Ongerichte Metabolomics uit biologische grondstoffen gebruiken UltraPerformance Liquid Chromatography-hoge resolutie massaspectrometrie (UPLC-HRMS)

Het algemene doel van het volgende experiment is om snapshots van de metabolische profielen van verschillende groepen biologische monsters te vergelijken. Dit wordt bereikt door gebruik te maken van een vloeibare, vloeibare extractie om organische en polaire moleculen te scheiden. Als tweede stap worden moleculen verder gescheiden door middel van vloeistofchromatografie en geanalyseerd door hoge resolutie massaspectrometrie, die retentietijd, massa-ladingsverhouding en intensiteitsgegevens levert voor verdere analyse.

Volgende vloeistofchromatografie runs worden uitgelijnd en functies worden gedetecteerd, gekwantificeerd en gesorteerd. Om differentieel abundantiekenmerken tussen groepen te identificeren. Resultaten tonen de verschillen in kenmerken tussen behandelingscondities op basis van differentiële abundantie van analyten zoals gedetecteerd door vloeistofchromatografie, hoge resolutie massaspectrometrie.

Hoewel deze methode kan worden gebruikt om cellulair metabolisme te bestuderen, kan het ook inzicht geven in biomarkerontdekking of zeno biotische metabolisme. Voor adherante lijnen, voeg 1,5 milliliter media toe aan de cellen in een 10 centimeter plaat. Plaats de plaat op ijs en schraap voorzichtig om de cellen op te heffen.

Breng de 1,5 milliliter opgehefde celsuspensie over naar een vooraf gelabelde 10 milliliter glazen centrifugeerbuis. Voeg vervolgens zes milliliter van twee op één chloroform methanol toe aan elk van de 10 milliliter glazen buizen met de monsters. Schud de monsters op lage snelheid gedurende 30 minuten. Na het schudden centrifugeert u de monsters met een lage versnellingsvertragingsinstelling bij 1.935 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius om de fasen volledig te scheiden met behulp van een lange stengel weidepipet.

Breng de organische laag over naar een nieuwe vooraf gelabelde 10 milliliter glazen centrifugeerbuis. Breng vervolgens de waterige laag over in een schone plastic twee milliliter einorbuis. Op dit punt verdampen de organische en waterige monsters onder stikstofgas.

Reconstitueer de gedroogde monsters in 50 tot 100 microliter van de startoplossing voor de gewenste UPLC-methode. Pipetteer het monster voorzichtig op en neer om het oplossen van de analyten te bevorderen. Breng vervolgens elk monster over in een 0,22 micron nylon buisfilter en draai tot 14.000 keer G gedurende ongeveer vijf minuten totdat het monster volledig door het filter is gegaan.

Inspecteer het monster om er zeker van te zijn dat er geen zichtbare precipitaat in het monster achterblijft. Breng de supernatant van het gefilterde monster over in een vooraf gelabelde UPLC-vial met insteekdop. Tik vervolgens om eventuele bubbels van de bodem van de monstervial te verwijderen.

Plaats het monster in de gekoelde autosampler. Maak nu een run voor het organische monster met behulp van de controlesoftware voor de vloeistofchromatograaf. Maak vervolgens een run voor het organische monster op basis van de geoptimaliseerde UPLC-condities.

Gebruik de geoptimaliseerde UPLC-condities om een methode voor de waterige fase te creëren. Als een bekend aantal doel analyten van groot belang is, optimaliseer de UPLC-condities met behulp van de zwaar gelabelde analoog van deze verbindingen en genereer een methode. Laat de UPLC onder deze omstandigheden adequaat gelijkwaardig worden.

Dit moet een volledige priming van oplosmiddelen omvatten. Voordat een kolom wordt bevestigd en volgens de aanwijzingen van de fabrikant voor het gelijkwaardig volume van een nieuwe kolom, houd een logboek bij van de startrugdruk om toekomstige problemen te helpen diagnosticeren met behulp van de controlesoftware voor de hoge resolutie massaspectrometer. Maak een positieve modus methode. Gebruik vervolgens dezelfde omstandigheden om een negatieve modus methode te maken.

Reinig en kalibreer het instrument. Zorg voor een stabiele spray in de spectrometer en geef de kalibratieoplossing tijd om adequaat te verdampen van de bron en de optica. Aanvaardbare stabiliteit van de spray moet een relatieve standaarddeviatie van de intensiteit van drie tot 5% geven over ten minste 100 scans met injectie van kalibratieoplossing bij dezelfde stroomsnelheid als de lc-methode die wordt gebruikt.

Gebruik een willekeurige getallengenerator en een sleutel om monsters op willekeurige wijze in te stellen om eventuele batcheffecten te voorkomen die worden geïntroduceerd door de analyse. Stel de volgorde voor alle monsters in. Stel het juiste injectievolume in en voer een blanco uit voordat het eerste monster wordt genomen.

Als er vermoedens zijn van carry-over of matrixeffecten tussen monsters, voer voldoende blanco's of wasbeurten uit, begin de sequentie en bewaak regelmatig problemen, inclusief drukfluctuaties of verlies van signaalintensiteit gedurende de run. Als ernstige problemen worden gedetecteerd, stopt u de run. Reinig en kalibreer het instrument.

Zorg voor een stabiele spray in de spectrometer en geef de kalibratieoplossing tijd om adequaat te verdampen van de bron en de optica. Voordat u begint met differentiële analyse, controleert u handmatig de totale ionisatiestromen of bekijkt u gefilterde chromatogrammen voor een bekend verbinding in het monster. Om de reproduceerbaarheid van runs en injectie/UPLC/spray stabiliteit gedurende alle monsters te garanderen, brengt u de RAW-gegevensbestanden van de massaspectrometer over naar de harde schijf van de werkstation waar sieve is geïnstalleerd.

Open sieve. Begin een nieuw experiment en laad de juiste bestanden in sieve. Wijs vergelijkingsgroepen toe en selecteer een enkele referentiebestand om SIE V toe te staan de parameters voor analyse te genereren.

Volg de aanwijzingen en pas eventuele parameters aan volgens de vereisten van elk individueel experiment. Laad de juiste adductlijst voor positieve of negatieve modus in de parameters. Zodra de analyse is voltooid, controleert u of een lijst met frames op het scherm is gevuld.

Zorg ervoor dat de lc-uitlijning overeenkomt met eventuele landmark pieken. Als een van de niet-uitgelijnde lc-runs grote afwijkingen vertoont in landmark pieken. Dit kan wijzen op een probleem met het monster.

Plot de gegevens op basis van de coëfficiënt van variatie binnen een vergelijkbare monsterpopulatie. Sorteer de lijst op basis van gewenste eigenschappen. Bekijk vervolgens elke piek op juiste piek uitlijning tussen groepen.

Piekintegratie, Gaussiaans, piekvorm signaalintensite