Een Hemacytometer gebruiken om cellen te tellen
Celtelling is een belangrijke stap in veel cel-gebaseerde assays om het aantal cellen en levensvatbaarheid te bepalen. Over het algemeen is het doel van het tellen om te begrijpen hoeveel een monster van een onbekende celconcentratie moet worden verdund voor verder gebruik. Het meest gebruikte laboratoriuminstrument voor het tellen van cellen is de hemocytometer.
De hemocytometer is een tellinstrument dat oorspronkelijk werd gemaakt voor het tellen van bloedcellen. In het midden van de hemocytometer bevinden zich twee telkamers, waarop een met een laser geëtst raster kan worden gevonden.
Het raster bestaat uit 9 grote kwadranten. De vier hoekkwadranten zijn verder verdeeld in 16 kleinere kwadranten. Het centrale kwadrant is verdeeld in 25 van deze kleinere kwadranten, die elk verder zijn verdeeld in 16 micro-kwadranten.
Aan het uiteinde van elke kamer bevinden zich monsterinvoerpoorten, waarin het te tellen celmonster wordt gespoten.
Aan weerszijden van de telkamers bevinden zich de dekglasmontagesteunen, waarop het kwartsdekglas rust, meestal ongeveer 0,1 mm boven de telkamer.
Aangezien het oppervlak van elk groot vierkant 1 mm2 is, is het volume dat door elk groot vierkant wordt ingesloten 0,1 mm3 of 1/10.000e van een ml.
Voor het tellen, neem altijd even de tijd om ethanol en een kimdoek te gebruiken om eventuele pluisjes, vingerafdrukken of watermerken van het dekglas en de telkamer schoon te maken en te drogen.
Voeg vervolgens voorzichtig een kleine hoeveelheid water toe aan elk van de dekglasmontagesteunen, de oppervlaktespanning van het water zal het dekglas op zijn plaats houden.
Tritureer nu voorzichtig de celsuspensie, of pipet hem op en neer, om eventuele celklonters los te maken. Gebruik een micropipet om ongeveer 10 µl van de suspensie te aspireren en laad vervolgens een van de invoerpoorten met het monster. De oplossing wordt door capillaire werking in de telkamer getrokken en moet het hele raster bedekken.
Terwijl de cellen bezinken, selecteer je het objectief. Laad vervolgens de hemocytometer op het draaischijf.
Bekijk vervolgens de cellen onder de microscoop. Als er minder dan 5 cellen in elk van de grote kwadranten zijn, moet je je monster mogelijk opnieuw centrifugeren en de pellet opnieuw suspenderen in een kleiner volume. Als de cellen elkaar overlappen of gewoon te dicht zijn om gemakkelijk van elkaar te onderscheiden, moet je je monster mogelijk verdunnen in een groter volume oplossing. Zorg ervoor dat je de factor bijhoudt waarmee je je cellen verdunt. Je hebt het later nodig voor een berekening.
Nu is het tijd om de cellen te tellen!
Zoals we eerder bespraken, is de telkamer bedekt met een met een laser geëtst raster. De lijnen van de kwadranten maken het gemakkelijker om de cellen die je telt bij te houden. Kies de grootte van het kwadrant voor het tellen afhankelijk van de dichtheid van de cellen in je monster. Als er bijvoorbeeld een laag aantal cellen is, tel je alle cellen in een van de hoekkwadranten. Voor monsters met een gemiddeld aantal cellen, kies je een van de 16 kleinere kwadranten. Als er een zeer hoge dichtheid van cellen is, tel je de cellen in een van de 25 centrale kwadranten. Ongeacht welk kwadrant je kiest of de dichtheid van het celmonster, tel je minimaal 20-50 cellen per kwadrant.
Niet alle cellen vallen netjes binnen de kwadranten. Je kunt de cellen tellen die de bovenste en linkerlijnen raken, maar negeer degenen die de onderste of rechterlijnen raken. Om de meest nauwkeurige telling te krijgen, gebruik je een celteller om de cellen bij te houden en neem je het gemiddelde van het aantal cellen in 4 kwadranten van dezelfde grootte.
Om het aantal cellen in een volume van 1 ml te berekenen, vermenigvuldig je het aantal getelde cellen met 10.000, omdat, zoals we eerder vermelden, elk groot vierkant op het raster 1/10.000e van een ml is. Als je een van deze grotere kwadranten hebt geteld, vermenigvuldig je dit aantal met 1. Als je een van de kleinere vierkanten in een van de hoekkwadranten hebt geteld, vermenigvuldig je dit aantal met 16. Als je alle cellen in een van de 25 centrale kwadranten hebt geteld, vermenigvuldig je dit aantal met 25. Als je je celsuspensie hebt verdund voordat je de hemacyometer hebt geladen, moet je ook vermenigvuldigen met de verdunningsfactor.
Vervolgens, om het aantal cellen in 1 ml van dit monster te berekenen, zouden we de 20 cellen in dit centrale kwadrant vermenigvuldigen met 104 en 25 om een totaal van 5 x 106 cellen in 1 ml van het monster te krijgen.
Nu we het totale aantal cellen in 1 ml van het monster weten, moeten we dit aantal vermenigvuldigen met het totale volume van onze oplossing. Dus bijvoorbeeld, als we 5 x 106 cellen in 1 ml hebben, dan zullen we in 2 ml een totaal van 1 x 107 cellen hebben.
Vervolgens, om fouten door verkeerde telling, ongelijkmatige verdeling van cellen of pipetteringsfouten te voorkomen, laad je de andere kant van de kamer en tel je je celmonster een tweede keer.
Het tellen van de cellen onder de microscoop is ook een goed moment om de levensvatbaarheid van de cellen in je monster te evalueren. Trypanblauw, een vitale kleurstof, wordt vaak met het monster gemengd voordat het in de hemocytometer wordt geladen voor dit doel.
Levende cellen sluiten deze kleurstof uit, omdat levende cellen zeer selectief zijn over wat ze door hun membranen laten gaan. Een dode cel heeft echter geen intact membraan, waardoor de trypanblauw kan passeren en het cytoplasma kan kleuren.
Om de levensvatbaarheid van je celmonster te controleren, verdun je een aliquot van je celsuspensie in trypanblauw en laad je vervolgens het met trypanblauw gekleurde monster net als het
Veel biomedische experimenten vereisen manipulatie van een bekende hoeveelheid cellen, om nauwkeurige, reproduceerbare en statistisch relevante gegeve…
Celtelling is een belangrijke stap in veel cel-gebaseerde assays om het aantal cellen en levensvatbaarheid te bepalen. Over het algemeen is het doel van het tellen om te begrijpen hoeveel een monster van een onbekende celconcentratie moet worden verdund voor verder gebruik. Het meest gebruikte laboratoriuminstrument voor het tellen van cellen is de hemocytometer.
De hemocytometer is een tellinstrument dat oorspronkelijk werd gemaakt voor het tellen van bloedcellen. In het midden van de hemocytometer bevinden zich twee telkamers, waarop een met een laser geëtst raster kan worden gevonden.
Het raster bestaat uit 9 grote kwadranten. De vier hoekkwadranten zijn verder verdeeld in 16 kleinere kwadranten. Het centrale kwadrant is verdeeld in 25 van deze kleinere kwadranten, die elk verder zijn verdeeld in 16 micro-kwadranten.
Aan het uiteinde van elke kamer bevinden zich monsterinvoerpoorten, waarin het te tellen celmonster wordt gespoten.
Aan weerszijden van de telkamers bevinden zich de dekglasmontagesteunen, waarop het kwartsdekglas rust, meestal ongeveer 0,1 mm boven de telkamer.
Aangezien het oppervlak van elk groot vierkant 1 mm2 is, is het volume dat door elk groot vierkant wordt ingesloten 0,1 mm3 of 1/10.000e van een ml.
Voor het tellen, neem altijd even de tijd om ethanol en een kimdoek te gebruiken om eventuele pluisjes, vingerafdrukken of watermerken van het dekglas en de telkamer schoon te maken en te drogen.
Voeg vervolgens voorzichtig een kleine hoeveelheid water toe aan elk van de dekglasmontagesteunen, de oppervlaktespanning van het water zal het dekglas op zijn plaats houden.
Tritureer nu voorzichtig de celsuspensie, of pipet hem op en neer, om eventuele celklonters los te maken. Gebruik een micropipet om ongeveer 10 µl van de suspensie te aspireren en laad vervolgens een van de invoerpoorten met het monster. De oplossing wordt door capillaire werking in de telkamer getrokken en moet het hele raster bedekken.
Terwijl de cellen bezinken, selecteer je het objectief. Laad vervolgens de hemocytometer op het draaischijf.
Bekijk vervolgens de cellen onder de microscoop. Als er minder dan 5 cellen in elk van de grote kwadranten zijn, moet je je monster mogelijk opnieuw centrifugeren en de pellet opnieuw suspenderen in een kleiner volume. Als de cellen elkaar overlappen of gewoon te dicht zijn om gemakkelijk van elkaar te onderscheiden, moet je je monster mogelijk verdunnen in een groter volume oplossing. Zorg ervoor dat je de factor bijhoudt waarmee je je cellen verdunt. Je hebt het later nodig voor een berekening.
Nu is het tijd om de cellen te tellen!
Zoals we eerder bespraken, is de telkamer bedekt met een met een laser geëtst raster. De lijnen van de kwadranten maken het gemakkelijker om de cellen die je telt bij te houden. Kies de grootte van het kwadrant voor het tellen afhankelijk van de dichtheid van de cellen in je monster. Als er bijvoorbeeld een laag aantal cellen is, tel je alle cellen in een van de hoekkwadranten. Voor monsters met een gemiddeld aantal cellen, kies je een van de 16 kleinere kwadranten. Als er een zeer hoge dichtheid van cellen is, tel je de cellen in een van de 25 centrale kwadranten. Ongeacht welk kwadrant je kiest of de dichtheid van het celmonster, tel je minimaal 20-50 cellen per kwadrant.
Niet alle cellen vallen netjes binnen de kwadranten. Je kunt de cellen tellen die de bovenste en linkerlijnen raken, maar negeer degenen die de onderste of rechterlijnen raken. Om de meest nauwkeurige telling te krijgen, gebruik je een celteller om de cellen bij te houden en neem je het gemiddelde van het aantal cellen in 4 kwadranten van dezelfde grootte.
Om het aantal cellen in een volume van 1 ml te berekenen, vermenigvuldig je het aantal getelde cellen met 10.000, omdat, zoals we eerder vermelden, elk groot vierkant op het raster 1/10.000e van een ml is. Als je een van deze grotere kwadranten hebt geteld, vermenigvuldig je dit aantal met 1. Als je een van de kleinere vierkanten in een van de hoekkwadranten hebt geteld, vermenigvuldig je dit aantal met 16. Als je alle cellen in een van de 25 centrale kwadranten hebt geteld, vermenigvuldig je dit aantal met 25. Als je je celsuspensie hebt verdund voordat je de hemacyometer hebt geladen, moet je ook vermenigvuldigen met de verdunningsfactor.
Vervolgens, om het aantal cellen in 1 ml van dit monster te berekenen, zouden we de 20 cellen in dit centrale kwadrant vermenigvuldigen met 104 en 25 om een totaal van 5 x 106 cellen in 1 ml van het monster te krijgen.
Nu we het totale aantal cellen in 1 ml van het monster weten, moeten we dit aantal vermenigvuldigen met het totale volume van onze oplossing. Dus bijvoorbeeld, als we 5 x 106 cellen in 1 ml hebben, dan zullen we in 2 ml een totaal van 1 x 107 cellen hebben.
Vervolgens, om fouten door verkeerde telling, ongelijkmatige verdeling van cellen of pipetteringsfouten te voorkomen, laad je de andere kant van de kamer en tel je je celmonster een tweede keer.
Het tellen van de cellen onder de microscoop is ook een goed moment om de levensvatbaarheid van de cellen in je monster te evalueren. Trypanblauw, een vitale kleurstof, wordt vaak met het monster gemengd voordat het in de hemocytometer wordt geladen voor dit doel.
Levende cellen sluiten deze kleurstof uit, omdat levende cellen zeer selectief zijn over wat ze door hun membranen laten gaan. Een dode cel heeft echter geen intact membraan, waardoor de trypanblauw kan passeren en het cytoplasma kan kleuren.
Om de levensvatbaarheid van je celmonster te controleren, verdun je een aliquot van je celsuspensie in trypanblauw en laad je vervolgens het met trypanblauw gekleurde monster net als het
Celtelling is een belangrijke stap in veel cel-gebaseerde assays om het aantal cellen en levensvatbaarheid te bepalen. Over het algemeen is het doel van het tellen om te begrijpen hoeveel een monster van een onbekende celconcentratie moet worden verdund voor verder gebruik. Het meest gebruikte laboratoriuminstrument voor het tellen van cellen is de hemocytometer.
De hemocytometer is een tellinstrument dat oorspronkelijk werd gemaakt voor het tellen van bloedcellen. In het midden van de hemocytometer bevinden zich twee telkamers, waarop een met een laser geëtst raster kan worden gevonden.
Het raster bestaat uit 9 grote kwadranten. De vier hoekkwadranten zijn verder verdeeld in 16 kleinere kwadranten. Het centrale kwadrant is verdeeld in 25 van deze kleinere kwadranten, die elk verder zijn verdeeld in 16 micro-kwadranten.
Aan het uiteinde van elke kamer bevinden zich monsterinvoerpoorten, waarin het te tellen celmonster wordt gespoten.
Aan weerszijden van de telkamers bevinden zich de dekglasmontagesteunen, waarop het kwartsdekglas rust, meestal ongeveer 0,1 mm boven de telkamer.
Aangezien het oppervlak van elk groot vierkant 1 mm2 is, is het volume dat door elk groot vierkant wordt ingesloten 0,1 mm3 of 1/10.000e van een ml.
Voor het tellen, neem altijd even de tijd om ethanol en een kimdoek te gebruiken om eventuele pluisjes, vingerafdrukken of watermerken van het dekglas en de telkamer schoon te maken en te drogen.
Voeg vervolgens voorzichtig een kleine hoeveelheid water toe aan elk van de dekglasmontagesteunen, de oppervlaktespanning van het water zal het dekglas op zijn plaats houden.
Tritureer nu voorzichtig de celsuspensie, of pipet hem op en neer, om eventuele celklonters los te maken. Gebruik een micropipet om ongeveer 10 µl van de suspensie te aspireren en laad vervolgens een van de invoerpoorten met het monster. De oplossing wordt door capillaire werking in de telkamer getrokken en moet het hele raster bedekken.
Terwijl de cellen bezinken, selecteer je het objectief. Laad vervolgens de hemocytometer op het draaischijf.
Bekijk vervolgens de cellen onder de microscoop. Als er minder dan 5 cellen in elk van de grote kwadranten zijn, moet je je monster mogelijk opnieuw centrifugeren en de pellet opnieuw suspenderen in een kleiner volume. Als de cellen elkaar overlappen of gewoon te dicht zijn om gemakkelijk van elkaar te onderscheiden, moet je je monster mogelijk verdunnen in een groter volume oplossing. Zorg ervoor dat je de factor bijhoudt waarmee je je cellen verdunt. Je hebt het later nodig voor een berekening.
Nu is het tijd om de cellen te tellen!
Zoals we eerder bespraken, is de telkamer bedekt met een met een laser geëtst raster. De lijnen van de kwadranten maken het gemakkelijker om de cellen die je telt bij te houden. Kies de grootte van het kwadrant voor het tellen afhankelijk van de dichtheid van de cellen in je monster. Als er bijvoorbeeld een laag aantal cellen is, tel je alle cellen in een van de hoekkwadranten. Voor monsters met een gemiddeld aantal cellen, kies je een van de 16 kleinere kwadranten. Als er een zeer hoge dichtheid van cellen is, tel je de cellen in een van de 25 centrale kwadranten. Ongeacht welk kwadrant je kiest of de dichtheid van het celmonster, tel je minimaal 20-50 cellen per kwadrant.
Niet alle cellen vallen netjes binnen de kwadranten. Je kunt de cellen tellen die de bovenste en linkerlijnen raken, maar negeer degenen die de onderste of rechterlijnen raken. Om de meest nauwkeurige telling te krijgen, gebruik je een celteller om de cellen bij te houden en neem je het gemiddelde van het aantal cellen in 4 kwadranten van dezelfde grootte.
Om het aantal cellen in een volume van 1 ml te berekenen, vermenigvuldig je het aantal getelde cellen met 10.000, omdat, zoals we eerder vermelden, elk groot vierkant op het raster 1/10.000e van een ml is. Als je een van deze grotere kwadranten hebt geteld, vermenigvuldig je dit aantal met 1. Als je een van de kleinere vierkanten in een van de hoekkwadranten hebt geteld, vermenigvuldig je dit aantal met 16. Als je alle cellen in een van de 25 centrale kwadranten hebt geteld, vermenigvuldig je dit aantal met 25. Als je je celsuspensie hebt verdund voordat je de hemacyometer hebt geladen, moet je ook vermenigvuldigen met de verdunningsfactor.
Vervolgens, om het aantal cellen in 1 ml van dit monster te berekenen, zouden we de 20 cellen in dit centrale kwadrant vermenigvuldigen met 104 en 25 om een totaal van 5 x 106 cellen in 1 ml van het monster te krijgen.
Nu we het totale aantal cellen in 1 ml van het monster weten, moeten we dit aantal vermenigvuldigen met het totale volume van onze oplossing. Dus bijvoorbeeld, als we 5 x 106 cellen in 1 ml hebben, dan zullen we in 2 ml een totaal van 1 x 107 cellen hebben.
Vervolgens, om fouten door verkeerde telling, ongelijkmatige verdeling van cellen of pipetteringsfouten te voorkomen, laad je de andere kant van de kamer en tel je je celmonster een tweede keer.
Het tellen van de cellen onder de microscoop is ook een goed moment om de levensvatbaarheid van de cellen in je monster te evalueren. Trypanblauw, een vitale kleurstof, wordt vaak met het monster gemengd voordat het in de hemocytometer wordt geladen voor dit doel.
Levende cellen sluiten deze kleurstof uit, omdat levende cellen zeer selectief zijn over wat ze door hun membranen laten gaan. Een dode cel heeft echter geen intact membraan, waardoor de trypanblauw kan passeren en het cytoplasma kan kleuren.
Om de levensvatbaarheid van je celmonster te controleren, verdun je een aliquot van je celsuspensie in trypanblauw en laad je vervolgens het met trypanblauw gekleurde monster net als het
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is a hemacytometer and why is it used for cell counting?
A hemacytometer is a counting chamber with a laser-etched grid originally designed for counting blood cells. It contains two counting chambers with grids divided into quadrants of varying sizes. The tool allows researchers to count cells under a light microscope and calculate total cell concentration, making it essential for determining cell numbers in biomedical experiments requiring known cell quantities.
Q2: How is the hemacytometer grid structured for cell counting?
The hemacytometer grid consists of 9 major quadrants. The four corner quadrants are subdivided into 16 smaller quadrants each, while the central quadrant contains 25 smaller quadrants, each further divided into 16 micro-quadrants. Each large square has an area of 1 mm² and contains a volume of 0.1 mm³, or 1/10,000th of a milliliter, which is critical for calculating total cell concentration.
Q3: What preparation steps are necessary before loading cells into a hemacytometer?
Clean the coverslip and counting chamber with ethanol and a kimwipe to remove lint, fingerprints, and watermarks. Apply water to the coverslip mounting supports to hold the coverslip in place using surface tension. Gently triturate the cell suspension by pipetting up and down to dislodge cell clumps, then aspirate approximately 10 microliters and load it into an introduction port where capillary action draws the solution across the grid.
Q4: How do you choose which quadrant to count based on cell density?
Select quadrant size according to cell density: for low cell numbers, count all cells in one corner quadrant; for medium density, use one of the 16 smaller quadrants; for high density, count cells in one of the 25 central quadrants. Always count at least 20-50 cells per quadrant to ensure accuracy. Count cells touching the top and left lines but disregard those touching bottom or right lines.
Q5: How do you calculate the total number of cells in your sample?
Multiply the cell count by 10,000 (since each large square equals 1/10,000th of a milliliter). Apply a multiplication factor based on quadrant size: multiply by 1 for large quadrants, by 16 for corner quadrants, or by 25 for central quadrants. If you diluted the sample, multiply by the dilution factor. Finally, multiply by total sample volume to determine total cell number in your experimental sample.
Q6: What is trypan blue exclusion and how does it determine cell viability?
Trypan blue is a vital stain that distinguishes live from dead cells. Live cells have intact membranes and exclude the dye, appearing bright and golden under phase contrast microscopy. Dead cells lack membrane integrity, allowing trypan blue to enter and stain the cytoplasm blue. Count only live cells and multiply the final count by the trypan blue dilution factor to determine viable cell concentration in your sample.
Q7: Why is accurate cell counting important in biomedical experiments?
Accurate cell counting ensures reproducible, statistically-relevant data in cell-based assays. Researchers need precise cell numbers when isolating cells from tissue, mixing different cell populations in co-culture experiments, performing immunoassays like ELISPOT, or extracting mRNA from cells. Knowing exact cell quantities allows proper dilution and standardization of experimental conditions across replicates and supports passaging cells cell lines subculturing methods and applications.
Chapters in this video
0:00
Overview
0:32
Basic Hemacytometer Components
1:49
Basic Operation of the Hemacytometer
3:26
How to Count Cells
6:21
Determining Cell Viability
7:57
Applications
9:53
Summary
Videos from this collection: