Cell Co-cultuur Patterning gebruiken waterige tweefasensysteem Systems
March 26th, 2013
Waterige tweefasensysteem systemen werden gebruikt om gelijktijdig meerdere patroon populaties van cellen. Deze snelle en gemakkelijke methode voor patroonvorming cel maakt gebruik van de fasenscheiding van waterige oplossingen van dextran en polyethyleenglycol en de grensvlakspanning die tussen de twee polymeeroplossingen.
Het algemene doel van deze procedure is om cellen direct te patrouilleren in volledig waterige omgevingen. Dit wordt bereikt door eerst lange kettingpolymeren, zoals polyethyleenglycol en dextrine op te lossen in afzonderlijke buisjes met celkweekmedium. De tweede stap is om cellen te trypsiniseren, te oogsten, te pelleten en te resuspenderen bij de gewenste zaaidensiteit in één of beide polymeeroplossingen.
Vervolgens worden de polymeeroplossingen op een celkweekschaal gespoten. De incompatibiliteit van de twee polymeren maakt ruimtelijke patronering van de twee volledig waterige vloeistoffen mogelijk. Cellen kunnen in een van beide polymeeroplossingen of in beide polymeeroplossingen worden opgenomen om een verscheidenheid aan patronen te produceren.
De laatste stap is om de polymeeroplossingen te verwijderen zodra de cellen vier uur of langer zijn belicht en deze te vervangen door kweekmedium. Uiteindelijk kan helderveld- of fluorescentiemicroscopie worden gebruikt om celpatronering te bevestigen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals microcontactprinting is dat cellen worden gepatrouillieerd in een volledig waterige omgeving met eenvoudige hulpmiddelen zoals micropijpatrouningen.
Deze methode kan worden gebruikt voor weefselengineering om celmigratie te beoordelen en om cel-naar-cel pericrine en autocriene signalering te onderzoeken, wat aantoont dat de procedures zullen worden uitgevoerd door Abraham, een student in de bachelorfase, en Joshua White, een afgestudeerde student van het Takayama-lab. Begin met het oplossen van de twee verschillende polymeren in het specifieke medium dat u in uw experimenten zult gebruiken. In dit voorbeeld hebben polyethyleenglycol, ook bekend als PEG, en Dextrine, ook bekend als Dex, respectievelijk molecuulgewichten van 35 kilodalton en 500 kilodalton.
Bereid 16 monsters van twee milliliter in 15 milliliter kegelbuisjes voor, elk met verschillende concentraties van PEG en dex, vergelijkbaar met de tabel die hier wordt getoond. Om dit te bereiken, weeg de juiste hoeveelheden PEG en dex af volgens de tabel en meng ze in het medium door ze voorzichtig te wiegen totdat beide polymeren volledig zijn opgelost. Dit kan enkele uren duren nadat de polymeren volledig zijn opgelost.
De oplossing zou troebel moeten zijn. Bevestig fasescheiding door de monsters 1000 Gs gedurende vijf minuten te centrifugeren. De dichtere onderste fase zal dexrijk zijn.
De bovenste fase zal pegrijk zijn. Voeg vervolgens langzaam 0,1 milliliter extra medium toe aan de buisjes en wervel de monsters gedurende 20 seconden. Centrifugeer de monsters vervolgens opnieuw om fasescheiding te controleren.
De oplossing is helder nadat extra volumes medium zijn toegevoegd, herhaal deze stap door nog eens 0,1 milliliter medium toe te voegen, te mengen en de monsters te centrifugeren totdat de oplossing helder wordt en geen fasescheiding meer plaatsvindt. Dit geeft aan dat het kritische puntdrempel voor die specifieke mix is bereikt. Noteer het eindgewicht van elke buis op dit punt.
Bepaal ten slotte het percentage gewicht per gewicht van de twee polymeren op het fasescheidingspunt. Plot de binaire nodale curve, waarbij percentage gewicht per gewicht peg op de y-as en percentage gewicht per gewicht decks op de X-as wordt geplaatst. Deze curve is de drempelconcentraties voor fasescheiding van PEG en dex in dit medium.
Om exclusiepatronering van cellen te beginnen, bereid aparte oplossingen van PEG en dex voor bij tweemaal hun kritische puntwaarden, zoals bepaald door de binaire nodale drempel. Voor deze experimenten worden 5% gewicht per gewicht PEG en 12,8% gewicht per gewicht decks toegevoegd aan DMEM met 10% FBS en 1% antibiotica. De buisjes worden op een schommel geplaatst om ze volledig op te laten lossen.
Vervolgens worden de cellen geoogst die worden gebruikt voor exclusiepatronering voor dit experiment, hela-cellen bij 80% confluentie worden trypsiniseerd met behulp van 0,5% tripsine gedurende drie minuten. Eenmaal geoogst, tel het aantal cellen met behulp van een hemo cytometer en pellet en resuspendeer de cellen bij 375.000 cellen per milliliter in medium met 5% PEG toegevoegd. Deze concentratie zal monsters produceren die, wanneer gekweekt, de volgende dag confluent zullen worden.
Vervolgens worden met behulp van een micropipetter 0,5 microliter druppels van de 12,8% decks-oplossing gespoten op een droge 96-wellplaat voor exclusiepatronering. Dex-druppels kunnen onder steriele omstandigheden drogen voor later gebruik. Spuit vervolgens 200 microliter PEG hela-celsuspensie langzaam in de put.
Om de D-druppels te bedekken, is het belangrijk om de D-druppel eerst te bedekken met de PEG-oplossing voordat u de omringende gebieden invult, omdat dit voorkomt dat het druppeltje verstoord raakt wanneer het zich over de put verspreidt. Zodra alle putten zorgvuldig zijn gepatrouilleerd en gezaaid, plaats de celkweekplaat in een bevochtigde incubator. Zorg ervoor dat de schaal tijdens het hanteren niet kantelt en dat deze op een vlakke incubatorplank wordt geplaatst om verstoring van de patronen te voorkomen nadat de cellen gedurende 12 uur zijn belicht.
Verwijder de PEG-oplossing en was drie keer met 200 microliter kweekmedium om eventuele resterende polymeren te verwijderen. Voeg vervolgens 200 microliter vers kweekmedium toe en plaats de plaat terug in de incubator. Bewaak de culturen periodiek om celproliferatie en migratie naar de exclusiezones te observeren om eilandpatronering te beginnen.
Bereid oplossingen van 5% gewicht per gewicht PEG en 12,8% gewicht per gewicht decks in celkweekmedium voor. Oogst ook de hela-cellen die zullen worden gebruikt voor eilandpatronering en bepaal opnieuw het totale aantal beschikbare cellen met behulp van een hemo cytometer. Pel en resuspendeer volgende.
Spin de cellen bij 5 miljoen cellen per milliliter in medium. Doorgaans 12,8%dex, kan een hogere concentratie cellen nodig zijn om confluentie in 24 uur te bereiken als de cellen niet zo goed hechten als hela-cellen. Pipet vervolgens 200 microliter PEG-oplossing in elke put van een 96-wellplaat.
Voeg vervolgens langzaam een druppel van 0,5 microliter decks-celsuspensie toe in elke put die de PEG-oplossing bevat.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor celpatroonvorming met behulp van waterige twee-fase systemen. Door de fasescheiding van dextran en polyethyleenglycol te gebruiken, kunnen onderzoekers op een eenvoudige manier ruimtelijke organisatie van cellen bereiken.
Belangrijkste onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Biotechnologie
- Polymeerwetenschap
Achtergrond
- Waterige twee-fase systemen maken de scheiding van verschillende celpopulaties mogelijk.
- Polyethyleenglycol en dextran zijn veelgebruikte polymeren in celcultuur.
- Celpatroonvorming is cruciaal voor verschillende toepassingen in weefselengineering.
- Deze methode biedt een snelle en efficiënte benadering om celpatronen te creëren.
Doel van het onderzoek
- Om een techniek te ontwikkelen voor directe celpatroonvorming in waterige omgevingen.
- Om het gebruik van polymeeroplossingen voor ruimtelijke organisatie van cellen te verkennen.
- Om de creatie van diverse celpatronen voor onderzoekstoepassingen mogelijk te maken.
Gebruikte methoden
- Het oplossen van langketenige polymeren in celcultuurmedium.
- Trypsinisatie, oogsten en opnieuw opschorten van cellen in polymeeroplossingen.
- Polymeeroplossingen op celcultuurschotels aanbrengen.
- Gebruik maken van de onverenigbaarheid van polymeren voor ruimtelijke patroonvorming.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle patroonvorming van meerdere celpopulaties met behulp van waterige oplossingen.
- Aangetoond veelzijdigheid in het creëren van verschillende celarrangementen.
- De efficiëntie van de methode benadrukt in vergelijking met traditionele technieken.
- Een basis geboden voor verder onderzoek in celorganisatie.
Conclusies
- De methode biedt een snelle en effectieve manier om cellen te patroonvormen.
- Waterige twee-fase systemen kunnen worden gebruikt voor diverse toepassingen in celbiologie.
- Deze benadering kan de ontwikkeling van weefselengineeringstrategieën verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Cell patterning technologies that are fast, easy to use, and affordable are essential for advancing high-throughput cell assays, studying cell-cell interactions, and developing tissue-engineered systems. This method enables spatial organization of cells in entirely aqueous environments using biocompatible polymer solutions, supporting predictive confidence in early discovery workflows. It provides a scalable, reagent-efficient approach for probing mechanistic hypotheses and de-risking target validation through controlled co-culture geometries.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by defining precise cell-cell interaction geometries to clarify signaling pathways and functional dependencies.
- Operational Value: Supports biological de-risking through reproducible patterning of exclusion zones and cell islands, facilitating mechanistic target validation without complex fabrication.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by generating quantitative readouts on cell migration, proliferation, and co-culture organization under defined microenvironmental conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by creating stable, defined co-culture patterns that mimic tissue-level organization.
- Operational Value: Enables assay standardization and reproducibility through phase-separated aqueous systems compatible with manual pipetting and liquid handling platforms.
- Scalability Value: Facilitates screening readiness and platform reuse across adherent cell types, supporting high-throughput evaluation of compound effects on cell behavior.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Maintains continuity from discovery through preclinical validation by modeling cell-cell pericrine and autocrine signaling in disease-relevant configurations.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports decisions on preclinical progression by quantifying functional outcomes such as albumin secretion in hepatocyte-fibroblast co-cultures.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive de-risking by isolating variables in cell interaction studies to reduce ambiguity in target mechanism interpretation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing in early discovery to lead identification and preclinical validation, enabling iterative refinement of cell-based assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by allowing precise spatial control over cell populations to interrogate signaling mechanisms.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs through reproducible patterning compatible with microscopy-based readouts for migration, proliferation, and functional assays.
- Analytics: Generates measurable readouts such as cell migration into exclusion zones and outgrowth from islands, enabling statistical comparison of conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling tissue-like architectures relevant to evaluating therapeutic candidates.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability across projects, reducing reliance on specialized microfabrication and enabling cross-team standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in cell-cell communication studies.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of cell patterning workflows using accessible liquid handling tools.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early functional de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative co-culture phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in polymer solution preparation and phase behavior characterization using binodal curve determination.
- Depends on access to microfluidic or manual pipetting equipment for precise droplet dispensing and cell handling.
- Necessitates cross-team standardization of polymer concentrations and cell seeding densities to ensure pattern fidelity across users and labs.
- Involves adaptation considerations for different adherent cell types, as patterning efficiency may vary with cell adhesion properties and size.
- Includes practical limitations such as the need to maintain phase stability during culture and avoid mechanical disruption of patterns during medium exchange.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:32
Phase System Characterization: Determining Thresholds for Phase Separation
3:22
Configuration 1: Exclusion Patterning of HeLa Cells
5:24
Configuration 2: Island Patterning
6:41
Configuration 3: Exclusion / Island Patterned Co-Cultures
8:08
Results: Cell Patterning with the Aqueous Two-phase System
9:47
Conclusion
