Name: Een Kwantitatieve Analyse naar Protein Studie: DNA interacties, Discover transcriptieregulatoren van genexpressie, en het identificeren van nieuwe anti-tumor Agents (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-31T07:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Leer een kwantitatieve DNA-bindingsassay voor het bestuderen van eiwit-DNA-interacties met streptavidine-platen en biotinylatie. Deze methode helpt transcriptieregulatoren te identificeren en nieuwe anti-tumoragenten te ontdekken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De technische bijstand en instrumentatie van de Universiteit van Maryland Greenebaum Cancer Center Translationeel Core Facility, vooral Drs. Rena Lapidus en Mariola Sadowska, worden bedankt. Het werk verantwoordelijk voor de ontwikkeling van deze test werd deels gefinancierd door NIH RO1CA108846, AHA Grant-in-Aid GRNT2130014, een VA Merit Award uit aan AP, en door de Universiteit van Maryland Cigarette Restitutie Funds (CRF) verstrekt aan de Marlene &amp; Stewart Greenebaum Cancer Center.

Verschillende stappen vooruit zijn uitgevoerd tijd en verschillende reagentia bereid en opgeslagen om de procedure: (1) celkweek en eiwitisolatie, (2) bereiden van oligonucleotide (3) bereiding van 96-well platen (4) kernextract incubatie overnacht. Procedure vereist 2 dagen vanwege de overnacht incubatie van nucleair eiwit met DNA-oligonucleotiden. 1. Bereiding van Buffers 1.1 Kern eiwitisolatie <ol><li> Hypotonische buffer: Aan 100 ml hypotone buffer bereiden 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 150 gl (1 M MgCl2), 333 gl (3 M KCl) 98,3 ml H2O Eindconcentratie: 10 mM HEPES, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl. Voor hypotonische buffer + NP40 (voor gebruik in stap 2.11) Voeg 0,5 ml (10% NP40) 9,5 ml hypotone buffer definitieve 0,5% NP40. </li><li> Low Salt Buffer: Aan 100 ml buffer met laag zoutgehalte (voor gebruik in stap 2.15) te bereiden 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 25 ml glycerol, 150 gl (1 M MgCl2), 666 gl (3 M KCl), 40 gl (0,5 M EDTA) aan 73 ml H2O Eindconcentratie: 10 mM HEPES, 25% glycerol, 1,5 mM MgCl2, 20 mM KCl, 0,2 mM EDTA. </li><li> High Salt Buffer: Aan 100 ml buffer met hoog zoutgehalte (voor gebruik in stap 2.15) te bereiden 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 25 ml glycerol, 150 ul (1 M MgCl2), 26.7 ml (3 M KCl), 40 pl (0,5 M EDTA) aan 47 ml H2O Eindconcentratie: 10 mM HEPES, 25% glycerol, 1,5 mM MgCl2, 800 mM KCl, 0,2 mM EDTA. </li><li> 10% NP40 Wasmiddel: 10 ml NP40 90 ml H2O </li><li> Protease en fosfatase remmers [toegevoegd hypotone buffer + NP40 (stap 2.11), lage zout buffer (stap 2.15), en hoge zout buffer (stap 2.15) juist voor gebruik] Voeg 2,5 gl (1M DTT) en 50 ui proteaseremmers (100x) tot 5 ml van elke buffer voor uiteindelijke concentratie van 0,5 mM DTT en 1 x proteaseremmers. De proteaseremmer 100x voorraad mengsel bestaat uit:natriumfluoride (Ser / Thr, zure fosfatasen), natriumorthovanadaat (Tyr, alkalische fosfatasen), β-glycerofosfaat (Ser / Thr fosfatasen), natriumpyrofosfaat (Ser / Thr fosfatasen), aprotinine (Ser proteasen), Bestatin (amino-peptidasen ), E64 (cysteïne proteasen), leupeptine (Ser / Cys proteasen), EDTA (metalloproteasen). </li></ol> 1.2 Bereiding van assayplaten <ol><li> Plaat fixeeroplossing: Ter voorbereiding 500 ml oplossing, voeg 5,25 g natriumcarbonaat 500 ml H2O, meng en pH 9,7 voor een uiteindelijke concentratie van 0,1 M natriumcarbonaat. </li><li> Plaat blokkerende oplossing: Om de balans op poly bereiden dI / DC oligonucleotide, resuspendeer 1 Unit (~ 50 mg) van poly dI / DC in 1 ml 10 mM Tris / HCl, pH 7,9 met 1 mM EDTA voor een voorraad concentratie van 50 ug / pl. Stock is verdund tot 1 ug / ul voor gebruik. </li></ol> 1.3 wasbuffers en antilichaam verdunningen OPMERKING: Streptavidin wash buffer<html> gebruikt om borden te wassen in tussen de toevoegingen en de primaire en secundaire antilichamen verdunnen. <ol><li> Om 1 liter Streptavidin wasbuffer bereiden, voeg 2,4 g Tris / HCI, 37,5 ml (4 M NaCl), 10 ml (10% BSA), 5 ml (10% Tween-20), tot 1 L Millipore-steriel gefiltreerd water , pH 7.18. Bewaren bij 4 ° C. Eindconcentratie: 20 mM Tris / HCl, 150 mM NaCl, 0,1% BSA, 0,05% Tween-20. </li></ol> 1.4 DNA bindingsbuffer Opmerking: Deze buffer wordt bewaard bij -20 ° C. <ol><li> Ter voorbereiding 15 ml DNA bindingsbuffer, voeg 180 ul (1 M HEPES, pH 7,9), 300 gl (3 M KCl), 12 gl (0,5 M EDTA, pH 8,0), 7,5 gl (1M DTT), 3,0 ml (60% glycerol), 300 pi (50 pg / ul poly dI / dC) verdund met gedeïoniseerd / gedestilleerd H2O (12 ml). Eindconcentratie: 12 mM HEPES / pH 7,9, 60 mM KCl, 0,4 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 12% glycerol, 1 ug / ul poly dI / dC. </li></ol> 2. Cel Cultuur en Nucleaire eiwitisolatie t &quot;&gt; NB: De bereiding vereist ongeveer 3 uur Stimulatie van cellen zal afhangen experiment Het aantal cellen voor elk experiment zal variëren en alle volumes weerspiegelen een typisch experiment met 3 x 10 7 cellen / bijzondere volumes aanpassen om tegemoet... het aantal cellen daadwerkelijk bij de proef 6. <ol><li> Nucleaire eiwit te bereiden voor DNA-binding assays, cultuur menselijke cellen dat RUNX2 (endotheel, osteosarcoom, borstkankercellen) uitdrukken in passende media 6. </li><li> Behandel subconfluente cellen met nocodazol (0,2 ug / ml gedurende 16 uur) cellen arresteren de G2 / M celcyclus grens 6. Onder deze omstandigheden wordt de RUNX2 eiwit gestabiliseerd en maximaal DNA binding wordt bereikt. Zo hebben kerneiwit beschikbaar voor meerdere assays en remmers worden vergeleken van dezelfde bereiding. </li><li> Bij elke stap vooraf koelen centrifuge tot 4 ° C en buffers bereiden en koelen 20 min bij 4 ° C vóór celoogst.</li><li> Chill-cellen (4 ° C) en gedrag procedures op ijs. </li><li> Centrifugeer cellen bij 1000 rpm gedurende 5 min in een 15 ml polypropyleen buis met ronde bodem. </li><li> Wassen 1x met ijskoude PBS (Ca 2 + en Mg 2 + gratis). </li><li> Centrifuge opnieuw en PBS bovenstaande vloeistof. </li><li> Voeg 500 ul van hypotone buffer zonder proteaseremmers, let daarbij goed op een volledige resuspensie van de cel pellet. </li><li> Transfer inhoud naar een 1,5 ml Eppendorf buis. </li><li> Onmiddellijk centrifuge bij 5.500 rpm voor 5,5 min; Verwijder de bovenstaande vloeistof en de cel pellet HOUDEN. </li><li> Resuspendeer de celpellet in 500 ui hypotonische buffer die 0,5% NP40. Voeg protease en fosfatase remmers en 0,5 mM DTT (zoals beschreven in stap 1.1.5). </li><li> Laat het monster rusten op ijs gedurende 30 minuten. </li><li> Centrifugeer bij 13.000 rpm gedurende 10 minuten. </li><li> Verwijder het supernatant (bevat de cytosolische eiwitten). </li><li> Resuspendeer de nucleaire pellet in 60 ul elk van laag salt buffer (waaraan proteaseremmers en 0,5 mM DTT toegevoegd uit stap 1.1.5) en hoge zout buffer (waaraan proteaseremmers en 0,5 mM DTT toegevoegd uit stap 1.1.5) voor een totaal van 120 pi. Voeg 60 ul buffer met laag zoutgehalte aan de eerste en resuspendeer pellet, voeg 60 pl buffer met hoog zoutgehalte. Vortex de pellet om te helpen bij resuspensie. </li></ol> OPMERKING: Deze stap helpt zich te ontdoen van een aantal van de membraaneiwitten nucleaire en is opgericht voor de lysisstap: zoutarm eerste (resuspendeer pellet, vortex), dan is een hoog zoutgehalte (vortex) optimaliseert deze stap. Houd extract op ijs gedurende 30 minuten, met vortexen na de eerste 10 minuten. <ol start="16"><li> Centrifugeer bij 12.000 rpm gedurende 15 min., houden de supernatant dat het kerneiwit. </li><li> Meet eiwitconcentratie (proberen monsters 2-5 mg / ml te houden), aliquot in geschikte hoeveelheden (10 pl / buis) en bewaar bij -80 ° C. </li></ol> OPMERKING: Geschatte opbrengst: 30 x 10 6 cells wordt 5 ug / ul eiwit op in 120 pl. 5 x 10 6 cellen 2,2 ug / ul eiwit op in 40 pl. 3. Voorbereiding van Double oligonucleotide <ol><li> Ontwerp van complementaire oligonucleotiden met compatibele halve plaatsen aan de uiteinden. Voor RUNX2 deze zijn: 5&#39;-CGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATAC TCG-3&#39;-biotine (sense) en 5&#39;CGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT T GTGGTT AATACG-3&#39;-biotine (antisense). </li></ol> OPMERKING: Pilot experimenten vastgesteld dat drie RUNX2 bindingsplaatsen en single-end label biotine leverde de meest reproduceerbare resultaten. <ol start="2"><li> Bereid 5x annealing buffer: Voeg 300 ul (1 M Tris-HCl, pH 7,6), 30 pl (1 M MgCl2), 10 gl (1M DTT) aan 260 ui H2O (def 600 pi). </li><li> 200 pmol van elk enkelstrengs oligonucleotide (3 ui), voeg 12 pl 5x hybridisatie buffer en 45 ui H2O in totaal 60 pl (200 pmol/60 ui). </li><li> Verhit bij 95 ° C gedurende 5-10 minuten in een verwarmingsblok. </li><li> Koel af tot 65 ° C langzaam (door het instellen van de temperatuur tot 65 ° C, het duurt 15 min), daarna afkoelen tot kamertemperatuur langzaam door de stroom van de verwarming blok (of door het plaatsen in 50 ml van de 65 ° C water af in een bekerglas op het ijs, dit duurt 15-20 minuten). </li></ol> 4. Bereiding van 96-well platen OPMERKING: melkeiwitten niet in de wasbuffers. <ol><li> Fix plaat met bevestigings-oplossing (0,1 M natriumcarbonaat): voeg 300 ul / putje. </li><li> Incubeer 2 uur bij schommelen bij kamertemperatuur (RT), of geen schommelen bij 4 ° C (O / N). </li><li> Was plaat 3x met streptavidine wasbuffer (WB): voeg 300 ul / putje elke keer. </li><li> Add-biotine-gelabelde dubbelstrengs oligonucleotide (3 consensus bindingsplaatsen per nucleotide) gedurende 2 uur wet schommelen (1,25 nmol / goed; 100 ul / putje). </li><li> Wassen 3x met koud WB: voeg 300 ul / putje en dan onmiddellijk keren de plaat in een gootsteen en dep de randen op een papieren handdoek na elke toevoeging. </li></ol> OPMERKING: Gebruik geen pipet tips om vocht uit de platen te verwijderen, omdat dit avidine kan schrapen: biotine: DNA-complexen uit de putjes. Doe dit voor alle volgende wasbeurt stappen. 5. Incubatie met kernextract OPMERKING: Gebruik geen vervanging zalm of haring sperma DNA voor de poly dI / DC blokkerende buffer. Vermijd het blokkeren van platen met melkeiwitten. Beide blokkerende middelen resulteren in hoge achtergrondwaarden. <ol><li> Incubeer met specifieke transcriptiefactor bereid uit kernextract (90 ul / putje). Bereid een master mix die kernmateriaal extract (DNA-bindend eiwit; 3-9 ug / putje) + poly dI / DC (1 ug / ul van een 50 ug / ul voorraad) in 1x DNA-binding buffer. Volume als nodig is voor het totale aantalputten vereist (90 ul / putje). </li><li> Alle potentiële remmer, zoals vitamine D3 (Figuur 2) of CADD verbinding 5.221.975 (fig. 3) of de benodigde verdunning van de oplosmiddelcontrole, zoals ethanol, wordt toegevoegd in deze stap. </li><li> Plaats plaat op schudplatform, O / N bij 4 ° C. </li><li> Wassen 3x met WB: voeg 300 ul / putje </li></ol> 6. Toevoeging van primair antilichaam OPMERKING: Primaire antilichaam verdunningen moet vers worden bereid - opslag wordt niet aanbevolen. <ol><li> Verdunnen RUNX2-specifieke monoklonale antilichaam (voorraad 1 ug / ul) 1/5, 000 in Streptavidin wassen buffer. Bereid voldoende voor toevoeging aan elk putje van de plaat met 96 putjes (90 ul / putje) in drievoud. </li><li> Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een schudplatform. </li><li> Wassen 3x met WB, voeg 300 ul / putje. </li></ol> 7. Toevoeging van secundair antilichaam OPMERKING: Secundair antilichaam verdunningen kunnen sto zijnrood bij 4 ° C overnacht eventueel de volgende dag. <ol><li> Verdun F ab-specifieke affiniteitsgezuiverd-HRP geconjugeerd antilichaam (7,1 mg / ml voorraad) om 1:1,400 in Streptavidin wassen buffer: 3,5 pl antibody/5.0 ml wasbuffer. Bereid voldoende voor toevoeging aan elk putje van de plaat met 96 putjes (90 ul / putje) in drievoud. </li><li> Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een schudplatform. </li><li> Wash 6x met WB door het omkeren plaat in gootsteen (300 ul / putje). </li></ol> 8. HRP substraat en Product Development <ol><li> Voeg 50 ul van TMB substraat per putje direct uit voorraad fles. </li><li> Incubeer 10-20 minuten bij kamertemperatuur in het donker (halte reactie methode) of direct te meten extinctie (continue kinetische monitoring). </li></ol> 9. Reactie Meting <ol><li> Stop reactie methode: Voor visuele stop reactie, controleren op kleurverandering van helder naar blauw en stoppen reactie met 50 pi zwavelzuur. </li><li> Meet absorptie bij 450 nm metde Biotrak II Visible plaataflezer spectrofotometer (Amersham Biosciences, GE Healthcare Biosciences Corp Piscataway NJ, USA) of een vergelijkbaar instrument. </li><li> Continue kinetische wijze van monitoring: substraat Voeg na de laatste wasbeurt en net voorafgaand aan het plaatsen in de spectrofotometer (niet de reactie te stoppen). </li><li> Meet de absorptie bij 635 nm met de Bio-Tek Synergy HT Multi-reactie microplaatlezer spectrofotometer (Bio-Tek Instruments, Inc; Winooski, VT, USA) of een vergelijkbaar instrument. </li></ol>

<ol><li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+mobility+shift+assay+%28EMSA%29+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat. Protoc. 2, 1849-1861 (2007).</li>
<li>Bhattacharya, N., Sarno, A., Idler, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+detection+of+nuclear+factor-kappaB+activity+using+a+sensitive+oligo-based+chemiluminescent+enzyme-linked+immunosorbent+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">High-throughput detection of nuclear factor-kappaB activity using a sensitive oligo-based chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay.</a> Int. J. Cancer. 127, 404-411 (2010).</li>
<li>Hartzell, D. D., Trinklein, N. D., Mendez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+analysis+of+the+CREB+signaling+pathway+using+HaloCHIP-chip+and+high+throughput+reporter+assays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A functional analysis of the CREB signaling pathway using HaloCHIP-chip and high throughput reporter assays.</a> BMC Genomics. 10, 497(2009).</li>
<li>Vuori, K. A., Ahlskog, J. K., Sistonen, L., Nikinmaa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TransLISA%2C+a+novel+quantitative%2C+nonradioactive+assay+for+transcription+factor+DNA-binding+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">TransLISA, a novel quantitative, nonradioactive assay for transcription factor DNA-binding analyses.</a> FEBS J. 276, 7366-7374 (2009).</li>
<li>D'Souza, D. R., Salib, M. M., Bennett, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycemia+Regulates+RUNX2+Activation+and+Cellular+Wound+Healing+through+the+Aldose+Reductase+Polyol+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Hyperglycemia Regulates RUNX2 Activation and Cellular Wound Healing through the Aldose Reductase Polyol Pathway.</a> J. Biol. Chem. 284, 17947-17955 (2009).</li>
<li>Underwood, K. F., D'Souza, D. R., Mochin, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+RUNX2+transcription+factor-DNA+interactions+and+cell+proliferation+by+Vitamin+D3+%28cholecalciferol%29+prohormone+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of RUNX2 transcription factor-DNA interactions and cell proliferation by Vitamin D3 (cholecalciferol) prohormone activity.</a> J. Bone Miner Res. 27, 913-925 (2012).</li>
<li>Held, P. Kinetic analysis of ß-galactosidase activity using the PowerWave HT and Gen5 data analysis software: basic enzyme kinetic determinations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeld%2C+P+%22Biotek+Instruments+Application+Note%22">Biotek Instruments Application Note</a>. , Biotek. 
	Available from: 
 
 <a target="_blank" href="http://www.biotek.com/resources/docs/B-Gal_Michaelis-Menten_App_Note.pdf">http://www.biotek.com/resources/docs/B-Gal_Michaelis-Menten_App_Note.pdf</a> (2007).</li>
<li>Renard, P., Ernest, I., Houbion, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+sensitive+multi-well+colorimetric+assay+for+active+NFkappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB.</a> Nucleic Acids Res. 29, E21(2001).</li>
<li>Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+topoisomerase+I+inhibitors%3A+chemistry%2C+biology%2C+and+interfacial+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">DNA topoisomerase I inhibitors: chemistry, biology, and interfacial inhibition.</a> Chem Rev. 109, 2894-2902 (2009).</li>
<li>Pennisi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomics.+ENCODE+project+writes+eulogy+for+junk+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genomics. ENCODE project writes eulogy for junk DNA.</a> Science. 337, 1159-1161 (2012).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

DNA-bindende assays worden gebruikt om het vermogen van transcriptiefactoren te interageren met DNA te meten. Voor DNA binding omvatten elektroforetische mobiliteit verschuiving (EMSA) 1 en chromatine immuneprecipitation (ChIP) gebaseerde testen 3 en bepalingen waarbij 96-well formaat 4 zoals chemiluminescente assays 2. Het EMSA is niet-kwantitatieve en maakt gebruik van radioactief gemerkt (32 P) oligonucleotiden. Deze worden geïncubeerd met nucleaire eiwitten en b...

DNA-bindende assays zijn nuttig bij het meten van het vermogen van transcriptiefactoren te interageren met DNA. Assays voor DNA-binding omvatten elektroforetische mobiliteit shift assays (EMSA) die afhankelijk zijn van radioactief gemerkte oligonucleotiden 1 of chemiluminescentie assays 2. Chromatine immuneprecipitation (ChIP) gebaseerde testen 3 en bepalingen waarbij 96-well formaat 4 zijn ook beschreven. De EMSA een niet-kwantitatieve test die het gebruik van radioactief gemerkte oligonucleotiden vereist. Wanneer nucleaire eiwitten associëren met de specifieke nucleotide promoter sequenties, bindende complexen zijn vertraagd op polyacrylamidegelen en de specifieke transcriptiefactor kunnen worden gevalideerd met een antilichaam &quot;supershift&quot;. We hebben een kwantitatieve DNA bindingstest met behulp van een enzymgekoppelde immunosorbent formaat (D-ELISA), die in staat is de interactie van RUNX2 meten DNA-bindende sequenties die overeenkomen met bepaalde promoter elementen ontwikkeld in RUNX2 doelwit genen. Gebruik van een anti-RUNX2 antilichaam verschaft specificiteit voor de bepaling en het ontbreken van radiolabel onderscheiden deze assay uit de traditionele gel shift assay 5. Detectie van binding complexen is mogelijk met het gebruik van een secundair antilichaam gekoppeld aan mierikswortel peroxidase (HRP), die een HRP substraat tetramethylbenzidine (TMB) wordt omgezet in een gekleurd product voor spectrofotometrische analyse. De test hier vermeld kan het gebruik van gemuteerde DNA-oligonucleotiden als controles opgenomen en kan worden gebruikt voor de detectie van competitieve of niet-competitieve remmers van DNA-binding. Het screenen van nieuwe anti-tumor verbindingen is ook mogelijk met deze assay.

<table><tbody><tr><td>Poly dI/dC</td><td>GE Healthcare, Piscataway, NJ</td><td>US20539-5UN</td><td>1 U ~50mg</td></tr><tr><td>RUNX2 antibody</td><td>MBL International Corp., Woburn, MA</td><td>D130-3</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>Fab-specific peroxidase conjugated antibody</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A9917</td><td>7.1 mg/ml</td></tr><tr><td>TMB Substrate (tetramethyl benzidine)</td><td>EXALPHA Biologicals, Shirley, MA</td><td>X1189S</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Sodium carbonate</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>57995</td><td>Plate-fixing</td></tr><tr><td>Sulfuric Acid</td><td>VWR, West Chester, PA</td><td>BDH-39922-1</td><td>Stop solution</td></tr><tr><td>Multi-well plates</td><td>Greiner Bio-One, Basel, Switzerland</td><td>655996</td><td>Avidin-coated, black sides</td></tr><tr><td>HALT</td><td>Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL</td><td>78440</td><td>Protease and phosphatase inhibitors</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td>Various manufacturers</td><td>Laboratory grade</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabel 1. Reagentia</td></tr><tr><td>Spectrofotometer: Biotrak II Visible plate reader</td><td>Amersham Biosciences</td><td></td><td>Voor gebruik met stopreactie methode</td></tr><tr><td>Spectrofotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader</td><td>Bio-Tek Instruments, Inc.</td><td></td><td>Voor gebruik met continue kinetische monitoring</td></tr><tr><td colspan="4">Tabel 2. Apparatuur</td></tr></tbody></table>

een kwantitatieve analyse naar protein studie: dna interacties, discover transcriptieregulatoren van genexpressie, en het identificeren van nieuwe anti-tumor agents

A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

Vele DNA-bindende assays zoals elektroforetische mobiliteit shift assays (EMSA), chemiluminescente assays, chromatine immunoprecipitatie (ChIP)-gebaseerde testen en multiwell-gebaseerde bepalingen worden gebruikt om transcriptie factor activiteit te meten. Echter, deze tests zijn nonquantitative ontberen specificiteit, kan het gebruik van radioactief gemerkte oligonucleotiden omvatten, en kunnen niet aangepast voor het screenen van remmers van DNA-binding zijn. Anderzijds, toepassing van een kwantitatieve DNA-bindings-enzyme linked immunosorbent assay (D-ELISA) test tonen we eiwitinteracties kern met DNA met de RUNX2 transcriptiefactor die afhankelijk specifieke associatie met consensus-DNA-bindende sequenties aanwezig biotine- gelabelde oligonucleotiden. Voorbereiding van de cellen, de winning van nucleair eiwit, en het ontwerp van dubbelstrengs oligonucleotiden worden beschreven. Avidine gecoate 96-well platen zijn bevestigd met alkalische buffer en geïncubeerd met nucleaire eiwitten nucleotide blokkeerbuffer. Follwegens uitvoerig wassen van de platen, specifieke primair antilichaam en secundair antilichaam incubaties worden gevolgd door de toevoeging van mierikswortel peroxidase substraat en ontwikkeling van de colorimetrische reactie. Stop reactiewijze of continue kinetische controle werden gebruikt om kwantitatief te meten eiwit interactie met DNA. We bespreken geschikte specificiteit controles, waaronder behandeling met niet-specifiek IgG of eiwit of primaire antilichaam. Toepassingen van de test beschreven onder zijn nut in drug screening en representatieve positieve en negatieve resultaten worden besproken.

De D-ELISA methode is zeer specifiek voor de aangegeven DNA-bindingseiwit zolang een sequentie-specifieke dubbelstrengs oligonucleotide dat drie kopieën van de consensus RUNX2 bindingsplaats (ACACCA) gebruikt. Het primaire antilichaam dat het eiwit factor versterkt ook de specificiteit. Het secundaire antilichaam bevat covalent gebonden mierikswortelperoxidase (HRP) dat een duidelijk substraat (tetramethylbenzidine) omgezet in een gekleurd product voor gemakkelijke detectie (fig. 1). Daarom moet een aan...

We ontwikkelden een kwantitatieve DNA-bindende ELISA gebaseerde bepaling om transcriptiefactor interactie met DNA te meten. Hoge specificiteit voor de RUNX2 eiwit werd bereikt met een consensus DNA-herkenning oligonucleotide en specifieke monoklonale antilichaam. Colorimetrische detectie met een enzym-gekoppelde antilichaam substraat reactie werd gevolgd in real time.

Een Kwantitatieve Analyse naar Protein Studie: DNA interacties, Discover transcriptieregulatoren van genexpressie, en het identificeren van nieuwe anti-tumor Agents

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

Het algemene doel van deze procedure is om een kwantitatieve DNA-bindingsassay te demonstreren, die nuttig is bij het onderzoeken van eiwit-DNA-interacties, het ontdekken van transcriptionele regulatoren van genexpressie en het identificeren van nieuwe antitumor-middelen. Dit wordt bereikt door eerst een met streptavidine gecoate assayplaat voor te bereiden met een passend BIOTINYLEERD DNA-doelwit. De tweede stap is het toevoegen van nucleaire extracteiwitten, met of zonder potentiële remmers, om binding met het DNA-doelwit mogelijk te maken.Vervolgens worden de gebonden transcriptiefactoren gedetecteerd met primaire antilichamen en secundaire antilichamen gekoppeld aan mierikswortelperoxidase. De laatste stap is het toevoegen van een mierikswortelperoxidase-substraat aan de putjes om kleurontwikkeling teweeg te brengen. Ten slotte wordt de kleurontwikkeling gemeten met de spectrofotometer.Na verloop van tijd zal de mate van kleurverandering de graad van DNA-binding en het effect van potentiële remmers van DNA-binding aangeven. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere technieken, zoals de electrophoretic mobility shift assay, is dat het een kwantitatieve assay is voor de binding van DNA-remmers. Begin met het voorbereiden van een adequaat aantal celculturen, bestaande uit ten minste 3 × 10⁷ cellen voor elke geteste conditie.Hier worden humane endotheelcellen uit het beenmerg gebruikt, die het run X twee-eiwit tot expressie brengen. Zodra de cellen 80% confluent zijn, worden ze behandeld met 0,2 µg/mL nocodazole om de celgroei te stoppen bij de G2/M-fase van de celcyclus.Dit zal het run X twee-eiwit stabiliseren en een maximale DNA-binding produceren na 16 uur. Lyseer de cellen en isoleer het eiwit zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Zodra het eiwit is geïsoleerd, wordt de eiwitconcentratie gemeten met een standaard BCA-assay.Bewaar de monsters vervolgens bij -80 °C in aliquots van 10 µL met concentraties tussen 2 en 5 mg/mL. Fixeer een 96-wellplaat met een 0,1 M natriumcarbonaatoplossing door 300 µL van het mengsel per well toe te voegen. Bereid voldoende wells voor zodat elk monster in triplikaat kan worden geanalyseerd.Incubeer de plaat gedurende twee uur op een schudplatform bij kamertemperatuur. Was de plaat vervolgens drie keer met 300 µL strep avid- en wasbuffer en incubeer met 100 µL biotine-gelabelde dubbelstrengs oligonucleotiden bij 1,25 nanomoles per well gedurende twee uur onder schudcondities. Was de platen daarna nog drie keer met de strep din-wasbuffer.Voeg vervolgens 100 µL per well toe van de mastermix die bestaat uit één XDNA-bindingsbuffer, DNA-bindende eiwitten in een concentratie van 3 tot 9 µg per well en poly DIGC in een concentratie van 1 µg per well. Voeg daarna de mastermix toe die eventuele inhibitoren bevat, zoals vitamine D3, of de passende verdunning van de oplosmiddelcontrole, zoals ethanol, aan de respectievelijke wells. Dek de plaat vervolgens af en plaats deze gedurende de nacht op een schudplatform bij 4 °C, na de incubatie met de nucleaire extracten.Was de plaat drie keer met de strep avid wasbuffer. Voeg vervolgens per well 90 µL toe van een run X twee specifieke monoclonale antilichaam, verdund tot 0,2 ng/µL in de strep avid wasbuffer. Dek de plaat af en incubeer deze een uur bij kamertemperatuur op een schudplatform.Spoel de wells vervolgens opnieuw met strep avid- en wasbuffer en voeg 90 µL per well toe van het mengsel van secundaire antilichamen, bestaande uit 5 ng/µL fab-specifiek affiniteitsgezuiverd HRP-geconjugeerd antilichaam verdund in de strep. AVID- en wasbuffer. Incubeer het secundaire antilichaam gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een schudplatform.Was dit vervolgens zes keer met 300 µL Strp- en wasbuffer per well. Ontwikkel daarna de resultaten door 50 µL tetraethylbenadine-substraat direct vanuit de voorraadfles aan elke well toe te voegen voor continue monitoring van de monsters. Plaats de monsters in de spectrofotometer en meet de absorbentie continu bij 635 nm.Voor een eenmalige meting worden de monsters 10 tot 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker geïncubeerd. Gedurende deze tijd moeten de wells veranderen van kleurloos naar verschillende gradaties van blauw. Stop de reactie door aan elk monster 50 µL zwavelzuur toe te voegen.Meet vervolgens de absorbentie van elke put bij 450 nanometer met een plaatlezer voor 96-putjesplaten. De hier getoonde grafiek is een voorbeeld van continue monitoring van het effect van biologisch actieve vitamine D3 op de binding van run X 2D NA. De geteste concentraties hadden weinig effect op de binding van run X 2D NA.Hoewel andere vitamine D3-verbindingen dramatische effecten hebben getoond, werd de hier geteste verbinding 5 2 2 1 9 7 5 geïdentificeerd met behulp van computerondersteund geneesmiddelontwerp. Bij testen vertoonde de verbinding een dosisafhankelijke inhibitie van rux twee binding van 1 nM tot 100 µM; 50% van de renx 2D NA binding kon worden geremd met slechts 0,01 µM van de verbinding.Na het bekijken van deze video zou u een goed beeld moeten hebben van hoe u de DNA-bindingsassay uitvoert en potentiële remmers van DNA-binding test.

a-quantitative-assay-to-study-proteindna-interactions-discover

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Vanwege het tijdelijke karakter van de pre-mRNA, kan het moeilijk zijn te isoleren en te...

Een snelle High-throughput Methode voor Mapping Ribonucleoproteins (RNP&#39;s) op de menselijke pre-mRNA

This video demonstrates an in vivo assay in bacteria to study the interaction of RNA-binding proteins (RBPs) with RNA. The bacterial cells are transformed with two plasmid constructs — a binding-site plasmid encoding an mRNA containing a fluorescent reporter gene downstream of an RBP-binding site — while an RBP plasmid expresses the RBP proteins under the control of an inducer. Upon inducer-mediated increase in RBP production, the RBPs bind to the mRNA, resulting in translational repression of...

Reporter Gene Repression Assay to Study Translational Regulation of a Target Gene

Hier beschrijven we een celgebaseerde reportergen-test als waardevol hulpmiddel om chemische bibliotheken te screenen op verbindingen die post-transcriptionele controlemechanismen moduleren die worden uitgeoefend via 3’ UTR.

High-throughput screening voor Chemische Modulators van Post-transcriptioneel gereguleerde genen

In dit manuscript beschrijven we een protocol om transcriptie en de remmende activiteit van antibacteriële middelen die zich richten op bacteriële transcriptie functioneel te onderzoeken.

In vitro transcriptie Testen en hun toepassing in Drug Discovery

Dit protocol beschrijft het combinatorische gebruik van ChIP-seq, 4sU-seq en totaal RNA-seq ribosoom profilering voor cellijnen en primaire cellen. Hierdoor wijzigingen bijhouden in transcriptiefactor bindend, DOVO transcriptie, RNA-verwerking, omzet en vertaling na verloop van tijd, en de algemene gang van zaken in geactiveerd en/of snel veranderende cellen weer te geven.

Real-time analyse van transcriptiefactor bindend, transcriptie, vertaling en omzet globale u gebeurtenissen wilt weergeven tijdens de activatie van de cellulaire

Dit verslag wordt een snelle en betrouwbare methode voor het valideren van mRNA doelstellingen van cellulaire miRNAs beschreven. Het gebruik van de methode synthetische biotinyleerd vergrendeld nucleïnezuur LNA gebaseerde miRNA bootst te vangen target mRNA. Vervolgens daar beklede magnetische kralen pulldown worden gebruikt de doelstelling mRNA voor kwantificering van qPCR polymerase-kettingreactie.

Biotine gebaseerde Pulldown Assay te valideren mRNA doelstellingen van cellulaire miRNAs

Bij deze methode kwantificeren we de bindende affiniteit van RNA-bindende eiwitten (rbp's) naar verwant en niet-verwant binding sites met behulp van een eenvoudige, Live, reporter assay in bacteriële cellen. De test is gebaseerd op onderdrukking van een reporter-gen.

Een test voor het kwantificeren van eiwit-RNA-binding bij bacteriën

Hier wordt een antilichaam-vrije in-vitro test voor directe analyse van methyltransferase activiteit op synthetische of in vitro getranscribeerde RNA beschreven.

Antilichamen-vrije assay voor analyse van RNA-methyltransferase activiteit

Om nieuwe regelgevers van transcriptiefactoren te identificeren, ontwikkelden we een benadering om arrayed lentivirale of retrovirale RNAi-bibliotheken te screenen met behulp van een dual-luciferase-gebaseerde transcriptie-verslaggever test. Deze aanpak biedt een snelle en relatief goedkope manier om honderden kandidaten in één experiment te screenen.

Identificatie van Transcription Factor Regulators met behulp van Medium-Throughput Screening van arrayed bibliotheken en een Dual-Luciferase-Based Reporter

Hier presenteren we een protocol om de in vivo lokalisatie van antilichamen in muizen tumor xenograft modellen te bestuderen.

Analyse van tumor- en weefselverdeling van doelantigeen-specifiek therapeutisch antilichaam

Hier presenteren we een geoptimaliseerde in vitro methode om eiwitinteractoren van specifieke RNA-sequenties te ontdekken, kwantificeren en valideren, met behulp van totaal eiwitextract uit menselijke cellen, streptavidineparels bedekt met gebiotinyleerd RNA en massaspectrometrie-analyse.

Een geoptimaliseerde kwantitatieve pull-down analyse van RNA-bindende eiwitten met behulp van kort gebiotinyleerd RNA

Leer een kwantitatieve DNA-bindingsassay voor het bestuderen van eiwit-DNA-interacties met streptavidine-platen en biotinylatie. Deze methode helpt transcriptieregulatoren te identificeren en nieuwe anti-tumoragenten te ontdekken.

Een Kwantitatieve Analyse naar Protein Studie: DNA interacties, Discover transcriptieregulatoren van genexpressie, en het identificeren van nieuwe anti-tumor Agents (Video) | JoVE Journal

Een Kwantitatieve Analyse naar Protein Studie: DNA interacties, Discover transcriptieregulatoren van genexpressie, en het identificeren van nieuwe anti-tumor Agents

Meer video's verkennen