Name: Pyrosequentiebepaling voor Microbiële identificatie en karakterisering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Leer pyrosequencing voor microbiële identificatie en karakterisering via 16S ribosomaal DNA-analyse. Deze methode detecteert bacteriële soorten en genetische mutaties die resistentie tegen antimicrobiële middelen veroorzaken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit project was steun voor een deel door de Johns Hopkins University, Bureau van de provoost via de Gateway Science Initiative en Qiagen Inc

Inleiding: Een enkele bacteriekolonie moeten worden gebruikt om een geschikt kweekmedium dat wordt overnacht geïncubeerd inoculeren. Een bacteriële pellet wordt vervolgens op genomisch DNA met behulp van een commercieel verkrijgbare isolatiekit genomische zuiveren. De gezuiverde genomisch DNA zou een verhouding 260/280 (nm) moet&gt; 1,8 te verzekeren dat het monster geen eiwit verontreinigingen. De hoeveelheid genomisch DNA vereist voor het genereren van de pyrosequencing template 10-20 ng. A. Versterking van de Template (PyroMark PCR Handbook; <a href="http://www.qiagen.com/handbooks" target="_blank">www.qiagen.com / handboeken</a> 1) Het opzetten van de PCR-reactie Opmerking: Een primer moet gebiotinyleerd aan het 5&#39;-uiteinde, en het wordt aanbevolen dat het zijn HPLC gezuiverd voor de voorbereiding template. Wij raden de PyroMark Assay Design Software 2.0 voor PCR en seQuence primer ontwerp die zijn geoptimaliseerd voor korte-read sequencing echter Primer-BLAST ( <a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome" target="_blank">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome</a> ) van NCBI kan ook worden gebruikt voor primer design. <ol><li> Dooi alle benodigde oplossingen (vermeld in tabel 1) en meng elk grondig. Stel de reactie volgens tabel 1. Al het werk gedaan kan worden op kamertemperatuur. </li></ol> Opmerking: De PCR Master Mix bevat MgCl2 voor een eindconcentratie van 1,5 mM, die bevredigende resultaten oplevert in de meeste gevallen. Indien een hogere Mg2 + concentratie is vereist, kan tot 3,5 ui 25 mM MgCl2 toegevoegd aan een reactiemengsel. <ol start="2"><li> De reactie mix goed te mengen door voorzichtig en neer te pipetteren, vervolgens afzien adequate volumes over in PCR-buisjes. </li><li> Voeg template DNA aan elke PCR buis. Wij raden aan 10 ng genomisch DNA. </li><li> Programmeer de thermische cycler volgens tabel 2. Een laatste houden bij 4 ° C wordt aanbevolen voor het gemak. Bij gebruik van een PCR-apparaat zonder verwarmde deksel, overlay reacties met 100 ui minerale olie. </li><li> Plaats de PCR-buizen in de cycler en de cyclus te starten programma. </li></ol> B. Vacuum Workstation Protocol Het immobiliseren van het gebiotinyleerde PCR-producten <ol><li> Voeg een master mix volgens figuur 4. </li></ol> Opmerking: Voor het pipetteren, schud de fles streptavidine-gecoate Sepharosekorrels om een homogene suspensie te garanderen. <ol start="2"><li> Afhankelijk van de hoeveelheid PCR-product gebruikt afgeven 60-75 pi Master Mix in elk putje van een PCR plaat tot een totaal volume van 80 gl per putje. </li><li> Voeg 5-20 ul gebiotinyleerde PCR-product aan elk putje. </li><li> Verzegelen van de putten met strip caps en schud de PCR plaat bij 1400 rpm gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur (15-25 ° C) met behulp van een schudapparaat. </li></ol> Denaturatie van DNA en toevoeging van sequentiebepalingsprimer <ol><li> Verdun de sequencing primers met 0,3 uM annealing buffer en 25 pl afzien in elk putje van een reactieplaat. Plaats de plaat op het werkstation. </li><li> Vul het werkstation goten volgens fig. 5 diagram. </li><li> Schakel de vacuümpomp, en zorg ervoor dat de schakelaar op het vacuüm gereedschap is ingeschakeld (Figuur 6). Spoel het filter sondes met een hoge zuiverheidsgraad water (Milli-Q 18,2 MW x cm of gelijkwaardig) in trog 5 (figuur 5). Vul de bak met verse hoogzuivere water voor gebruik in stap 12. </li><li> Snel te werken, de positie van de PCR-plaat met kralen op de werkplek. Controleer of beide platen in dezelfde richting als bij de monsters werden geladen. </li><li> Met de vacuüm-schakelaar ON, verlagen het vacuümGereedschap in de putjes van de PCR-plaat gedurende 20 seconden of tot al volume is afgezogen. De beads worden opgevangen door het vacuüm gereedschap (figuur 7). </li><li> Met het vacuüm nog ON, spoelt u de tool met 70% ethanol (trog 1) gedurende 20 seconden of totdat alle volume is opgezogen. </li><li> Met vacuum ON, spoelt u de tool met denaturatie-oplossing (goot 2) gedurende 20 seconden of totdat alle volume is opgezogen. </li></ol> Opmerking: De denaturatie oplossing bevat natriumhydroxide, die een oog en huidirritatie. Draag altijd een laboratoriumjas, handschoenen en een veiligheidsbril. <ol start="8"><li> Met vacuum ON, spoelt u de tool met wasbuffer (goot 3) gedurende 20 seconden of totdat alle volume is opgezogen. </li><li> Met vacuum ON, verhogen het vacuüm tool om buiten 90 ° verticaal voor 5 seconden, zodat alle vloeistof uit de vacuüm tool. Schakel de pomp uit, en lijn het vacuüm tool met de reactie plaat. Laat de stofzuiger gereedschap in deputten en schud van links naar rechts om de kralen introductie in de putjes die sequencing primer. </li><li> Om het vacuüm hiervan schoon schud het filter probes in hoge zuiver water (goot 4) gedurende 10 sec. </li><li> Schakel de stofzuiger aan en spoel de tool met een hoge zuiverheidsgraad water (trog 5) gedurende 20 seconden of totdat alle volume is opgezogen. </li><li> Hef het vacuüm tool om buiten 90 ° C verticaal voor 5 sec, zet vervolgens de stofzuiger uit en op te slaan in de stand &quot;Park&quot;. </li></ol> Gloeien sequencing primer om DNA-strengen <ol><li> Plaats de reactie plaat in een voorverwarmde plaat houder. </li><li> Verwarm de plaat op een verwarmingsblok bij 80 ° C gedurende 2 minuten. </li><li> Verwijder de plaat uit de houder en plaats op de teller afkoelen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. </li></ol> Pyromark Q24 Operation Opmerking: Schakel het apparaat met de schakelaar boven de stroomkabel. Stertup kan tot 1 min. <ol><li> Vul een cartridge volgens de instructies in de PyroMark Gold Q24 Reagentia Handboek 2. Om te bepalen volumes nodig, het opzetten van een run-bestand in het instrument software, en onder het menu Extra selecteert Pre Run Informatie </li><li> Als het instrument was al op, ervoor te zorgen dat het niet is het uitvoeren van een run en open vervolgens het deksel. Een akoestisch waarschuwingssignaal zal worden uitgezonden als de deksel wordt geopend wanneer het onveilig is om dat te doen. </li><li> Open de cartridge poort en plaats de cassette met het label naar voren (figuur 8). Zorg ervoor dat de cartridge goed is geplaatst (een lijn moet zichtbaar zijn aan de voorzijde te zijn) en sluit de poort. </li><li> Open de plaathoudende frame en plaats de plaat met samples in het instrument. </li><li> Sluit de plaathoudende frame en het instrument deksel (Figuur 9). </li></ol> Het starten van een run <ol><li> Steek de USB-stick met de run-bestands gemaakt met het instrument software in de USB-poort aan de voorzijde van het instrument. </li><li> Selecteer &#39;Uitvoeren&#39; in het hoofdmenu en druk op &quot;OK&quot;. </li><li> Gebruik de pijltoetsen om het gewenste run bestand te selecteren en druk op &quot;Select&quot;. </li></ol> Opmerking: Het instrument zal beginnen doseren reagentia als alle vooraf ingestelde druk en temperatuur zijn bereikt (dit kan enkele minuten duren). Tijdens een run, het scherm toont het toestel de pyrogram van de geselecteerde goed in real-time. Gebruik de pijltoetsen om de pyrogram van andere bronnen bekijken. Het invullen van een run <ol><li> Wanneer het instrument bevestigt dat de run is voltooid en de run bestand is opgeslagen op de USB-stick, druk op &quot;Close&quot;. </li><li> Verwijder de USB-stick. Indien het werd verwijderd voordat de run klaar, steek de USB-stick. Selecteer &quot;Beheer&quot; en vervolgens &quot;Copy-opgeslagen Runs&quot;. </li><li> De run-bestand kan nu worden geopend en geanalyseerd met behulp van het instrument software en vergelekeneen bibliotheek van bekende bacteriën met de Identifire software. </li></ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22PyroMark+PCR+Handbook%22">PyroMark PCR Handbook</a>. , [about 27p.]. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.qiagen.com/handbooks">http://www.qiagen.com/handbooks</a> (2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22PyroMark+Q24+User+Manual%22">PyroMark Q24 User Manual</a>. , [about 27p.]. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.qiagen.com/handbooks">http://www.qiagen.com/handbooks</a> (2012).</li>
<li>Elahi, E., Ronaghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrosequencing%3A+a+tool+for+DNA+sequencing+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Bio%22%5BJournal%5D)">Pyrosequencing: a tool for DNA sequencing analysis.</a> Methods Mol. Bio. 255, 211-219 (2004).</li>
<li>Fakhrai-Rad, H., Pourmand, N., Ronaghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrosequencing%3A+and+accurate+detection+platform+for+single+nucleotide+polymorphisms%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mutat%22%5BJournal%5D)">Pyrosequencing: and accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms.</a> Hum. Mutat. 19 (5), 479-485 (2002).</li>
<li>Langaee, T., Ronaghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+analyses+by+pyrosequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Genetic variation analyses by pyrosequencing.</a> Mutat. Res. 573 (1-2), 96-102 (2005).</li>
<li>Liu, Z., Lozupone, C., Hamady, M., Bushman, F. D., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+pyrosequencing+reads+suffice+for+accurate+microbial+community+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Short pyrosequencing reads suffice for accurate microbial community analysis.</a> Nucleic Acids Res. 35 (18), e120(2007).</li>
<li>Novais, R. C., Thorstenson, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+Pyrosequencing+for+microbiology%3A+From+genes+to+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">The evolution of Pyrosequencing for microbiology: From genes to genomes.</a> J. Microbiol. Methods. 86 (1), 1-7 (2011).</li>
<li>J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+pyrosequencing+and+microbial+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Metagenomic pyrosequencing and microbial identification.</a> Clin. Chem. 55 (5), 856-866 (2009).</li>
<li>Quince, C., Lanzen, A., Curtis, T. P., Davenport, R. J., Hall, N., Head, I. M., Read, L. F., Sloan, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+determination+of+microbial+diversity+from+454+pyrosequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Accurate determination of microbial diversity from 454 pyrosequencing data.</a> Nat. Methods. (9), 639-6341 (2009).</li>
<li>Ronaghi, M., Karamohamed, S., Pettersson, B., Uhlen, M., Nyren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+DNA+sequencing+using+detection+of+pyrophosphate+release%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release.</a> Anal. Biochem. 242, 84-89 (1996).</li>
<li>King, C., Scott-Horton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrosequencing%3A+A+simple+method+for+accurate+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Pyrosequencing: A simple method for accurate genotyping.</a> J. Vis. Exp. (11), e630(2008).</li>
<li>Rothberg, J. W., Heinz,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+semi-conductor+device+that+enabling+non-optical+genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing.</a> Nature. 475, 348-352 (2011).</li>
<li>Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zero-Mode+Waveguides+for+Single-Molecule+Analysis+at+high+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Zero-Mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations.</a> Science. 299, 682-686 (2003).</li>
<li>Eid, J., Fehr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+DNA+Sequencing+from+Single+Polymerase+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules.</a> Science. 323, 133-138 (2009).</li>
<li>Sequencing Technology | Sequencing by Synthesis | Illumina [Internet]. , Illumina. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.illumina.com/technology/sequencing_technology.ilmn">http://www.illumina.com/technology/sequencing_technology.ilmn</a> (2012).</li>
</ol>

Productie en gratis toegang tot dit artikel wordt gesponsord door Qiagen. Auteurs Ahmed, Durocher, Jessen en Vardi zijn medewerkers van Qiagen Inc, dat reagentia en instrumenten gebruikt in dit artikel oplevert.

Verschillende nieuwe next generation sequencing methoden zijn gecommercialiseerd. Drie van de meest gebruikte methoden ion halfgeleider sequencing, molecuul realtime sequencing en sequentiebepaling door synthese (SBS). 3-11 Elk van deze werkwijzen afhankelijk van sequentiebepaling door synthese maar investeren nieuwe platforms voor de detectie van de opgenomen nucleotiden. In ion halfgeleider sequencing, een enkele streng van DNA dient als een matrijs voor de sequentiebepaling streng. 12 Polymerase en nucleotiden opeenvolgend in pyrosequencing toegevoegd. Wanneer een nucleotide wordt toegevoegd aan de groeiende DNA-streng, is een waterstof-ion vrijgegeven. De waterstof ionen wordt gedetecteerd door een veldeffect transistor gebaseerde sensor. Single molecule realtime sequencing afhankelijk van de nul-stand golfgeleider (ZMW). ZMW 13 is een kleine structuur waarin een polymerase molecule is bevestigd aan de bodem van de put. Het wordt belicht zodanig dat een floregeur molecuul kan worden gedetecteerd. Elke nucleotide is gelabeld met een fluorescerend molecuul. Als fluorescent gelabeld nucleotide wordt geïncorporeerd, een detector identificeert de nucleotide. Wanneer de volgende nucleotide wordt toegevoegd, wordt de fluorescerende molecule gesplitst. 14 Sequentiebepaling door synthese (SBS) maakt gebruik van een unieke methode voor het amplificeren van de doelwit DNA zodat clusters van unieke sequenties worden gegenereerd. Single 15 matrijzen worden gegenereerd en de complementaire streng wordt gesynthetiseerd. Elk nucleotide wordt gelabeld met een fluorescerend molecuul en na elke toevoeging base de fluorescentie van de toegevoegde base wordt opgenomen.

Pyrosequencing is een snelle en accurate manier om sequentie nucleïnezuren die is gebaseerd op het principe van &quot;sequentiebepaling door synthese&quot;. &quot;Sequencing door synthese&quot; omvat met een enkelstrengs DNA-matrijs van de complementaire streng een basisstation tegelijk synthetiseren, en het detecteren van de opgenomen base (A, T, G of C) bij elke stap door detectie van een chemiluminescent signaal. Het reactiemengsel omvat pyrosequentiebepaling matrijs DNA, dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), DNA-polymerase, ATP sulfurylase, luciferine, luciferase en apyrase. De synthese reactie wordt geïnitieerd door de toevoeging van een van de vier dNTP&#39;s en DNA polymerase de enkelstrengige gebiotinyleerde matrijs-DNA. DNA polymerase bevat de aanvullende dNTP op de mal, met de daaropvolgende afgifte van pyrofosfaat (figuur 1). ATP sulfurylase zet de verhouding pyrofosfaat aan ATP. ATP werkt als een katalysator voor de luciferase-gemedieerde omzetting van luciferine tot oxyluciferine, welkegenereert licht (figuur 2). De intensiteit van het licht is evenredig met het aantal nucleotiden opgenomen en bepaalt of een of meer specifieke dNTP&#39;s (dATP, dTTP, dGTP en dCTP) aanwezig op de matrijsstreng achtereenvolgens (figuur 3) is. Eventuele niet opgenomen dNTP wordt afgebroken door apyrase vóór toevoeging van de volgende dNTP voor de voortzetting van de synthesereactie. Deze &quot;sequentiebepaling door synthese&quot; reactie wordt herhaald met toevoeging van elk van de vier dNTPs tot de DNA-sequentie van het enkelstrengs DNA-matrijs wordt bepaald. Om een animatie van de pyrosequentiebepaling reactie te bekijken <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50405/50405movie1.mov" target="_blank">Klik hier om de film te bekijken</a> .

<table><tbody><tr><td>PyroMark PCR Master Mix, 2x</td><td>Qiagen</td><td>978703</td><td></td></tr><tr><td>CoralLoad Concentrate, 10x</td><td>Qiagen</td><td>978703, 978705</td><td></td></tr><tr><td>Q-Solution, 5x</td><td>Qiagen</td><td>978703, 978705</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2, 25 mM</td><td>Qiagen</td><td>978703, 978705</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Free Water</td><td>Qiagen</td><td>129112</td><td></td></tr><tr><td>Primers</td><td>Qiagen</td><td>978776 of 978777</td><td>Primers moeten worden gekocht bij een gevestigde oligonucleotidafabrikant (d.w.z. QIAGEN Pyromark Custom Assays, IDT, etc). Lyofilisaatprimers moeten worden opgelost in TE om een stockoplossing van 100 &mu;M te verkrijgen.</td></tr><tr><td>Pyromark Gold Q24 Reagents</td><td>Qiagen</td><td>970802</td><td></td></tr><tr><td>Water met hoge zuiverheid (Milli-Q 18,2 M&Omega; x cm of gelijkwaardig)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Sepharose High Performance Beads</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5113-07</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Annealing Buffer</td><td>Qiagen</td><td>979009</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Denaturation Solution</td><td>Qiagen</td><td>979007</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Wash Buffer</td><td>Qiagen</td><td>979008</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Q24</td><td>Qiagen</td><td>9001514</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Q24 Cartridge</td><td>Qiagen</td><td>979202</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Q96 HS Tip Holder Box</td><td>Qiagen</td><td>979105</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Q24 Vacuum Workstation</td><td>Qiagen</td><td>9001516</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Q24 Plate Holder</td><td>Qiagen</td><td>9022273</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>Fisher</td><td>11-675-297</td><td></td></tr><tr><td>Heat block</td><td>Fisher</td><td>11-718Q</td><td></td></tr></tbody></table>

pyrosequentiebepaling voor microbiële identificatie en karakterisering

Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Pyrosequencing is een veelzijdige techniek die microbiële genoom die kan worden gebruikt om bacteriële species te identificeren, onderscheiden bacteriestammen en detecteren genetische mutaties die resistentie tegen antimicrobiële middelen vergemakkelijkt. De voordelen van pyrosequentiebepaling voor microbiologie toepassingen zijn onder meer een snelle en betrouwbare high-throughput screening en accurate identificatie van microben en microbiële genoom mutaties. Pyrosequencing omvat sequentiebepaling van DNA door het synthetiseren van de complementaire streng een basisstation tegelijk, het bepalen van de specifieke nucleotide wezen opgenomen tijdens de synthesereactie. De reactie op geïmmobiliseerd enkelstrengs matrijs-DNA waar de vier deoxyribonucleotiden (dNTP) achtereenvolgens toegevoegd en de niet opgenomen dNTP enzymatisch afgebroken vóór toevoeging van de volgende dNTP de synthesereactie. Detectie van de specifieke base opgenomen in de sjabloon wordt gecontroleerd door generatie chemiluminescent signalen. De volgorde van dNTPs die de chemiluminescerende signalen produceren bepaalt de DNA sequentie van de matrijs. De real-time sequencing vermogen van pyrosequencing technologie maakt snelle microbiële identificatie in een enkele assay. Bovendien is de pyrosequencing instrument kan analyseren volledige genetische diversiteit van antimicrobiële resistentie, inclusief de typering van SNPs, puntmutaties, inserties en deleties, en kwantificering van meerdere genkopieën voordoen bij sommige antimicrobiële resistentie patronen.

De resultaten van een typische run pyrosequencing met de software toont de locatie van de voorwaartse en achterwaartse primers die voor amplicon productie en de sequencing primer voor de pyrosequencing reactie binnen het geconserveerde 16S ribosomale sequentie (Figuur 10). De hypervariabele sequentie tussen de primer plaatsen maakt bacteriële identificatie van een groot aantal bacteriesoorten met de geconserveerde sequentie primer (5&#39;-TACATGCAAGTCGA). Als een interne kwaliteitscontrole, de DNA sequentie bracketing het variabele gebied kunnen worden gecontroleerd om te verzekeren dat de juiste DNA gebied geanalyseerd . De pyrosequentiebepaling software maakt vergelijking en aanpassing van de gegenereerde sequentie een interne database van bacteriële ribosomale sequenties voor identificatie van bacteriën. Daarnaast kan een sequentie worden geanalyseerd om mutaties die antibioticum resistentie bepalen. Bijvoorbeeld, analyse van mutaties in het 23S ribosomale genen Helicobacter pylori toont twee mutatie patronen (GAA of AGA) dat resistentie tegen antibiotica verlenen (figuur 11). Analyse van meerdere isolaten van dezelfde patiënt kunnen gelijktijdig worden getest op het ontstaan ​​van resistentie tegen geneesmiddelen te volgen in de tijd om te helpen bij epidemiologisch onderzoek naar resistentie tegen antibiotica uitbraken. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig1.jpg" /> Figuur 1. Gebiotinyleerd PCR-product wordt gebruikt als een sjabloon om dNTP nemen door DNA polymerase, waardoor de vorming van pyrofosfaat (PPi). <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig2.jpg" /> Figuur 2. ATP sulfurylase converteert verhouding pyrofosfaat aan ATP. ATP katalyseert de luciferase-gemedieerde omzetting van luciferine tot oxyluciferine, dat licht dat pro genereertgepasseerde de hoeveelheid ATP. Het licht wordt opgenomen als piek op de pyrogram spoor en geeft nucleotide incorporatie. De niet opgenomen dNTPs zijn afgebroken door apyrase voordat de volgende dNTP wordt toegevoegd voor de voortzetting van de synthese. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig3.jpg" /> Figuur 3. De intensiteit van het opgewekte licht geeft aan of een of meer specifieke dNTP&#39;s (dATP, dTTP, dGTP en dCTP) werd achtereenvolgens opgenomen op de matrijsstreng. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig4.jpg" /> Figuur 4. Stroomschema voor de bereiding van master mix aan het gebiotinyleerde PCR-product te immobiliseren. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig5.jpg" /> ge = &quot;altijd&quot;&gt; Figuur 5. PyroMark werkstation, met PCR-plaat, PyroMark plaat, en dal locaties. <img alt="Figuur 6" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig6.jpg" /> Figuur 6. Locaties van de Vacuum schakelaar aan en uit posities. <img alt="Figuur 7" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig7.jpg" /> Figuur 7. Vacuüm tool. Deskundige behandeling van het vacuüm tool. <img alt="Figuur 8" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig8.jpg" /> Figuur 8. Cartridge poort met cartridge geopend in plaats. <img alt="Figuur 9" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig9.jpg" /> Figuur 9. Cartridge correct geplaatst met poort gesloten. &quot;Fo: keep-together.within-page =&quot; altijd &quot;&gt; <img alt="Figuur 10" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig10.jpg" /> Figuur 10. Pyrosequencing based bacteriële identificatieresultaten. PCR primers ontworpen voor geconserveerde gebieden van de DNA-matrijs en de primer sequentie onmiddellijk stroomopwaarts van een goed gekarakteriseerd identificeren hypervariabele DNA sequentie in het amplicon (in blauw). <img alt="Figuur 11" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig11.jpg"/> Figuur 11. Detectie van antibiotica resistentie in Helicobacter pylori met pyrosequencing. Analyse van de mutaties in het 23S genen die antibacteriële resistentie in Helicobacter pylori met GAA of AGA sequenties. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50405/50405fig11large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <table border="1"><tbody><tr> &lt;td&gt; Component </td><td> Volume per reactie </td><td> Eindconcentratie </td></tr><tr><td> Pyro PCR Master Mix, 2x </td><td> 12,5 ul </td><td> 1x </td></tr><tr><td> CoralLoad Concentrate, 10x </td><td> 2,5 pl </td><td> 1x </td></tr><tr><td> 25 mM MgCl2 (optioneel) </td><td> Veranderlijk </td><td> ≥ 1,5 mM </td></tr><tr><td> Q-Solution, 5x (optioneel) </td><td> 5 pi </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Primer A / Primer B </td><td> Variabele / Variabele </td><td> 0.2 μM/0.2 uM </td></tr><tr><td> RNase-free water </td><td> Veranderlijk </td><td> - </td></tr><tr><td> Totaal Volume (na toevoeging van het template-DNA) </td><td> 25 gl </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 1. PCR reactiemengsel. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> &amp; Nbsp; </td><td></td><td> Aanvullende opmerkingen </td></tr><tr><td> Eerste PCR activeringsstap </td><td> 15 min </td><td> 95 ° C </td><td> HotStartTaq DNA Polymerase geactiveerd </td></tr><tr><td> 3 stap fietsen: Denaturatie </td><td> 30 sec </td><td> 94 ° C </td><td></td></tr><tr><td> Gloeien </td><td> 30 sec </td><td> 60 ° C 56 ° C </td><td> Voor genomisch DNA Voor bisulfiet omgezet DNA </td></tr><tr><td> Uitbreiding </td><td> 30 sec </td><td> 72 ° C </td><td></td></tr><tr><td> Aantal cycli </td><td> 45 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Laatste verlenging </td><td> 10 min </td><td> 72 ° C </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 2. PCR Cycle Specificaties.

Pyrosequencing is een veelzijdige techniek die microbiële genoom die kan worden gebruikt om bacteriële species te identificeren, discrimineren bacteriestammen en detecteren genetische mutaties die resistentie tegen antimicrobiële middelen vergemakkelijkt. In deze video, zal de procedure voor microbiële amplicon generatie, amplicon pyrosequencing, en DNA-sequentie-analyse worden aangetoond.

Pyrosequentiebepaling voor Microbiële identificatie en karakterisering

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het identificeren van een bacterie via 16 s ribosomaal DNA-sequentieanalyse met behulp van de pyrosequencing-methodologie. Dit wordt bereikt door eerst het doeleind-DNA te amplificeren via een polymerasekettenreactie met behulp van een gebiotineerde primer. Het gebiotineerde amplicon wordt vervolgens geïmmobiliseerd met streptavidine-gecoate spheros-beads en gezuiverd met behulp van wasbuffers.Vervolgens wordt het amplicon gedenatureerd en worden 16 s ribosomale sequencing-primers aan de enkelstrengs DNA-strengen gekoppeld. Het doel van deze stap is om het DNA voor te bereiden voor sequencing. Ten slotte vindt de DNA-sequencingreactie plaats via pyrosequencing, een snelle en nauwkeurige methode voor het sequensen van nucleïnezuren op basis van het principe van sequencing door synthese.Het gebiotinyleerde alicon wordt door DNA-polymerase als template gebruikt om dNTP's één base per keer in te bouwen, wat leidt tot de generatie van pyrofosfaat. Een TP Sul Urease zet pyrofosfaat proportioneel om in A-T-P-A-T-P, wat de luciferase-gemedieerde omzetting van Lucifer naar Lucifer katalyseert, waarbij licht wordt gegenereerd dat proportioneel is aan de hoeveelheid a TP. Het licht wordt geregistreerd als een piek op de pyro-trace en duidt de inbouw van nucleotiden aan. De niet-ingebouwde dNTP's worden afgebroken door apras voordat de volgende dNTP wordt toegevoegd voor de voortzetting van de synthese.Het op het programma geregistreerde chemiluminescentiesignaal maakt het mogelijk om de DNA-sequentie te bepalen. De verkregen resultaten zijn ribosomale 16S rDNA-sequenties, die worden gebruikt om de bacterie te identificeren door vergelijking met een referentiedatabase voor ribosomaal DNA. Pyrosequencing is een veelzijdige techniek die microbiële genoomsequencing faciliteert en kan worden gebruikt om bacteriële soorten te identificeren, bacteriële stammen te onderscheiden en genetische mutaties te detecteren die resistentie tegen antimicrobiële middelen veroorzaken.In deze video wordt de procedure voor de generatie van bacteriële ampliconen, amplicon pyrosequencing en DNA-sequentieanalyse gedemonstreerd. Om te beginnen met de procedure voor template-amplificatie, ontdooi alle benodigde oplossingen en meng deze grondig. Al het werk kan bij kamertemperatuur worden uitgevoerd. Stel de PCR-reactie op volgens deze tabel.Houd er rekening mee dat een uiteindelijke magnesiumchlorideconcentratie van 1,5 millimolar in de meeste gevallen voor bevredigende resultaten zal zorgen. Indien echter een hogere magnesiumconcentratie vereist is, kan tot 3,5 microliters van 25 millimolar magnesiumchloride aan een reactie worden toegevoegd. Eén primer moet aan het 5'-uiteinde gebiotinyleerd zijn, en het wordt aanbevolen dat de primer grondig via HPLC is gezuiverd.Meng het reactiemengsel door voorzichtig met de pipet op en neer te bewegen en verdeel vervolgens de juiste volumes over de PCR-buisjes. Voeg daarna template-DNA toe aan elk PCR-buisje. Een hoeveelheid van 10 nanogram genomisch DNA per reactie wordt aanbevolen.Plaats de PCR-buisjes in een thermocycler en start dit cyclusp programma voordat de mastermix wordt bereid. Draai de fles met strep avid en gecoate seros-beads voorzichtig rond om een homogene suspensie te garanderen. Maak een mastermix volgens dit stroomschema.Combine de beads, bindbuffer en ultrapuur water in een microcentrifugebuis. Afhankelijk van het gebruikte volume PCR-product, wordt 60 tot 75 µL mastermix in elke well van een PCR-plaat gedoseerd, zodat het totale volume 80 µL per well bedraagt. Voeg vijf tot 20 µL gebiotineerd PCR-product toe aan elke well.Het volume per put moet nu 80 µL zijn. Sluit de putten af met stripdoppen en agiteer de PCR-plaat gedurende vijf tot 10 minuten bij kamertemperatuur op 1.400 RPM met een orbitale schudmachine. Begin deze procedure door de sequencingprimers te verdunnen tot 0,3 µM met een annealing-buffer en verdeel 25 µL over elke put van de reactieplaat.Plaats de plaat op het vacuümstation. Vul de reservoirs van het station volgens dit schema. 50 milliliters 70%ethanol in reservoir één, 40 milliliters denaturatieoplossing in reservoir twee, 50 milliliters wasbuffer in reservoir drie, 50 milliliters ultrapuur water in reservoir vier en 70 milliliters ultrapuur water in reservoir vijf.Zet de vacuümpomp aan en controleer of de schakelaar op het vacuüminstrument op 'aan' staat; spoel de filterprobes met water van hoge zuiverheid. Plaats in goot vijf de PCR-plaat met beads op het werkstation, waarbij u erop let dat zowel de PCR- als de reactieplaten in dezelfde oriëntatie staan. Laat het vacuüminstrument in de wells van de PCR-plaat zakken.Houd het vacuüm aan gedurende 20 seconden of totdat het volledige volume is geaspireerd, zodat de beads door het vacuüminstrument worden vastgehouden. Spoel het instrument gedurende 20 seconden of totdat het volledige volume is geaspireerd met 70% ethanol. Spoel het instrument vervolgens gedurende 20 seconden of totdat het volledige volume is geaspireerd met denaturatie-oplossing.Spoel het instrument daarna 20 seconden lang met wasbuffer, of totdat het volledige volume is geaspireerd terwijl de vacuümpomp nog aanstaat. Til het vacuuminstrument gedurende vijf seconden tot boven de 90 graden verticaal om alle vloeistof uit het instrument te laten weglopen. Schakel nu de pomp uit en richt het vacuuminstrument uit met de derde reactieplaat.Laat het vacuüminstrument in de putjes zakken. Schud vervolgens voorzichtig van links naar rechts gedurende ongeveer 10 seconden om de beads in de putjes met sequencingsprimer vrij te laten komen. Plaats het vacuüminstrument in het waterbad om het te reinigen, zodat de sequencingsprimer kan annealen aan het DNA.Plaats de reactieplaat in een voorverwarmde platenhouder. Verhit de plaat gedurende twee minuten bij 80 °C. Neem de plaat uit de houder en plaats deze op het aanrecht om vijf minuten af te koelen tot kamertemperatuur.Begin deze procedure door het instrument in te schakelen met de aan/uit-schakelaar boven het netsnoer om de benodigde volumes te bepalen. Maak een run-bestand aan in de software van het instrument en selecteer onder het menu 'tools' de optie 'pre-run information'. Vul een cartridge volgens de instructies op de pagina 'pre-run information'.Plaats de pipetpunt in de hoek van elke put zo diep mogelijk, waarbij u erop let dat er geen luchtbellen aanwezig zijn. Open de klep van de cartridge en schuif de cartridge in met het label naar voren. Controleer of de cartridge correct is geplaatst en sluit de klep.Open het plaatvasthoudframe en plaats de reactieplaat in het instrument. Sluit het plaatvasthoudframe en het instrumentdeksel. Steek de USB-stick met de run-bestanden, aangemaakt met de instrumentsoftware, in de USB-poort aan de voorzijde van het instrument.Klik op OK om het menu met de gewenste run-bestanden te zien. Gebruik de scrollpijlen om het gewenste run-bestand te selecteren en druk op selecteer. Zodra alle ingestelde druk- en temperatuurniveaus zijn bereikt, begint het instrument met het dispenseren van reagentia tijdens een run.Het scherm van het instrument toont de pyrogram van de geselecteerde well in realtime. Gebruik de scrollpijlen om de pyrogrammen van andere wells te bekijken. Wanneer het instrument bevestigt dat de run is voltooid en het runbestand op de USB-stick is opgeslagen, druk op sluiten.Verwijder de USB-stick. De resultaten van een typische pyrosequencing-run worden hier getoond. Forward- en reverse-PCR-primers zijn ontworpen voor geconserveerde regio's van het DNA-template, namelijk de 16 s ribosomale sequentie.In dit voorbeeld is de sequeneringsprimer direct stroomopwaarts geplaatst van een goed gekarakteriseerde, identificerende hypervariabele DNA-sequentie binnen het amplicon, weergegeven in het blauw. Deze hypervariabele sequentie maakt de bacteriële identificatie van een groot aantal bacteriële soorten mogelijk, waarbij de geconserveerde sequeneringsprimer dient als interne kwaliteitscontrole; de DNA-sequentie die het variabele gebied omsluit, kan worden gecontroleerd om te bevestigen dat de juiste DNA-regio is geanalyseerd. De pyrosequeneringssoftware maakt het mogelijk om de gegenereerde sequentie te vergelijken en uit te lijnen met een interne database van bacteriële ribosomale sequenties voor bacteriële identificatie.Daarnaast kan een sequentie worden geanalyseerd om mutaties te bepalen die antibioticaresistentie veroorzaken. Bijvoorbeeld, analyse van mutaties in de 23 s ribosomale genen van Helicobacter pylori onthult twee mutatiepatronen, GAA of GA, die antibioticaresistentie verlenen. Pyrosequencing is een veelzijdige techniek die microbiële genoomsequencing faciliteert.De voordelen van pyrosequencing voor microbiologische toepassingen omvatten snelle en betrouwbare high-throughput screening en nauwkeurige identificatie van microben en mutaties in het microbiële genoom. Bovendien kan de pyrosequencing-methodiek de volledige genetische diversiteit van antimicrobiële resistentie analyseren, inclusief het typeren van SNP-puntmutaties, inserties en deleties, evenals de kwantificering van meerdere genkopieën die kunnen voorkomen bij sommige antimicrobiële resistentiepatronen. Bedankt voor het kijken naar deze video en veel succes met uw sequencing-experimenten.

pyrosequencing-for-microbial-identification-and-characterization

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Pyrosequencing (R) is een van de meest grondige toch eenvoudige methoden tot op heden gebruikt om de polymorfismen te analyseren. Deze methode heeft geleid tot een snelle en efficiënte single-nucleotide polymorfisme evaluatie met inbegrip van vele klinisch relevante polymorfismen. De techniek en de methodologie van Pyrosequencing wordt uitgelegd.

Pyrosequencing: een eenvoudige methode voor Nauwkeurige Genotyping

De actieve bacteriegemeenschappen geassocieerd met de darm van Spodoptera littoralis, werd bepaald door stabiele-isotoop probing (SIP) gekoppeld pyrosequencing. Met behulp van deze methodiek, de identificatie van de metabolisch actieve bacteriën soorten binnen de gemeenschap werd gedaan met een hoge resolutie en nauwkeurigheid.

Identificatie van metabool actieve bacteriën in de darm van de Generalist<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; Via DNA Stabiele Isotopen Onderzoek naar gebruik van<sup&gt; 13</sup&gt; C-Glucose

Het karakteriseren van microbiële gemeenschappen is een al lang bestaand doel in de milieumicrobiologie. Methoden voor next-generation sequencing maken nu de karakterisering van microbiële gemeenschappen mogelijk op een ongekende diepte met minimale kosten en arbeid. We beschrijven hier onze aanpak om bacteriële 16S ribosomale RNA-genen te sequencen met behulp van een tafelsequencer.

Next-generation sequencing van het 16S ribosomaal RNA Gene Amplicons

Matrix-ondersteunde laserdesorptie/ionisatie tijd-van-vlucht massaspectrometrie (MALDI-TOF MS) en moleculaire technieken (16S rRNA gen sequencing) maken de identificatie van zeldzame bacteriële pathogenen in routine diagnostische mogelijkheden. Het doel van dit protocol ligt in de combinatie van beide technieken, wat leidt tot meer nauwkeurige en betrouwbare gegevens.

Identificatie van bijzondere bacteriële pathogenen door 16S rRNA Gene Sequencing en MALDI-TOF MS

We beschrijven een efficiente en rendabele methode voor het extraheren van nucleïnezuur uit uitstrijkjes ter karakterisering van bacteriële 16S rRNA gen gebruiken amplicon sequencing. De methode maakt het mogelijk voor een gemeenschappelijke aanpak voor de verwerking van meerdere soorten monster en herbergt een aantal downstream-analytische processen.

Efficiënte Nucleic Acid Extraction en 16S rRNA Gene Sequencing voor Bacteriële Gemeenschap karakterisering

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerde gestandaardiseerde protocol voor high-throughput 16S rRNA-amplicon sequencing. Het protocol introduceert een protocol van het geïntegreerde, geüniformeerde haalbaar en goedkoop vanaf fecale sample collectie door middel van data-analyses. Dit protocol maakt analyse van grote aantallen monsters met strenge normen en diverse besturingselementen.

Begeleide Protocol voor fecale microbiële karakterisering door 16S rRNA-Amplicon Sequencing

We presenteren het proces van het isoleren, verspreiden en karakteriseren van koolwaterstofafbrekende bacteriën uit aquatische habitats. Het protocol schetst bacteriële isolatie, identificatie door de 16S-rRNA-methode en het testen van hun koolwaterstofafbrekend potentieel. Dit artikel zou onderzoekers helpen bij het karakteriseren van microbiële biodiversiteit in milieumonsters, en specifiek screenen op microben met bioremediatiepotentieel.

Isolatie, vermeerdering en identificatie van bacteriële soorten met koolwaterstof metaboliserende eigenschappen uit aquatische habitats

Pyrosequencing assays maken de robuuste en snelle genotypering van mitochondriaal DNA single nucleotide polymorfismen in heteroplasmatische cellen of weefsels mogelijk.

Genotypering van enkelvoudige nucleotidepolymorfismen in het mitochondriale genoom door pyrosequencing

Het huidige artikel heeft tot doel gedetailleerde en adequate protocollen te bieden voor de isolatie van plant-geassocieerde endofytische schimmels, langdurige bewaring van isolaten, morfologische karakterisering en totale DNA-extractie voor daaropvolgende moleculaire identificatie en metagenomische analyses.

Isolatie, karakterisering en totale DNA-extractie om endofytische schimmels in mycoheterotrofe planten te identificeren

Het gebruik van specifieke glycosidases om suikers te verwijderen uit glycoproteïnen, gevolgd door SDS-PAGE is een waardevolle methode om glycan wijzigingen op eiwit-samples te detecteren en is een goede keuze voor de eerste glycobiologie studies. Veranderingen na deglycosylatie kunnen worden gedetecteerd als verschuivingen in gel mobiliteit of door kleuring met glycan gevoelige reagentia.

Identificatie en karakterisering van proteïne glycosylering met behulp van specifieke endo-en exoglycosidases

Leer pyrosequencing voor microbiële identificatie en karakterisering via 16S ribosomaal DNA-analyse. Deze methode detecteert bacteriële soorten en genetische mutaties die resistentie tegen antimicrobiële middelen veroorzaken.

Pyrosequentiebepaling voor Microbiële identificatie en karakterisering

Meer video's verkennen