Microfluïdische On-chip Capture-cycloadditiereactie omkeerbaar Immobiliseer Small Molecules of Multi-component Structuren voor biosensortoepassingen

Het algemene doel van het volgende experiment is om een snelle en generaliseerbare strategie te demonstreren om kleine moleculen en functionele nanodeeltjes omkeerbaar te immobiliseren op het oppervlak van sensorchips. Dit wordt bereikt door eerst anti GST-antilichamen op een sensoroppervlak te immobiliseren. Als tweede stap het vastleggen van GST-antigeen.

Functioneel met trans cyclo, octine of tetra zine-groepen biedt een reactieve oppervlakte voor opeenvolgende cyclo-edities met kleine molecuul tet sine-derivaten of nanodeeltje trend cyclo-octaan-conjugaten, die vervolgens worden gefunctionaliseerd met kleine molecuul tet sine-derivaten. Vervolgens kan het gefunctionaliseerde oppervlak worden gebruikt voor interactieanalyse met een gewenst opgelost doelwit. In de laatste stap wordt het oppervlak geregenereerd, waardoor opeenvolgende vastlegcycli cyclo-editie mogelijk zijn. Bindingsresultaten tonen aan dat bio-orthogonale reacties het vermogen van geïmmobiliseerde kleine moleculen of in situ twee functionele nanodeeltjes behouden om te interageren met het FK BP 12-doelwit en illustreren hoe deze aanpak het toepassingsgebied voor SPR kan uitbreiden.

Het belangrijkste voordeel van deze on-chip vastlegcyclus-editietechniek is dat het een snelle omkeerbare en mobilisatie van kleine moleculen mogelijk maakt met controle over oriëntatie en I-mobilisatie dichtheid. Typisch kan het vastlegcyclus-editieproces binnen enkele minuten worden uitgevoerd, wat de oppervlaktevoorbereidingstijden aanzienlijk verkort, waardoor de procedure wordt aangetoond. Jason Sandler, een student uit ons laboratorium. Om deze procedure te beginnen bij acht microliters van een 50 millimolair T-C-O-N-H-S-oplossing in DMSO tot 100 microliters van een oplossing van één milligram per milliliter GST in PBS. Na het schudden van het mengsel bij kamertemperatuur gedurende één uur, verwijdert u het overtollige reagens met behulp van een Zeba spin desalting kolom.

Voeg vervolgens zes microliters van een 25 millimolair tetra NHS Ester-oplossing in DMF toe aan 75 microliters van een oplossing van één milligram per milliliter GST in PBS en schud het mengsel na één uur bij kamertemperatuur. Verdun het reactiemengsel met 25 microliters PBS en zuiver met behulp van een spin desalting kolom. Voeg vervolgens 100 microliters van de 50 millimolair T-C-O-N-H-S-oplossing toe aan 150 microliters van een geëmaneerde nanodeeljoplossing en schud het mengsel op dezelfde manier als voorheen.

Na het mengen, verwijdert u het overtollige reagens door gelfiltratie met behulp van een NAP 10-kolom. Geel met PBS-buffer. Verzamel de gekleurde band die het N-P-T-C-O-product bevat.

Breng het gezuiverde monster over in een centrifugeerbuis met een centrifugaalfilterapparaat met een moleculair gewichtssnijden van 100.000. Concentreer vervolgens het monster tot een eindvolume van ongeveer 150 microliters na centrifugatie. Voeg 50 microliters van een 0,1 molair cynic anhydride-oplossing in DMSO toe aan de N-P-T-C-O-oplossing.

Na het schudden van het mengsel bij kamertemperatuur gedurende één uur, zuivert u het N-P-T-C-O-product met behulp van een NAP 10-kolom die elueert met PBS met behulp van een oppervlakteplasma in resonantie-instrument, selecteer immobilisatie op flowcellen één en twee in de AM-immobilisatiesjabloon. Wijzig de Amin-methode om oppervlaktecarboxylgroepen te activeren door injectie van een een-op-een-oplossing van 0,4 molair EDC en 0,1 molair NHS gedurende 480 seconden. Bij een stroomsnelheid van 10 microliters per minuut, stelt u de injectie van ethanolamine in om de resterende geactiveerde esters te blussen tot een 422ste contacttijd bij een stroomsnelheid van 10 microliters per minuut.

Voer de naam van het ligand anti GST in en stel het in om te injecteren voor een contacttijd van 420 seconden bij een stroomsnelheid van 10 microliters per minuut. Plaats vervolgens de eerder bereide oplossingsbuisjes in reagensrek twee. Zorg ervoor dat de posities overeenkomen met de inhoudslijst na het toewijzen van de bestandsnaam en bestemming waar de gegevens worden opgeslagen.

Start de immobilisatie. Bewerk de immobilisatiesjabloon om slechts 20 microgram per milliliter van de GST-ligandoplossing gedurende 420 seconden bij vijf microliters per minuut over referentie-flowcel één te injecteren. Plaats de buisjes met G-S-T-T-C-O-A eerder bereide 10 micromolaire TERAZ olaine-oplossing en de regeneratieoplossing in reagensrek twee.

Selecteer de handmatige uitvoermethode, stel de stroomsnelheid in op vijf microliters per minuut en de stromingspaad op flowcel twee. Injecteer de G-S-T-T-C-O-oplossing gedurende 420 seconden gevolgd door de Teraz Benz Lamine-oplossing gedurende 600 seconden. Regenereer vervolgens het oppervlak met twee 32nd injecties van regeneratieoplossing.

Na het plaatsen van de GST TERAZ zine, N-P-T-C-O, teraz Belamine en regeneratieoplossing buisjes in reagensrek twee, selecteert u de handmatige uitvoermethode van het instrument, stelt u de stroomsnelheid in op vijf microliters per minuut en stelt u het stromingspaad in op flowcel twee. Injecteer een oplossing van GST Tetra zine gedurende 60 seconden, gevolgd door een oplossing van N-P-T-C-O gedurende 60 seconden. Injecteer ten slotte een oplossing van tetras zine belamine gedurende 60 seconden.

Wanneer u klaar bent, regenereert u het oppervlak op dezelfde manier als voorheen. Selecteer vervolgens een nieuwe methode en voer de algemene parameters in, inclusief gegevensverzameling, snelheidsdetectie, monstercompartiment, temperatuur, concentratie-eenheden en bufferinstellingen. Maak in het paneel met teststappen een nieuwe stap aan en noem het monster.

Stel vervolgens het doel in en verbind de basisinstellingen op basis van het monster in het paneel met cyclustypen, maak een nieuwe cyclusstap aan en voeg