Een Kwantitatieve Analyse naar Protein Studie: DNA interacties, Discover transcriptieregulatoren van genexpressie, en het identificeren van nieuwe anti-tumor Agents

Het algemene doel van deze procedure is om een kwantitatief DNA-bindend assay te demonstreren, wat nuttig is bij het onderzoeken van eiwit-DNA-interacties, het ontdekken van transcriptionele regulatoren van genexpressie en het identificeren van nieuwe antitumormiddelen. Dit wordt bereikt door eerst een streptavidine-gecoate assayplaat te bereiden met een geschikte BIOTINYLEERDE DNA-doel. De tweede stap is om nucleaire extracteiwitten met of zonder potentiële remmers toe te voegen en ze te laten binden aan het DNA-doel.

Vervolgens worden de gebonden transcriptiefactoren gedetecteerd met primaire antilichamen en met paardenradijsperoxidase gekoppelde secundaire antilichamen. De laatste stap is om een paardenradijsperoxidase-substraat aan de putjes toe te voegen om kleurontwikkeling te veroorzaken. Uiteindelijk wordt de kleurontwikkeling gemeten met de spectrofotometer.

Na verloop van tijd geeft de hoeveelheid kleurverandering aan de mate van DNA-binding en het effect van potentiële remmers van DNA-binding. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere technieken, zoals elektroforetische mobiliteitsverschuivingsassay, is dat het een kwantitatief DNA-remmerbindend assay is. Om te beginnen, bereid een voldoende aantal celculturen voor, bestaande uit minimaal driemaal 10 tot de zevende cel voor elke geteste conditie.

Hier worden humane beenmerg-endotheelcellen gebruikt, die het run X twee-eiwit tot expressie brengen. Zodra de cellen 80% confluent zijn. Behandel de cellen met 0,2 microgram per milliliter, geen conazol om celgroei op de G twee M-celcyclusgrens te stoppen.

Dit stabiliseert het run X twee-eiwit en produceert maximale DNA-binding na 16 uur. Lyseer de cellen en isoleer het eiwit zoals aangegeven in het bijbehorende tekstprotocol. Zodra het eiwit is geïsoleerd, meet u de eiwitconcentratie met behulp van een standaard BCA-assay.

Bewaar vervolgens de monsters bij min 80 graden Celsius in 10 microliter aliquots met concentraties tussen twee en vijf milligram per milliliter. Fixeer een 96-wellsplaat met een 0,1 molaire oplossing van natriumcarbonaat door 300 microliter van het mengsel per. Well te prepareren. Bereid genoeg wells voor zodat elk monster driemaal wordt uitgevoerd.

Incubeer de plaat twee uur op een schuddende platform bij kamertemperatuur. Was vervolgens de plaat drie keer met 300 microliter streptavid en wasbuffer en incubeer met 100 microliter biotin-gelabelde dubbelstrengse oligonucleotiden bij 1,25 nanomol per well gedurende twee uur terwijl geroerd wordt. Was vervolgens de platen nog drie keer met de strep din wasbuffer.

Voeg vervolgens 100 microliter per well van de mastermix toe, die een XDNA-bindende buffer bevat, DNA-bindende eiwitten bij drie tot negen microgram per well en poly DIGC bij één microgram per well. Voeg vervolgens de mastermix toe die een potentiële remmer bevat, zoals vitamine D drie of de geschikte verdunning van de oplosmiddelcontrole, zoals ethanol, toe aan hun respectievelijke wells. Bedek de plaat en plaats deze op een schuddende platform bij vier graden Celsius overnacht na incubatie met de nucleaire extracten.

Was de plaat drie keer met de streptavid en wasbuffer. Voeg vervolgens 90 microliter per well van een run X twee-specifiek monoklonaal antilichaam toe, verdund tot 0,2 nanogram per microliter, en streptavid en wasbuffer. Bedek de plaat en incubeer deze een uur op kamertemperatuur op een schuddende platform.

Spoel vervolgens de wells opnieuw met streptavid en wasbuffer en voeg 90 microliter per well van de secundaire antilichaammix toe, die vijf nanogram per microliter FAB-specifiek affiniteit-gezuiverde HRP-geconjugeerde antilichaam bevat, verdund in de strep. AVID en wasbuffer. Incubeer het secundaire antilichaam gedurende 30 minuten op kamertemperatuur op een schuddende platform.

Was vervolgens zes keer met 300 microliter per well van Strp en wasbuffer. Ontwikkel vervolgens de resultaten door 50 microliter van een tetraethyl benadin-substraat toe te voegen aan elke well rechtstreeks vanuit de voorraadfles voor continue bewaking van de monsters. Plaats de monsters in de spectrofotometer en meet de absorptie bij 635 nanometer continu.

Voor een eenmalige meting, incubeer de monsters gedurende 10 tot 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Gedurende deze tijd zouden de wells moeten veranderen van helder tot verschillende graden van blauw. Stop de reactie door 50 microliter zwavelzuur aan elk toe te voegen.

Meet vervolgens de absorptie van elke well bij 450 nanometer met behulp van een 96-wells plate reader. De hier getoonde grafiek is een voorbeeld van continue bewaking van het effect van biologisch actief vitamine D drie op run X 2D NA-binding. De geteste concentraties hadden weinig effect op run X 2D NA-binding.

Hoewel andere vitamine D drie-verbindingen dramatische effecten hebben getoond. De hier geteste verbinding 5 2 2 1 9 7 5 werd geïdentificeerd met behulp van computerondersteunde geneesmiddelontwikkeling. Bij het testen vertoonde de verbinding een dosisafhankelijke remming van rux twee-binding van één nanomolair tot 100 micromolair. 50% van de renx 2D NA-binding kon worden geremd met slechts 0,01 micromolair van de verbinding.

Na het bekijken van deze video, zou u een goed idee moeten hebben over hoe u de DNA-bindende assay uitvoert en potentiële remmers van DNA-binding test.