Pyrosequentiebepaling voor Microbiële identificatie en karakterisering

Het algemene doel van het volgende experiment is om een bacterie te identificeren door middel van 16 s ribosomale DNA-sequentieanalyse met behulp van de pyrosequentiemethode. Dit wordt bereikt door eerst de doel-DNA te versterken via een polymerasekettingreactie met behulp van een biotinylerende primer. Het biotinylerende amplicon wordt vervolgens geïmmobiliseerd met behulp van streptavidine gecoate spheros-kralen en gezuiverd met behulp van wasbuffers.

Vervolgens wordt het amplicon gedenatureerd en 16 s ribosomale sequentieprimers worden ELL op de enkele strengen DNA geplaatst. Het doel van deze stap is om de DNA voor te bereiden voor sequentiebepaling. Ten slotte vindt de DNA-sequentiebepalingreactie plaats door pyrosequentie, een snelle en nauwkeurige methode om nucleïnezuren te sequentiëren op basis van het principe van sequentiëring door synthese.

Het biotinylerende alicon wordt gebruikt als sjabloon door DNA-polymerase om DN TPS een base per keer in te voegen, wat leidt tot de generatie van pyrofosfaat. Een TP Sul Urease converteert pyrofosfaat proportioneel tot A-T-P-A-T-P en katalyseert de luciferase-gemedieerde omzetting van Lucifer in Lucifer, wat licht genereert dat evenredig is aan de hoeveelheid a TP. Het licht wordt geregistreerd als een piek op de pyrotrace en geeft nucleotide-incorporatie aan. De niet-incorporatieve DN NTP's worden afgebroken door apras voordat de volgende DNTP wordt toegevoegd voor voortzetting van de synthese.

Het chemiluminescente signaal dat op de rogram wordt geregistreerd, maakt het mogelijk de DNA-sequentie te bepalen. De verkregen resultaten zijn ribosomale 16 SDNA-sequenties, die worden gebruikt om de bacterie te identificeren door vergelijking met een ribosomaal DNA-referentiedatabase. Pyrosequentie is een veelzijdige techniek die microbiële genoomsequentie vergemakkelijkt en kan worden gebruikt om bacteriesoorten te identificeren, bacteriestammen te onderscheiden en genetische mutaties te detecteren die resistentie tegen antimicrobiële middelen verschaffen.

In deze video wordt de procedure voor het genereren van bacteriële amplicons, amplicon pyrosequentie en DNA-sequentieanalyse gedemonstreerd. Om te beginnen met de procedure voor sjabloonversterking, ontdooit u alle benodigde oplossingen en mengt u deze grondig. Al het werk kan bij kamertemperatuur worden gedaan. Stel de PCR-reactie in volgens deze tabel.

Merk op dat een eindconcentratie van magnesiumchloride van 1,5 millimolar in de meeste gevallen bevredigende resultaten oplevert. Als echter een hogere magnesiumconcentratie vereist is, kan tot 3,5 microliters van 25 millimolar magnesiumchloride aan een reactie worden toegevoegd. Een primer moet aan het vijf-prim-uiteinde worden biotinyleerd en het wordt aanbevolen dat de primer grondig gezuiverd is met behulp van HPLC.

Meng het reactiemengsel door voorzichtig op en neer te pipetten en doseer vervolgens geschikte volumes in PCR-buisjes. Voeg vervolgens template-DNA toe aan elk PCR-buisje. 10 nanogram genomisch DNA per reactie wordt aanbevolen.

Plaats de PCR-buisjes in een cycler en start dit cyclusprogramma voordat u de mastermix maakt. Roer de fles strep avid en gecoate seros-kralen om een homogene suspensie te verkrijgen. Maak een mastermix volgens deze stroomschema.

Combineer kralen, bindingsbuffer en water van hoge zuiverheid in een microcentrifugebuisje. Afhankelijk van het volume PCR-product dat wordt gebruikt, doseert u 60 tot 75 microliters mastermix in elk putje van een PCR-plaat zodat het totale volume 80 microliters per putje is. Voeg vijf tot 20 microliters gebiotinyleerd PCR-product toe aan elk putje.

Het volume per putje moet nu 80 microliters zijn. Sluit de putjes met stripdoppen en schud de PCR-plaat bij 1.400 RPM gedurende vijf tot 10 minuten bij kamertemperatuur met behulp van een orbitale shaker. Begin deze procedure door de sequentieprimers te verdunnen tot 0,3 micromolar met een knielingbuffer en 25 microliters in elk putje van de reactieplaat te doseren.

Plaats de plaat op de vacuümwerkstation. Vul de troggen van de werkstation volgens dit diagram. 50 milliliter 70% ethanol in trog een 40 milliliter denaturatieoplossing in trog twee 50 milliliter wasbuffer in trog drie 50 milliliter water van hoge zuiverheid in trog vier en 70 milliliter water van hoge zuiverheid in trog vijf.

Schakel de vacuümpomp in en zorg ervoor dat de schakelaar op het vacuümgereedschap op aan staat. Spoel de filterpitten met water van hoge zuiverheid. In trog vijf, plaats de PCR-plaat met kralen op de werkstation en zorg ervoor dat zowel de PCR- als de reactieplaten in dezelfde oriëntatie staan. Laat het vacuümgereedschap in de putjes van de PCR-plaat zakken.

Gedurende 20 seconden of totdat al het volume is geaspeerd, worden de kralen door het vacuümgereedschap gevangen terwijl het vacuüm nog steeds aan staat. Spus het gereedschap gedurende 20 seconden met 70% ethanol of totdat al het volume is geaspeerd. Spus het gereedschap vervolgens met de denaturatieoplossing gedurende 20 seconden of totdat al het volume is geaspeerd.

Spus het gereedschap vervolgens met wasbuffer gedurende 20 seconden of totdat al het volume is geaspeerd met het vacuüm nog steeds aan. Til het vacuümgereedschap op tot voorbij 90 graden verticaal gedurende vijf seconden om alle vloeistof uit het vacuümgereedschap te laten lopen. Schakel nu de pomp uit en lijn het vacuümgereedschap uit met drie reactieplaten.

Laat het vacuümgereedschap in de putjes zakken. Schud vervolgens voorzichtig van zijde naar zijde gedurende ongeveer 10 seconden om de kralen in de putjes met sequentieprimer vrij te geven. Plaats het vacuümgereedschap in de watertrog voor het reinigen om de sequentieprimer aan het DNA te anelen.

Plaats de reactieplaat in een voorverwarmde plaathouder. Verwarm de plaat gedurende twee minuten op 80 graden Celsius. Verwijder de plaat uit de houder en plaats deze op de counter om vijf minuten op kamertemperatuur af te koelen.

Begin deze procedure door het instrument in