Name: Microfluïdische On-chip Capture-cycloadditiereactie omkeerbaar Immobiliseer Small Molecules of Multi-component Structuren voor biosensortoepassingen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-23T18:15:00.000+00:00
Duration: 14 min 43 s
Description: Leer een microfluïdische on-chip capture-cycloadditiereactie om kleine moleculen en functionele nanopartikels reversibel te immobiliseren op sensorchips voor SPR-studies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij erkennen financiering van NIH (NHLBI Contract No HHSN268201000044C naar RW, SH en SYS).

1. Voorbereiding van GST en Nanoparticle (NP) Stamverwanten <ol><li> GST-TCO voorbereiding: <ol><li> Voeg 8 ul van TCO-NHS-oplossing (50 mM in DMSO) en 100 gl GST (1 mg / ml in PBS) en schud het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. </li><li> Verwijder overtollig reagens met een Zeba draai ontzoutingskolom. Het gewonnen filtraat dat het GST-TCO conjugaat wordt bewaard bij 4 ° C vóór gebruik. </li></ol></li><li> GST-Tz voorbereiding: <ol><li> Voeg 6 pl Tz-NHS-oplossing (25 mM in DMF) 75 gl GST (1 mg / ml in PBS) en schud het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. </li><li> Verdun het reactiemengsel met 25 pi PBS en zuiveren met behulp van een spin ontzoutingskolom. Het filtraat dat het GST-Tz conjugaat wordt bewaard bij 4 ° C vóór gebruik. </li></ol> Opmerking: Massa analyse (MALDI-TOF) bleek dat gemiddeld 10 ~ Tz of TCO moleculen werden geconjugeerd aan GST. </li><li> NP-TCO voorbereiding: <ol><li> Voeg 100 ul van TCO-NHS-oplossing (50 mM in DMSO) te150 ui geamineerde nanodeeltjes (NP-NH2, 8,7 mg Fe / ml in PBS, 3 nm ijzerkern ~ 8000 Fe / NP) en schud mengsel bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. </li><li> Verwijder overtollig reagens door gelfiltratie gebruik van een NAP-10-kolom geëlueerd met PBS-buffer. Verzamel de gekleurde band met de NP-TCO product. </li><li> Concentreer het filtraat in tot een eindvolume van ~ 150 ul met behulp van een centrifugale filterinrichting (100 k MWCO). </li><li> Voeg 50 ul van barnsteenzuuranhydride (0,1 M in DMSO) aan de NP-TCO-oplossing en schud bij kamertemperatuur gedurende 1 uur (anhydride reageert met de resterende aminen terminale carbonzuren vormen. Dit voorkomt niet-specifieke interacties met het dextran oppervlak). </li><li> Zuiver het NP-TCO product gebruik van een NAP-10 kolom elueren met PBS. Bewaar de oplossing van NP-TCO bij 4 ° C vóór gebruik. </li></ol></li></ol> 2. Voorbereiding van de oppervlakte Alle oppervlakteplasmonresonantie testen worden uitgevoerd op een Biacore T100 instrument (GE Healthcare) bij25 ° C met een CM5 sensorchip en PBS-P als loopbuffer tenzij anders vermeld. Biacore Controle en evaluatie software met het instrument meegeleverd worden ingezet voor het opzetten van experimenten en het analyseren van gegevens. Twee modi, de toepassing wizards en handmatige termijn zal worden gebruikt voor de voorbehandeling van het oppervlak en het toezicht op de chip capture-cycloadditie. Werkwijze builder mode wordt gebruikt voor het opzetten omgekeerde oriëntatie bindingsexperimenten en het meten cycloadditiereactie tarieven. Gegevens zijn dubbele verwijzing afgetrokken en kinetische analyses worden uitgevoerd met behulp van een 1:1 Langmuir bindend model. <ol><li> Gebruik de amine immobilisatie tovenaar sjabloon en selecteer immobilisatie op Flow cellen 1 (referentie) en 2 (detectie). Pas amine methode oppervlak carboxylgroepen geactiveerd door injectie van een 1:1 oplossing van 0,4 M EDC: 0,1 M NHS gedurende 480 seconden bij een stroomsnelheid van 10 pl / min. Stel de injectie van ethanolamine om de resterende geactiveerde esters tot 420 sec contacttijd lessen opeen stroomsnelheid van 10 pl / min. </li><li> Input ligand naam, anti-GST (18 ug / ml in acetaatbuffer, pH 5,0) en stel injecteren een contacttijd van 420 sec bij een stroomsnelheid van 10 pl / min. </li><li> Plaats vereiste oplossing flacons in reagens rek 2 en zorg ervoor dat de standpunten met de inhoud lijst passen. Opslaan en start immobilisatie. Opmerking: Het uitvoeren van de immobilisatie wizard deze manier leidt tot anti-GST immobilisatie niveaus in het bereik van ~ 14.000 tot 17.000 RU. </li><li> Bewerk de immobilisatie wizard om alleen te injecteren GST ligand (20 ug / ml) oplossing voor 420 sec bij 5 pl / min meer dan verwijzing Flow cel 1. </li></ol> 3. Monitoring On-chip Capture-cycloadditie van gefunctionaliseerde moleculen <ol><li> Monitoring on-chip capture-cycloadditiereactie in real-time (figuur 2). <ol><li> Plaats GST-TCO (20 ug / ml), Tz-BnNH 2 (10 uM) en regeneratie (10 mM glycine, pH = 2,0) oplossing in flesjes reagens rek 2. Selecteer de manUAL run methode, stelt het debiet tot 5 pl / min en stromen weg naar cel 2 Flow. </li><li> Injecteren oplossing van GST-TCO voor 420 sec. </li><li> Injecteer oplossing van Tz-BnNH 2 600 sec. </li><li> Regenereren het oppervlak met twee 30 sec injecties van regeneratie oplossing. </li></ol></li><li> Monitoring on-chip montage van meerdere componenten structuren realtime (Figuur 3): <ol><li> Plaats GST-Tz (20 ug / ml), NP-TCO (100 ug Fe / ml), Tz-BnNH 2 (10 uM) en regeneratie (10 mM glycine, pH = 2,0) oplossing in flesjes reagens rek 2. Selecteer het instrument handmatig run methode, stelt het debiet tot 5 pl / min en de stroom weg naar cel 2 Flow. </li><li> Injecteer een oplossing van GST-Tz voor 60 sec. </li><li> Injecteer een oplossing van NP-TCO voor 60 sec. </li><li> Injecteer een oplossing van Tz-BnNH 2 voor 60 sec. </li><li> Regenereren het oppervlak met twee 30 sec injecties van regeneratie oplossing. </li></ol></li></ol> 4. MMonitoring van immobilisatie Dichtheid en Bepaling van Cycloadditiereacties tarieven <ol><li> Karakterisering van kleine molecule cycloadditiereactie tarieven (figuur 4). <ol><li> Selecteer nieuwe methode en input algemene parameters. In het panel test stappen maak een nieuwe stap en noem deze Sample. Stel het doel en Connect basisinstellingen te proeven. </li><li> In het panel Cycle Soorten Maak een nieuwe cyclus stap en voeg de volgende opdrachten, Capture, Sample, Regeneratie 1 en Regeneratie 2. </li><li> Selecteer de opdracht Capture; ingang ligand naam (GST-TCO, 20 ug / ml), contacttijd 120 sec bij 5 pl / min en stel stroomweg naar: Second. Selecteer de Sample commando; ingang 180 sec contacttijd, 60 sec dissociatie tijd, 30 pl / min debiet en zet stroomweg naar: Beide. Selecteer de Regeneration 1 commando; ingang regeneratieoplossing naam (10 mM glycine-HCl pH 2,0), contacttijd van 30 seconden bij 30 pl / min en stel stroomweg naar: Second. Herhaal hetzelfde voor Regeneratie 2 commando. &lt;/ Li&gt; <li> Selecteer Setup Uitvoeren en stel stroomweg aan: 2-1. Kies volgende en vul monster lijst met analytoplossing (Tz-BnNH 2) en concentratie series (0.3-10 uM, 1:02 verdunning). Selecteer naast rack positie paneel. Plaats oplossing flacons in reagens rek 2 en verdunningsreeks in 96-well plaat en zorg ervoor dat de standpunten met de inhoud lijst passen. Opslagmethode template en start bindingassay. Bindingsgegevens en kinetische analyse worden getoond in Figuur 4. </li></ol></li><li> Karakterisering van NP cycloadditiereactie tarieven (figuur 4). <ol><li> Open het opgeslagen methode sjabloon van boven en verander de volgende parameters. Selecteer het paneel Capture; verandering ligand naam aan GST-Tz, 20 ug / ml. Selecteer het voorbeeld paneel; verandering contacttijd tot 120 sec contacttijd en dissociatie tijd tot 120 sec. </li><li> Selecteer de sample lijst; analyt veranderen in NP-TCO en concentratie series (7-224 nM, 1:02 verdunning). Plaats oplossing flacons in reagens rack2 en verdunning serie in 96-well plaat en zorg ervoor dat de standpunten met de inhoud lijst passen. Opslagmethode template en start bindingassay. Bindingsgegevens en kinetische analyse worden getoond in Figuur 4. </li></ol></li></ol> 5. Het meten van de binding van FKBP12 aan geïmmobiliseerd AP1497 Omgekeerde oriëntatie binding studies met FKBP12 de analyt en samengestelde AP1497 als geïmmobiliseerde ligand (Figuur 5). De algemene methode voor deze test wordt als volgt met behulp van de methode builder tool opgezet: <ol><li> Selecteer nieuwe methode en input algemene parameters. In het panel test stappen maken en een naam Capture, Sample and Regeneration stappen. Selecteer het corresponderende Doel en aansluiten basisinstellingen. </li><li> Selecteer panel Cycle Types en maak 3 cyclus stappen: Vastleggen, Sample and Regeneration. </li><li> Plaats de opdracht Capture tweemaal onder Capture cyclus stap. Selecteer Capture 1 paneel en selecteer capture oplossing als variable Stel contacttijd 300 sec bij een stroomsnelheid van 5 pl / min en stel stroompad: Second. Selecteer het paneel Vastleggen 2 en selecteert capture oplossing variabele ingesteld contacttijd 250 sec bij een stroomsnelheid van 5 pl / min en stel stroompad: Second. </li><li> Plaats de Sample commando onder de Sample cyclus stap. Selecteer het voorbeeld paneel; set contacttijd tot 60 sec, dissociatie tijd tot 200 sec bij een stroomsnelheid van 30 pl / min en stel stroomweg naar: Beide. </li><li> Plaats de Regeneratie commando twee keer onder de Regeneratiecyclus stap. Selecteer de Regeneration 1 paneel; ingang regeneratieoplossing naam (10 mM glycine-HCl pH 2,0), contacttijd van 30 seconden bij 30 pl / min en stel stroomweg naar: Second. Herhaal hetzelfde voor het paneel Regeneration 2. </li><li> Selecteer Setup Uitvoeren en stel stroomweg aan: 2-1. Kies volgende en input capture oplossing namen (GST-TCO en AP1497-Tz), monster naam (FKBP12), concentratie-serie (,020-5 ug / ml, 1:02 verdunning) en MW (13.000). Plaats oplossing flacons in reagent rack 2 en verdunningsreeks in 96-well plaat en zorg ervoor dat de standpunten met de inhoud lijst passen. Opslagmethode template en start bindingassay. Kinetische analyse gegevens worden getoond in figuur 5. </li></ol> 6. Het meten van de binding van FKBP12 tot AP1497 Gehecht aan geïmmobiliseerd NP De algemene methode voor de nanodeeltjes immobilisatie, klein molecuul derivatisering en FKBP12 bindingstest wordt als volgt met behulp van de methode builder tool set-up: <ol><li> Open het opgeslagen methode sjabloon van boven en aan te passen. Plaats een extra Capture commando onder Capture cyclus stap. Selecteer de Capture 1 paneel; deselecteren capture oplossing als variabele en de naam capture oplossing 1 (GST-Tz). Stel contacttijd tot 60 sec bij een stroomsnelheid van 5 pl / min en stel stroompad Second. Selecteer de Capture 2 paneel; deselecteren capture oplossing als variabele en de naam capture oplossing 2 (NP-TCO). Stel contacttijd tot 90 sec bij een stroomsnelheid van 5 pl / min eningesteld stroomweg naar tweede. Selecteer de Capture 3 paneel; deselecteren capture oplossing als variabele en de naam capture oplossing 3 (AP1497-Tz). Stel contacttijd 180 sec bij een stroomsnelheid van 5 pl / min en stel stroompad Second. </li><li> Selecteer Setup Uitvoeren en stel stroomweg aan: 2-1. Kies volgende keer. Plaats oplossing flacons in reagens rek 2 en verdunningsreeks in 96-well plaat en zorg ervoor dat de standpunten met de inhoud lijst passen. Opslagmethode template en start bindingassay. Kinetische analyse gegevens worden getoond in figuur 5. </li></ol>

<ol><li>Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Haun, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+sensitive+pretargeted+labeling+of+cancer+cells+through+a+tetrazine%2Ftrans-cyclooctene+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 48, 7013-7016 (2009).</li>
<li>Seitchik, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+tetrazine+amino+acid+directs+rapid+site-specific+in+vivo+bioorthogonal+ligation+with+trans-cyclooctenes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes.</a> J Am Chem Soc. 134, 2898-2901 (2012).</li>
<li>Haun, J. B., Devaraj, N. K., Marinelli, B. S., Lee, H., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+intracellular+biomarkers+and+mediators+of+cell+activation+using+nanosensors+and+bioorthogonal+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Probing intracellular biomarkers and mediators of cell activation using nanosensors and bioorthogonal chemistry.</a> ACS Nano. 5, 3204-3213 (2011).</li>
<li>Budin, G., Yang, K. S., Reiner, T., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+probes+for+polo-like+kinase+1+imaging+and+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal probes for polo-like kinase 1 imaging and quantification.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 50, 9378-9381 (2011).</li>
<li>Liu, D. S., Tangpeerachaikul, A., Selvaraj, R., Taylor, M. T., Fox, J. M., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diels-Alder+cycloaddition+for+fluorophore+targeting+to+specific+proteins+inside+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Diels-Alder cycloaddition for fluorophore targeting to specific proteins inside living cells.</a> J Am Chem Soc. 134, 792-795 (2012).</li>
<li>Haun, J. B., Devaraj, N. K., Hilderbrand, S. A., Lee, H., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+chemistry+amplifies+nanoparticle+binding+and+enhances+the+sensitivity+of+cell+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal chemistry amplifies nanoparticle binding and enhances the sensitivity of cell detection.</a> Nat Nanotechnol. 5, 660-665 (2010).</li>
<li>Liong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+pathogen+detection+using+bioorthogonal+chemistry+and+diagnostic+magnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific pathogen detection using bioorthogonal chemistry and diagnostic magnetic resonance.</a> Bioconjug Chem. 22, 2390-2394 (2011).</li>
<li>Tassa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-chip+bioorthogonal+chemistry+enables+immobilization+of+in+situ+modified+nanoparticles+and+small+molecules+for+label-free+monitoring+of+protein+binding+and+reaction+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">On-chip bioorthogonal chemistry enables immobilization of in situ modified nanoparticles and small molecules for label-free monitoring of protein binding and reaction kinetics.</a> Lab Chip. 12, 3103-3110 (2012).</li>
<li>Pol, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+correct+protein+concentration+for+kinetics+and+affinity+determination+in+structure-function+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The importance of correct protein concentration for kinetics and affinity determination in structure-function analysis.</a> J Vis Exp. (37), e1746(2010).</li>
<li>MacBeath, G., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printing+proteins+as+microarrays+for+high-throughput+function+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination.</a> Science. 289, 1760-1763 (2000).</li>
<li>Ong, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+the+proteins+to+which+small-molecule+probes+and+drugs+bind+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identifying the proteins to which small-molecule probes and drugs bind in cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4617-4622 (2009).</li>
<li>Tassa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+affinity+and+kinetic+analysis+of+targeted+small+molecule-modified+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Binding affinity and kinetic analysis of targeted small molecule-modified nanoparticles.</a> Bioconjug Chem. 21, 14-19 (2010).</li>
<li>Weissleder, R., Kelly, K., Sun, E. Y., Shtatland, T., Josephson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+targeting+of+nanoparticles+by+multivalent+attachment+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell-specific targeting of nanoparticles by multivalent attachment of small molecules.</a> Nat Biotechnol. 23, 1418-1423 (2005).</li>
<li>Yuan, J., Oliver, R., Aguilar, M. I., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+plasmon+resonance+assay+for+chloramphenicol%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Surface plasmon resonance assay for chloramphenicol.</a> Anal Chem. 80, 8329-8333 (2008).</li>
<li>Myung, J. H., Gajjar, K. A., Saric, J., Eddington, D. T., Hong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendrimer-mediated+multivalent+binding+for+the+enhanced+capture+of+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Dendrimer-mediated multivalent binding for the enhanced capture of tumor cells.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11769-11772 (2011).</li>
<li>Keelan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotoxicology%3A+nanoparticles+versus+the+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanotoxicology: nanoparticles versus the placenta.</a> Nat Nanotechnol. 6, 263-264 (2011).</li>
<li>Lundqvist, M., Stigler, J., Elia, G., Lynch, I., Cedervall, T., Dawson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+size+and+surface+properties+determine+the+protein+corona+with+possible+implications+for+biological+impacts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle size and surface properties determine the protein corona with possible implications for biological impacts.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14265-14270 (2008).</li>
<li>Lundqvist, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+the+protein+corona+around+nanoparticles%3A+a+test+study%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">The evolution of the protein corona around nanoparticles: a test study.</a> ACS Nano. 5, 7503-7509 (2011).</li>
<li>Mammen, M., Choi, S. -K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyvalent+interactions+in+biological+systems%3A+implications+for+design+and+use+of+multivalent+ligands+and+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Polyvalent interactions in biological systems: implications for design and use of multivalent ligands and inhibitors.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 37, 2754-2899 (1998).</li>
<li>Kausaite-Minkstimiene, A., Ramanaviciene, A., Kirlyte, J., Ramanavicius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+random+and+oriented+antibody+immobilization+techniques+on+the+binding+capacity+of+immunosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Comparative study of random and oriented antibody immobilization techniques on the binding capacity of immunosensor.</a> Anal Chem. 82, 6401-6408 (2010).</li>
<li>Arkin, M. R., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibitors+of+protein-protein+interactions%3A+progressing+towards+the+dream%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream.</a> Nat Rev Drug Discov. 3, 301-317 (2004).</li>
<li>Giannetti, A. M., Koch, B. D., Browner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+plasmon+resonance+based+assay+for+the+detection+and+characterization+of+promiscuous+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Surface plasmon resonance based assay for the detection and characterization of promiscuous inhibitors.</a> J Med Chem. 51, 574-580 (2008).</li>
<li>Kimple, A. J., Willard, F. S., Giguere, P. M., Johnston, C. A., Mocanu, V., Siderovski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RGS+protein+inhibitor+CCG-4986+is+a+covalent+modifier+of+the+RGS4+Galpha-interaction+face%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The RGS protein inhibitor CCG-4986 is a covalent modifier of the RGS4 Galpha-interaction face.</a> Biochim Biophys Acta. 1774, 1213-1220 (2007).</li>
<li>GE Healthcare. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Biacore+Sensor+Surface+Handbook+BR-1005-71%22">Biacore Sensor Surface Handbook BR-1005-71</a>. , Edition AB, (2005).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

De capture-cycloadditiereactie hier beschreven methode maakt een snelle, omkeerbare immobilisatie van gemodificeerde nanodeeltjes en kleine moleculen voor label-free-chip gebaseerde interactie en kinetische studies. De immobilisatie protocol kan worden uitgevoerd minuten ter &lt;10 uM concentratie van kleine moleculen liganden. Door het moduleren van ligand concentratie en contacttijd immobilisatie dichtheden nauwkeurig kan worden gecontroleerd. Onze gegevens tonen aan dat on-chip bioorthogonal reacties behoud van de mo...

Efficiënte conjugatiereacties zijn waardevolle hulpmiddelen voor het bevestigen van bioactieve moleculen aan oppervlakken voor diverse biotechnologische toepassingen. Onlangs heeft de zeer snelle bioorthogonal [4 +2] cycloadditiereactie tussen trans-cycloocteen (TCO) en 1,2,4,5-tetrazine (Tz) gebruikt om celoppervlak, subcellulaire structuren, antilichamen en nanodeeltjes label 1. - 7 Hier gebruiken we de [4 +2] cycloadditie reactie in combinatie met antigen / antilichaam-capture (GST / anti-GST) voor wisselbaar-chip synthese van multi-component structuren Surface Plasmon Resonance (SPR) interactie analyse en bewaken van de proces in real-time (figuur 1). 8,9 name de capture-cycloadditie strategie maakt oppervlak regeneratie met behulp van een vooraf vastgesteld protocol. 8 Als gevolg, assemblage van stabiele sensor oppervlakken met controle over ligand oriëntatie en dichtheid voor tal van nieuwe assay formaten is nu mogelijk. Gebruikdeze strategie laten we de immobilisatie van TCO / Tz-gederivatiseerde kleine moleculen karakteriseren cycloadditie prijzen in verschillende buffer omstandigheden. We kozen voor het bekende interactie tussen FKBP12 en een molecuul AP1497 dat FKBP12 10-12 bindt als een voorbeeld om na te gaan of de capture-cycloadditie strategie behoudt het vermogen van de kleine molecule om te communiceren met de doelgroep wanneer hetzij rechtstreeks aangesloten op geïmmobiliseerde GST antigenen of aan geïmmobiliseerd nanodeeltjes (NP). Deze methode biedt een aantal voordelen. Ten eerste, de omkeerbare immobilisatie van kleine moleculen op sensorchips is nu mogelijk. Ten tweede, TCO / Tz immobilisatie van kleine moleculen maakt ook label-free interactiestudies dat de oriëntatie van canonieke SPR studies te keren, en kunnen een aanvullende weergave van een bindende interactie. Ten derde, deze methode kan de microfluïdische synthese van gerichte nanodeeltjes en onmiddellijke evaluatie van de binding eigenschappen. Dit belooft de efficiëntie te evalueren of screenen gericht nanoparticles verbeteren en tevens de hoeveelheid nanodeeltjes vereist verminderen. 13-15 vierde kan deze benadering de reactiekinetiek van bioorthogonal cycloadditiereacties meten realtime onder continue stroom. Ten slotte TCO / Tz immobilisatie chemie is robuust in aanwezigheid van serum. Samengevat, verwachten we dat deze veelzijdige benadering constructie van stabiele sensor oppervlakken uiteenlopende microfluïdische studies relevante in vitro en in vivo cellulaire toepassingen algemeen zal vergemakkelijken.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagens</td></tr><tr><td>Sensor Chip CM5</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1005-30</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Amine koppelingskit</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1000-50</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>GST opvangkit</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1002-23</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NAP-10 Kolommen</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0854-01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>GST, gevriesdroogd in 1X PBS</td><td>Genscript</td><td>Z02039</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>rhFKBP12</td><td>R&amp;D Systems</td><td>3777-FK</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Surfactant P-20</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1000-54</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Glycine 2.0</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1003-55</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Zeba spin ontzoutingskolom</td><td>Thermo</td><td>89882</td><td>7 K MWCO</td></tr><tr><td>Amicon Ultra 4</td><td>Fisher</td><td>UFC810096</td><td>100 K centrifugaalfilter</td></tr><tr><td>TCO-OH</td><td>Ref. 8</td><td></td><td>Gesynthetiseerd in-house</td></tr><tr><td>TCO-NHS</td><td>Ref. 8</td><td></td><td>Gesynthetiseerd in-house, *Commercieel verkrijgbaar bij Click Chemistry Tools # 1016-25</td></tr><tr><td>Tz-BnNH2</td><td>Ref. 8</td><td></td><td>Gesynthetiseerd in-house</td></tr><tr><td>Tz-NHS</td><td>Ref. 8</td><td>764701</td><td>Gesynthetiseerd in-house, *Commercieel verkrijgbaar bij Sigma Aldrich # 764701</td></tr><tr><td>NP-NH2 = CLIO-NH2</td><td>Ref. 8</td><td></td><td>Gesynthetiseerd in-house</td></tr><tr><td>AP1497, AP1497-Tz</td><td>Ref. 8</td><td></td><td>Gesynthetiseerd in-house</td></tr><tr><td colspan="4">Apparatuur</td></tr><tr><td>SPR Biosensor</td><td>GE Healthcare</td><td>Biacore T100</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

microfluïdische on-chip capture-cycloadditiereactie omkeerbaar immobiliseer small molecules of multi-component structuren voor biosensortoepassingen

Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaction to Reversibly Immobilize Small Molecules or Multi-component Structures for Biosensor Applications

Methodes voor snelle oppervlakte immobilisatie van bioactieve kleine moleculen met controle over de oriëntatie en immobilisatie dichtheid zijn zeer wenselijk voor biosensor en microarray toepassingen. In deze studie, gebruiken we een zeer efficiënte covalente bioorthogonal [4 +2] cycloadditie reactie tussen trans-cyclo (TCO) en 1,2,4,5-tetrazine (Tz) de microfluïdische immobilisatie van TCO / Tz-gederivatiseerde moleculen inschakelen . We volgen het in real time onder continue stroomomstandigheden behulp van oppervlakte-plasmon resonantie (SPR). Omkeerbare immobilisatie inschakelen en verlengen de experimentele bereik van het sensoroppervlak combineren we een niet-covalente antigeen-antilichaam koolstofafvangcomponent de cycloadditiereactie. Door afwisselend presenteren TCO of Tz groepen aan het sensoroppervlak, verschillende capture-cycloadditie processen nu mogelijk aan een sensoroppervlak voor on-chip montage en interactie studies van een groot aantal multi-component structuren. We illustrate deze methode met twee verschillende experimenten immobilisatie op een biosensor chip, een klein molecuul, dat AP1497-FK506 bindend eiwit 12 (FKBP12) bindt, en dezelfde kleine moleculen als deel van een geïmmobiliseerd en in situ gefunctionaliseerde nanodeeltjes.

Gegevens en cijfers zijn op basis van referentie 8. Efficiënte omkeerbare immobilisatie van biologisch werkzame kleine moleculen met controle over de oriëntatie en dichtheid speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van nieuwe biosensor toepassingen. De snelle bioorthogonal reactie tussen TCO en Tz beschrijven we een werkwijze voor de stapsgewijze assemblage en regeneratie van ligand oppervlakken met behoud van biologische activiteit. Figuur 2 toont de real-time monitori...

We presenteren een methode voor een snelle, omkeerbare immobilisatie van kleine moleculen en gefunctionaliseerde nanodeeltjes assemblages voor Surface Plasmon Resonance (SPR) studies, met behulp van sequentiële on-chip bioorthogonal cycloadditiereactie chemie en antilichaam-antigen capture.

Microfluïdische On-chip Capture-cycloadditiereactie omkeerbaar Immobiliseer Small Molecules of Multi-component Structuren voor biosensortoepassingen

Methods  for rapid surface immobilization of bioactive small molecules with control over  orientation and immobilization density are highly desirable for ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om een snelle en generaliseerbare strategie te demonstreren om kleine moleculen en gefunctionaliseerde nanodeeltjes reversibel te immobiliseren op het oppervlak van sensorchips. Dit wordt bereikt door eerst anti-GST-antilichamen op een sensoroppervlak te immobiliseren, gevolgd door de vangst van het GST-antigeen als tweede stap.Functionalisatie met trans-cyclocteen- of tetrazingroepen biedt een reactief oppervlak voor daaropvolgende cycloadditiereacties met kleine molecuul-tetrazinederivaten of nanodeeltjes-trans-cyclocteen-conjugaten, die vervolgens worden gefunctionaliseerd met kleine molecuul-tetrazinederivaten. Vervolgens kan het gefunctionaliseerde oppervlak worden gebruikt voor interactieanalyse met een gewenst gesolubiliseerd doelwit. In de laatste stap wordt het oppervlak geregenereerd, wat opeenvolgende capture-cycloadditiecycli mogelijk maakt. De resultaten van de binding op de chip tonen aan dat bio-orthogonale reacties het vermogen van geïmmobiliseerde kleine moleculen of in situ gefunctionaliseerde nanodeeltjes behouden om te interageren met het FKBP12-doelwit, en illustreren hoe deze aanpak het toepassingsbereik van SPR

microfluidic-on-chip-capture-cycloaddition-reaction-to-reversibly

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

In dit artikel beschrijven we hoe we krijgen FRET sporen van individuele DNA-moleculen geïmmobiliseerd op een oppervlak met behulp van een geautomatiseerde scanning confocale microscoop.

Geautomatiseerd systeem voor Single Molecule Fluorescentie metingen van Surface-geïmmobiliseerde biomoleculen

Druppel op basis van microfluïdische platforms zijn veelbelovende kandidaten voor high throughput experimenten, omdat zij in staat zijn om goedkoop te genereren picoliter, self-gecompartimenteerde schepen op kHz tarieven. Door integratie met snelle, gevoelige en een hoge resolutie fluorescentie spectroscopische methoden, kunnen de grote hoeveelheden informatie uit die in deze systemen efficiënt kunnen worden geëxtraheerd, aangewend en gebruikt.

Fluorescentie detectiemethoden voor microfluïdische druppel platforms

In dit artikel presenteren we een microfluïdische chip voor single cell analyse. Het maakt de kwantificering van intracellulaire eiwitten, enzymen, cofactoren, en tweede boodschappers via fluorescentie assays of immunoassays.

Een Microfluïdische Chip voor de Versatile chemische analyse van enkele cellen

Millifluidic apparaten worden gebruikt voor gecontroleerde synthese van nanomaterialen tijdsopgeloste analyse van reactiemechanismen als continu katalyse.

Millifluidics voor chemische synthese en Tijdopgeloste mechanistische studies

We presenteren een microfluidic gebaseerde elektrochemische biochip voor DNA hybridisatie detectie. Na ssDNA probe functionalisering, de specificiteit, gevoeligheid en detectielimiet bestudeerd met complementaire en niet complementaire ssDNA targets. De resultaten tonen de invloed van de DNA hybridisatie aan het elektrochemische systeem, met een detectielimiet van 3,8 nM.

A-Microfluidic gebaseerd Elektrochemische Biochip voor-Label vrij DNA hybridisatie-analyse

We presenteren een discrete druppel monster introductie voor inductief gekoppeld plasma massaspectrometrie (ICPMS). Het is gebaseerd op een goedkope en wegwerpbare microfluïdische chip die sterk monodisperse druppeltjes in een groottebereik van 40-60 pm bij frequenties van 90 tot 7000 Hz.

Een Microfluïdische Chip voor ICPMS Sample Inleiding

Hier beschrijven we de fabricage en werking van een dubbellaags microfluïdisch systeem gemaakt van polydimethylsiloxaan (PDMS). We tonen het potentieel van dit apparaat aan voor het vangen, richten van de coördinatieroute van een kristallijn moleculair materiaal en het controleren van chemische reacties op in chip gevangen structuren.

Microfluïdische Pneumatische Cages: een nieuwe benadering voor de In-chip Crystal Trapping, manipulatie en gecontroleerde chemische behandeling

We tonen een microfluïdische platform met een geïntegreerde oppervlakte-elektrode netwerk resistieve pulse sensing (RPS) met code division multiple access (CDMA) combineert, om detectie en afmeting van deeltjes in meerdere microkanalen multiplexen.

Microfluïdische Platform met multiplexverzending elektronische detectie voor ruimtelijke Tracking van Deeltjes

Een microfluidic biosensor platform is ontworpen en vervaardigd met behulp van goedkope droge film fotoresist technologie voor snelle en gevoelige kwantificering van verschillende analyten. Deze eenmalig gebruik-systeem zorgt voor de elektrochemische uitlezing van enzyme-linked tests aan-chip-geïmmobiliseerd door middel van de techniek van de stop-flow.

Droge Film elektrochemische Microfluidic Biosensor fotoresist gebaseerde Platform: Apparaat Fabrication, On-chip Assay voorbereiding en werking van het systeem

Microfluïdica is een krachtig hulpmiddel voor de ontwikkeling van diagnostische tests. Dure apparatuur en materialen, evenals bewerkelijke fabricage- en handlingtechnieken, zijn echter vaak vereist. Hier beschrijven we het fabricageprotocol van een acryl microfluïdisch apparaat voor magnetische micro- en nanodeeltjesgebaseerde immunoassays in een goedkope en eenvoudig te gebruiken omgeving.

Computer numerieke controle Micromilling van een microfluïdisch acrylapparaat met een gespreide beperking voor magnetische immunoassays op basis van nanodeeltjes

Dit artikel stelt een nieuwe generatie multiparametrische analytische platforms voor met een verhoogde doorvoer voor de karakterisering van extracellulaire vesikelsubsets. De methode is gebaseerd op een combinatie van multiplexed biosensing-methoden met metrologische en morfomechanische analyses door atomaire krachtmicroscopie, gekoppeld aan Raman-spectroscopie, om vesiculaire doelen te kwalificeren die vastzitten op een microarray-biochip.

Multimodaal analytisch platform op een multiplexed surface plasmon resonance imaging chip voor de analyse van extracellulaire vesikel subsets

Leer een microfluïdische on-chip capture-cycloadditiereactie om kleine moleculen en functionele nanopartikels reversibel te immobiliseren op sensorchips voor SPR-studies.

Microfluïdische On-chip Capture-cycloadditiereactie omkeerbaar Immobiliseer Small Molecules of Multi-component Structuren voor biosensortoepassingen (Video) | JoVE Journal

Microfluïdische On-chip Capture-cycloadditiereactie omkeerbaar Immobiliseer Small Molecules of Multi-component Structuren voor biosensortoepassingen

Meer video's verkennen