Name: Coculture systeem met een Organotypische Brain Slice en 3D Sferoïde van carcinomacellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-09T22:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Leer hoe u gliale interacties visualiseert tijdens cerebrale metastasevorming met behulp van organotypische hersenschijven en co-cultuur met carcinomacellen. Deze methode biedt een platform voor het bestuderen van tumorinvasie en celgedrag.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs danken Chalid Ghadban voor zijn uitstekende technische bijstand, Andreas Wodarz en Stephan Heermann voor hun technisch advies over de confocale en time-lapse microscopie. Er is geen belangenconflict voor een van de auteurs. Dit werk wordt gefinancierd door de Duitse Raad voor Onderzoek (DFG) in Project 2 van Forschergruppe 942 (FOR942 BI 703/3-1), door de Dres. Bayer-Stiftung (Baden Württembergischer Krebspreis, Duitsland) en door het Onderzoeksprogramma van de Faculteit der Geneeskunde, Georg-August-Universität Göttingen, Duitsland.

Dit nieuwe model is een aanpassing van een eerder gepubliceerde organotypic hippocampus hersenen slice aanpak 9-12. Wijzigingen en toevoegingen werden ingevoerd om de kankercel-hersenweefsel interacties optimaliseren en reproduceerbaarheid te garanderen. De studie werd beoordeeld en door de lokale ethische commissie goedgekeurd. Dieren werden zorgvuldig behandeld volgens de richtlijnen voor de verzorging van de dieren aan de Universiteit Geneeskunde Göttingen. De organotypische hersenen slice coculture kan worden onderverdeeld in twee stappen. Stap een is de bereiding van de organotypische slice hersenen. Stap twee bestaat uit de tumorcel voorbereiding en afzetting in de co-cultuur model. 1. Organotypische Brain Slice <ol><li> Bereid de dissectie medium bestaat uit minimaal essentieel medium (MEM) aangevuld met 0,2 mM glutamine, 100 U / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine en 4,5 mg / ml glucose. </li><li> Onthoofden de muizen uit elke muizenstam tussen postnatale dagzes en acht (P6-8). </li><li> Verwijder de hersenen snel van de schedel onder aseptische omstandigheden en overbrengen naar ijskoud dissectie medium. </li><li> Verwijder de frontale pool en de kleine hersenen van de hele sectie hersenen. </li><li> Bevestig en stabiliseren de hersenen op een podium met cryo lijm en 5% agarose. </li><li> Snijd de hersenen secties horizontaal naar een 350 micrometer dikte met behulp van een vibratome. </li><li> Verzamel 05:56 gehele hersenen segmenten van een muizenhersenen, afhankelijk van de soort en leeftijd. </li><li> Bereid het kweekmedium bestaande uit 50% MEM, 25% Hanks &#39;gebalanceerde zoutoplossing (HBSS), 25% normaal paardenserum (NHS), 0,2 mM glutamine, 100 U / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine (Sigma, München, Duitsland) en 4,5 mg / ml glucose. </li><li> Zet elke organotypische plakje hersenen op een 0,4 um polycarbonaat transwell membraan insert in een zes-well plaat met 1 ml kweekmedium in de onderste ook. </li><li> Cultuur organotypische hersenenplakken overnachting in een humidified atmosfeer met 5% CO2 bij 37 ° C incubator. </li></ol> 2. De Slice Coculture Model <ol><li> Embed 10 5 van GFP getransfecteerde tumorcellen of andere cellen (bijv. MCF-7-cellen GFP) in 20 pl gelmatrix, bestaande uit 15% RPMI-medium en 85% ECM gel. </li><li> Plaats de MCF-7-gelmatrix mengsel in een steriele metalen spacer (3,8 mm) direct naast het corticale gebied van de organotypische slice hersenen en incubeer gedurende 2 uur. </li><li> Verwijder de spacer en laat de 3D tumor sferoïde om Coculture de organotypische slice voor 24-96 uur. </li><li> Veranderen om de andere dag het kweekmedium. </li></ol> 3. Immunofluorescentiekleuring van Astrocytes en Microgliale in de Organotypische Brain Slice Coculture <ol><li> Bevestig de organotypische hersenen slice coculture met 4% paraformaldehyde gedurende 8 uur bij 4 ° C. </li><li> Was het segment co-cultuur met PBST (PBS met 0,5% Triton X-100) gedurende 5 minuten. </li><li> Blokkeer de samples normale geit serum in PBST (1:20) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. </li><li> Vlekken astrocytes door incuberen van de hersenen segment co-cultuur met anti-gliale fibrillaire zure proteïne monoklonaal antilichaam (GFAP, 1:200 in PBST) gedurende 36 uur bij 4 ° C gevolgd door geit anti-muis TRITC (1:100 in PBST) kleuring gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Was de monsters met PBST driemaal gedurende 5 minuten. </li><li> Vlekken de microgliale cellen met ILB 4-Alexa Fluor 647 (1:100 in PBST) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Tegenkleuring de hersenen segment co-cultuur met DAPI (1:1000) gedurende 3 min bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Mount en dekglaasje de hersenen slice coculture met DAKO fluorescerende montage medium. </li><li> Evalueer de graad van tumorinvasie basis van het volgende scoresysteem: 0 = geen van de cellen; + &lt;1/3; + + = 1/3 - 2/3, + + + ≥ 2/3 van de binnengedrongen cellen (eerste meet de lengte van de sectie contact tussen de tumor plug en slice, meet vervolgens de fracn contact detecteerbaar door de binnenvallende cellen). </li></ol> 4. Live-Imaging van de interactie tussen gliale cellen en tumorcellen <ol><li> Voer het experiment in het kader van een Leica omgekeerde DMI 6000B microscoop bij een vergroting van 10x lens en een Leica DFC 350 FX CCD-camera. </li></ol>

<ol><li>Langley, R. R., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+seed+and+soil+hypothesis+revisited--the+role+of+tumor-stroma+interactions+in+metastasis+to+different+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The seed and soil hypothesis revisited--the role of tumor-stroma interactions in metastasis to different organs.</a> Int. J. Cancer. 128, 2527-2535 (2011).</li>
<li>Joyce, J. A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of metastasis.</a> Nat. Rev. Cancer. 9, 239-252 (2009).</li>
<li>Mantovani, A., Allavena, P., Sica, A., Balkwill, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-related+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cancer-related inflammation.</a> Nature. 454, 436-444 (2008).</li>
<li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+organ+microenvironment+in+brain+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of the organ microenvironment in brain metastasis.</a> Semin. Cancer Biol. 21, 107-112 (2011).</li>
<li>Rath, B. H., Fair, J. M., Jamal, M., Camphausen, K., Tofilon, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+enhance+the+invasion+potential+of+glioblastoma+stem-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Astrocytes enhance the invasion potential of glioblastoma stem-like cells.</a> PloS one. 8, e54752(2013).</li>
<li>Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+metastasis%3A+mechanistic+insights+and+clinical+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges.</a> Nat. Med. 12, 895-904 (2006).</li>
<li>Eichler, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+brain+metastases-translation+to+new+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">The biology of brain metastases-translation to new therapies.</a> Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 344-356 (2011).</li>
<li>Winkler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+glioma+cell+invasion+in+vivo+reveals+mechanisms+of+dissemination+and+peritumoral+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Imaging glioma cell invasion in vivo reveals mechanisms of dissemination and peritumoral angiogenesis.</a> Glia. 57, 1306-1315 (2009).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Kreutz, S., Koch, M., Ghadban, C., Korf, H. W., Dehghani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoids+and+neuronal+damage%3A+differential+effects+of+THC%2C+AEA+and+2-AG+on+activated+microglial+cells+and+degenerating+neurons+in+excitotoxically+lesioned+rat+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cannabinoids and neuronal damage: differential effects of THC, AEA and 2-AG on activated microglial cells and degenerating neurons in excitotoxically lesioned rat organotypic hippocampal slice cultures.</a> Exp. Neurol. 203, 246-257 (2007).</li>
<li>De Simoni, A., Yu, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+organotypic+hippocampal+slice+cultures%3A+interface+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method.</a> Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).</li>
<li>Fuller, L., Dailey, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rodent+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of rodent hippocampal slice cultures.</a> CSH Protoc. 2007, pdb prot4848(2007).</li>
<li>Lorger, M., Felding-Habermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+changes+in+the+brain+microenvironment+during+initial+steps+of+breast+cancer+brain+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Capturing changes in the brain microenvironment during initial steps of breast cancer brain metastasis.</a> Am. J. Pathol. 176, 2958-2971 (2010).</li>
<li>Brana, C., Biggs, T. E., Mann, D. A., Sundstrom, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+macrophage+hippocampal+slice+co-culture+system%3A+application+to+the+study+of+HIV-induced+brain+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A macrophage hippocampal slice co-culture system: application to the study of HIV-induced brain damage.</a> J. Neurosci. Methods. 90, 7-11 (1999).</li>
<li>Kim, J. A., Yamada, M. K., Nishiyama, N., Matsuki, N., Ikegaya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mossy+fiber+pathfinding+in+multilayer+organotypic+cultures+of+rat+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Mossy fiber pathfinding in multilayer organotypic cultures of rat hippocampal slices.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 23, 115-119 (2003).</li>
<li>Matsumura, H., Ohnishi, T., Kanemura, Y., Maruno, M., Yoshimine, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+glioma+cell+invasion+by+confocal+laser+scanning+microscopy+in+a+novel+brain+slice+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of glioma cell invasion by confocal laser scanning microscopy in a novel brain slice model.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 269, 513-520 (2000).</li>
<li>Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">The brain tumor microenvironment.</a> Glia. , (2011).</li>
<li>Mizutani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fractalkine+receptor+but+not+CCR2+is+present+on+microglia+from+embryonic+development+throughout+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood.</a> J. Immunol. 188, 29-36 (2012).</li>
<li>Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Physiology of microglia.</a> Physiol. Rev. 91, 461-553 (2011).</li>
<li>Markovic, D. S., Glass, R., Synowitz, M., Rooijen, N., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+stimulate+the+invasiveness+of+glioma+cells+by+increasing+the+activity+of+metalloprotease-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropathol.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Microglia stimulate the invasiveness of glioma cells by increasing the activity of metalloprotease-2.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 754-762 (2005).</li>
<li>Baumert, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pathology-based+substrate+for+target+definition+in+radiosurgery+of+brain+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Radiat.+Oncol.+Biol.+Phys%22%5BJournal%5D)">A pathology-based substrate for target definition in radiosurgery of brain metastases.</a> Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 66, 187-194 (2006).</li>
<li>Palmieri, D., Chambers, A. F., Felding-Habermann, B., Huang, S., Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+metastasis+to+a+sanctuary+site%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The biology of metastasis to a sanctuary site.</a> Clin. Cancer Res. 13, 1656-1662 (2007).</li>
<li>Pukrop, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+promote+colonization+of+brain+tissue+by+breast+cancer+cells+in+a+Wnt-dependent+way%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia promote colonization of brain tissue by breast cancer cells in a Wnt-dependent way.</a> Glia. 58, 1477-1489 (2010).</li>
<li>Bos, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain.</a> Nature. 459, 1005-1009 (2009).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

Vorige histologische onderzoeken van cerebrale metastase aangetoond snelle en drastische veranderingen van de bewoner gliacellen, vooral van astrocyten en microglia 13. Om deze veranderingen en interacties met het carcinoom cellen te bestuderen, deze roman coculture systeem is zeer geschikt. Andere onderzoeksgebieden hebben al jarenlange ervaring met organotypische hippocampus hersenen plakjes. Een voordeel is dat de organotypische hippocampus hersenen slice culturen zijn levensvatbaar en effectief bewaard voor dagen tot weken, waardoor het geschikt is voor de lange termijn experimenten. Sinds Stoppini introductie van de organotypische hippocampus slice systeem 1991, is het op grote schaal gebruikt, bijvoorbeeld bij onderzoek degeneratieve ziekten. Zo, dit innoveren coculture systeem vertegenwoordigt een wijziging van een gevestigde aanpak met een scala aan toepassingen in de tumor biologie 9,11. De modificatie bood ons een reproduceerbaar model om de graad van de tumor invasie af te evaluerenterwards en culturen gekweekt door interfacemethode zijn uitermate geschikt voor experimenten die een driedimensionale structuur vereisen. Verschillende technieken zijn gebruikt om organotypische hippocampale plakken Coculture met andere cellen. Deze omvatten een indirect systeem van macrofaag-cellen en de organotypische hersenen slice 14 en een directe co-kweek van twee verschillende segmenten van de hippocampus gebied 15. Glioom aggregaten zijn ook gekweekt samen met hersencoupes 16. Deze modellen kunnen worden gebruikt voor het analyseren cellulaire en moleculaire gebeurtenissen in de hersenen plakjes maar direct, fysiologische contact tussen tumorcellen, microglia en het hersenparenchym niet mogelijk. Bovendien laat deze methode de observatie van microglia zonder verontreiniging van beenmerg afgeleide perifere monocyten / macrofagen. Het gebruik van CCR2 en CX3CR1 transgene muismodel kritisch verbetering vanwege het feit dat het moeilijk is om de resident microglia onderscheiden van invallende monocytenop basis van hun vergelijkbare woningen 17,18,19. Hoewel intracerebrale injectie van carcinoom cellen te onderzoeken van progressie van de tumor, het kan niet veel zeggen over de vraag of het omgeven macrofaag-achtige cellen afkomstig van de hersenen-resident microglia bevolking of van beenmerg afgeleide perifere monocyten / macrofagen 17. Het team van Kettenmann introduceerde een organotypische hersenen slice model dat betrokken inoculating glioma cellen in de hersenen plakjes met een micromanipulator 20. Echter, de primaire maligne gliomen verschillen in veel opzichten van metastatische carcinomen. Eerst maligne gliomen zijn van mesenchymale oorsprong, niet metastaseren buiten het zenuwstelsel en migreren / binnendringen als afzonderlijke cellen zonder grens tussen tumor en hersenweefsel. Daarentegen infiltratieve groei een typische pathologische kenmerk en dergelijke carcinomen meestal migreren / binnendringen als cohorten. Ten tweede, carcinomen vaak proberen epitheliale structuren bouwen in de hersenen, terwijl gliacellenproberen om de tumor te scheiden van het hersenweefsel door een (pseudo) capsule. Rekening houdend met biologische en morfologische kenmerken, maligne glioom en metastase van carcinomen zijn niet echt vergelijkbaar. Daarom hebben we gemodificeerd en ontwikkelde een gemengde cultuursysteem waar we niet injecteren maar coculture een carcinoom cel plug naast de hersenen slice. Verder zagen we microglia en astrocytaire accumulatie aan de rand van de tumor stekker, wat betekent dat microglia voer de tumor plug en kan gemakkelijk worden gedetecteerd door helder veld microscopie en later bevestigd door de confocale microscopie. De kankercellen binnen te dringen in de hersenen snede, vergelijkbaar met de werkelijke in vivo situatie en een opmerking van Baumert en collega&#39;s, die een infiltratiezone gevonden in 63% van de autopsie gevallen hersenmetastasen 21. Door de ontbrekende bloedperfusie, er slechts inwoner macrofagen / microglia in deze cultuur. Bovendien, vanwege de mIssing T-cellen en derhalve afwezig allo-reactiviteit, humane carcinoomcellen kunnen worden gebruikt voor co-cultuur zelfs hersenenplakken van immuuncompetente muizen of ratten (NMRI, B6 of Wistar). Dit zou kunnen dienen als alternatief voor de naakt muismodel. Aangezien 04:56 segmenten kunnen worden verkregen bij elke muis, aanzienlijk verminderd aantal benodigde dieren, in vergelijking met de bestaande modellen injectie. Daarnaast hebben de dieren niet lijden voor een lange periode van gemetastaseerde ziekte en ze niet operatieve procedures herhaaldelijk 22 ondergaan. Met deze gemengde cultuursysteem, hebben we de activering van microglia door kankercellen en bevorderen het vermogen van de kankercel invasie aangetoond. Bovendien is dit de eerste keer, voorzover ons bekend, microglia werden gevonden actief transport carcinoomcellen 23. Ondanks al deze voordelen, het gemengde cultuursysteem is inderdaad ook beperkingen. Het is nog een in vitromodelleren missen van de stappen van metastasering voorafgaand aan kolonisatie. Vanwege het gebrek aan perfusie, is het niet mogelijk om de extravasatie bestuderen. Dus een alternatieve manier om de extravasatie studie is om ofwel de in vivo injectie model of de gemodificeerde Boyden kamer systeem met extracellulaire matrix, HUVEC en astrocyten om de bloed-hersenbarrière 22,24 bootsen. De hersenen slice coculture werkwijze nog een betrouwbaar en reproduceerbaar model met vele voordelen en het potentieel voor een groot aantal toepassingen, zoals analyse van kolonisatie, met name met nadruk op de rol van de bewoner cellen. De combinatie met andere gevestigde technieken (zoals immunohistochemie, confocale microscopie en time-lapse microscopie) achter het onderzoek van directe cel-cel interacties. Het is een eenvoudig alternatief en aanvulling van andere technieken en biedt toegang tot het onderzoeksdossier van de signalen en effecten zoals opgelegd door de metastatische micromilieu.

<table><tbody><tr><td>Hank&#039;s balanced salt solution (HBSS)</td><td>Gibco, Darmstadt,Germany</td><td>24020</td><td></td></tr><tr><td>Minimum essential medium (MEM)</td><td>Gibco, Darmstadt, Germany</td><td>32360</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>PAA Laboratories Inc., C&ouml;lbe, Germany</td><td>E15-840</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Pan Biotech, Aidenbach, Germany</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>Normal horse serum (NHS)</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum (FCS)</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td><td>10091148</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>B. Braum, Melsungen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine-Penicillin-Streptomycin solution</td><td>Sigma, Steinheim, Germany</td><td>G1146</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica, Wetzlar, Germany</td><td>Leica VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica, Wetzlar, Germany</td><td>Leica SM 2000R</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonate membrane</td><td>BD Falcon, Heidelberg,Germany</td><td>353090</td><td>transwell membrane insert (0.4 &mu;m pore size)</td></tr><tr><td>ECM gel</td><td>Trevigen, R&amp;D, Wiesbaden-Nordenstadt, Germany</td><td>3432-005-01</td><td>Basement membrane extract</td></tr><tr><td>Metallic spacer</td><td>Kig GmbG, Kirkel, Germany</td><td>DIN 433</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Zeiss, G&ouml;ttingen, Germany</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>Time-lapse microscope and camera</td><td>Leica, Wetzlar, Germany</td><td>DMI 6000B microscope and a DFC 350 FX CCD camera</td><td></td></tr><tr><td>Anatomy microscope</td><td>Zeiss, G&ouml;ttingen, Germany</td><td>Stemi SV11</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>1.04005.1000</td><td></td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) antibody</td><td>Sigma, Steinheim, Germany</td><td>G3893</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG, F(ab&#039;)2- TRITC</td><td>Santa Cruz, Heidelberg, Germany</td><td>SC3796</td><td></td></tr><tr><td>Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 conjugate</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td><td>132450</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6&#039;-diamidino-2-phenylindole dihyfrochloride)</td><td>Sigma, Steinheim, Germany</td><td>D8417</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent mounting medium</td><td>DAKO, Glostrup, Denmark</td><td>S3023</td><td></td></tr></tbody></table>

coculture systeem met een organotypische brain slice en 3d sferoïde van carcinomacellen

Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

Patiënten met cerebrale metastasen van carcinomen hebben een slechte prognose. Echter, het proces van de metastatische site is nauwelijks onderzocht, met name de rol van de bewoner (stromale cellen). Studies primaire carcinomen tonen de invloed van het micromilieu op metastase, zelfs prognose 1,2. Vooral de tumor-geassocieerde macrofagen (TAM) ondersteuning migratie, invasie en proliferatie 3. Interessant is dat de belangrijkste doelplaatsen van metastase bezitten weefselspecifieke macrofagen, zoals Kupffer-cellen in de lever of microglia in het CZS. Bovendien is de metastasen bezitten ook andere weefsel-specifieke cellen, zoals astrocyten. Recentelijk werd aangetoond dat astrocyten proliferatie en persistentie van kankercellen 4,5 bevorderen. Daarom functies van deze weefselspecifieke celtypes lijken erg belangrijk in het proces van hersenmetastasen 6,7. Ondanks deze opmerkingen,Echter, tot nu toe is er geen geschikte in vivo / in vitro model beschikbaar voor gliale reacties direct te visualiseren tijdens cerebrale metastase vorming, in het bijzonder door helder veld microscopie. Recente in vivo live-beeldvorming van carcinoom cellen toonden hun cerebrale kolonisatie gedrag 8. Deze werkwijze is zeer arbeidsintensief, kostbaar en technisch ingewikkeld. Bovendien zijn dit soort dierproeven beperkt tot kleine series en hebben een aanzienlijke stress bij de dieren (door implantatie van de glasplaat, injectie van tumorcellen, herhaalde anesthesie en langdurige fixatie). Verder wordt in vivo tot nu toe beperkt tot visualisatie van de carcinoomcellen, terwijl interacties met interne cellen nog niet zijn weergegeven. Tenslotte onderzoeken van menselijke carcinoom cellen in immunocompetente dieren zijn onmogelijk 8. Om deze redenen hebben we een gemengde cultuursysteem consisteek van een organotypische muizenhersenen slice en epitheliale cellen ingebed in matrigel (3D cel bol). De 3D carcinoomcellijn bolletjes werden direct naast de hersenen slice rand geplaatst om de invasie van de aangrenzende hersenweefsel te onderzoeken. Dit stelt ons in staat om morfologische veranderingen en interacties tussen de gliacellen en carcinoom cellen met behulp van fluorescentie en zelfs door helder veld microscopie visualiseren. Na de co-cultuur experiment, kan het hersenweefsel of 3D cel sferoïden worden verzameld en voor verdere moleculaire analyses (bijv. qRT-PCR, IHC of immunoblot) en voor onderzoek door confocale microscopie. Deze methode kan worden toegepast op de gebeurtenissen in een levend hersenweefsel dagen volgen zonder schadelijke effecten op de hersenen plakjes. Het model maakt het ook mogelijk de selectieve onderdrukking en vervanging van de ingezeten cellen door cellen van een donor weefsel aan de duidelijke invloed van een bepaald genotype te bepalen. Tenslotte, de co-cultuur model een bruikbaar alternatiefDe in vivo benaderingen bij het ​​testen gerichte farmacologische manipulaties.

Eerst worden alle gebruikte carcinoom cellen (humaan: MCF-7 en muizen: 410,4) vielen de organotypische muis hersenen slice. De invasie werd derhalve species-onafhankelijke (figuur 1A), die een breed scala van toepassingen in een soort-onafhankelijke wijze aangeeft. Bovendien, microglia en astrocyten gecumuleerde interface eerder beschreven in vivo en in patiëntenmonsters 13. Time-lapse imaging over een langere periode niet alleen bleek de levensvatbaarheid van de snede, maar bood ook een goed platform om de cellulaire interacties te observeren. Door tijdsverloop experimenten werden microgliacellen opgenomen 3D cel bol tijdens invoeren beurt kankercellen vielen ook de hersenen slice (Figuren 1B1-B2). Bovendien hebben we eerder aangetoond dat het vermogen van microglia aan carcinoomcellen vervoer door een nog raadselachtige mechanisme zo helpen bij het carcinoom invasie. Met immunofluorescentie labeling technieken, webeschreven co-lokalisatie van tumorcellen en stromale cellen (bijvoorbeeld microglia en astrocyten), zowel in het hersenweefsel en de tumorcel stekker (figuren 1C-D), suggereert een nauwe interactie tussen deze cellen tijdens de invasie proces. Vergelijkbare resultaten werden verkregen wanneer de muis hersenen plakjes werden gekweekt samen ofwel met menselijke (figuren 1C1-C3) of muizen (figuren 1D1-D3) carcinoom cellen - met de brede waaier van toepassingen voor het bestuderen van cellen van verschillende soorten, genotypes en stammen. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/50881/50881fig1.jpg" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50881/50881fig1highres.jpg" /> Figuur 1. Hersenen slice coculture model met een 3D spheroïde van muis en mens carcinoom cellen. A) Kwantificering van kankercel invasie in organotypische hele hersenen slice cocultures met een muis borstkankercellijn 410,4 of een menselijke borstkanker cellijn MCF-7. De gegevens geven het percentage van de mate van invasie in de hersenen segment in elke groep n ≥ 38. Er was geen significant verschil tussen deze twee groepen (Kruskal-Wallis test). B) Time-lapse beelden van organotypische hele brein slice cocultures met MCF-7-cellen GFP en representatieve beelden van day2 (B1) en dag 5 (B2) waren weergegeven. CD) Confocale microscopie toonde beelden cohorten van carcinomen, astrocyten en microglia. Dubbele kleuring van astrocyten (anti-GFAP-TRITC, rood) en microglia (ILB4-Alexa Fluor 647, violet) van het gehele co-cultuur met de 350 micrometer dikke organotypic hersenen slice en het GFP-getransfecteerde tumorcel stekker (groen): 3D- MCF-7-GFP (C1-C3) en 3D-410.4-GFP (D1-D3). Witte streepjes toonde de rand van de hersenen slice en de tumor invasie front. Schaalbalken vertegenwoordigen 50 micrometer. Microglia, astrocyten eennd tumoren colocalizations (C1 en D1), astrocyten-tumoren colocalizations (C2 en D2) en microglia-tumor colocalizations (C3 en D3) in het segment coculture. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50881/50881fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a>

Het organotypische co-kweek met hersenplakjes carcinoomcellen kunnen visualiseren morfologische veranderingen van fluorescentie en helderveld (video) microscopie gedurende het proces van cel carcinoom invasie van hersenweefsel. Dit model systeem maakt het ook mogelijk voor mobiele uitwisseling en replenishment benaderingen en biedt een breed scala van manipulaties en analyses.

Coculture systeem met een Organotypische Brain Slice en 3D Sferoïde van carcinomacellen

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in ...

Het algemene doel van deze procedure is om gliale interacties direct te visualiseren tijdens de vorming van cerebrale metastase. Dit wordt bereikt door eerst organotypische herfsneden uit muizen te bereiden. Vervolgens worden de organotypische herfsneden co-gecultiveerd met carcinoomcellen.Vervolgens worden stromale cellen fluorescerend gekleurd met specifieke markers. Ten slotte wordt de mate van tumorinvasie geëvalueerd met een fluorescerende microscoop. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de interactie tussen glia en kankercellen en colocaliserende interacties laten zien door middel van immunofluorescentielabeling en time-lapse of confocale microscopie.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals de intracerebrale injectie van carcinoomcellen, is dat deze methode een eenvoudige alternatief is en een goed platform biedt om cellulaire interacties tijdens tumorprogressie te observeren. De implicaties van deze techniek zijn gericht op de ontdekking van een nieuwe en selectieve therapie voor kankerbehandeling. Omdat traumacellen een belangrijke rol spelen bij metastase en ook potentiële doelwitten zijn voor kankertherapie, zal het demonstreren van de techniek door Eugenia, een postdoc van mijn laboratorium, plaatsvinden. Voorafgaand aan de chirurgische procedure, bereid het dissectiemedium voor dat bestaat uit minimaal essentieel medium, aangevuld met 0,2 millimolair glutamine, 100 milligram per milliliter streptomycine en 4,5 milligram per milliliter glucose na het onthoofden van muizen van elke muisstam tussen postnatale dag zes en acht.Verwijder onder aseptische omstandigheden snel de hersenen uit de schedel en breng deze over in het dissectiemedium. Verwijder de frontale pool en het cerebellum uit de hersenen. Gebruik vervolgens cryo-lijm en 5% agros om de resterende hersenweefsels, bestaande uit het grote brein, te fixeren en te stabiliseren.Snijd op een Vibram-schijf, 350 micrometer dikke secties, afhankelijk van de soort en leeftijd van de muis, vier tot zes hele herfsneden van een enkele hersenen. Na het bereiden van het kweekmedium volgens het tekstprotocol, voegt u een milliliter toe aan elk onderste wel van een zes-wel transwell-plaat. Plaats vervolgens elke organotypische herfsnede op een 0,4 micron polycarbonaat transwell-membraan en plaats deze in de putjes van de plaat.Incubeer de schijven een nacht in een bevochtigde atmosfeer met 5% koolstofdioxide en 37 graden Celsius. De volgende dag bedden 10 tot de vijfde GFP-getransfecteerde tumor- of andere cellen in 20 microliters gelmatrix bestaande uit 15% RPMI-medium en 85% ECM-gel. Plaats de MCF zeven gelmatrixmix in steriele metalen ruimtemakers direct naast de corticale regio's van de organotypische herfsneden en incubeer gedurende twee uur. Na de incubatie, verwijdert u de ruimtemakers en laat u de 3D-tumor PHE gedurende 24 tot 96 uur met de herfsneden incuberen.Vervang het kweekmedium om de dag indien gewenst. Voer live beeldvorming uit met behulp van time-lapse microscopie met 10 x vergroting om de herfsnede co-culturen te kleuren. Fixeer ze met 4% paraformaldehyde gedurende acht uur bij vier graden Celsius voordat u de monsters in PBST gedurende vijf minuten wast.Gebruik vervolgens normaal geitenserum in PBST bij kamertemperatuur gedurende één uur om de monsters te blokkeren. Kleur vervolgens de astrocyten door de co-culturen gedurende 36 uur bij vier graden Celsius te incuberen met anti-gliaal fibrillair zuur eiwit of GFAP monoklonaal antilichaam, gevolgd door geiten-anti-muiskleuring gedurende één uur bij kamertemperatuur. Na het wassen van de monsters met PBST drie keer gedurende vijf minuten, kleurt u de microgliacellen met I LB vier LOR 647 gedurende één uur bij kamertemperatuur voordat u contrakleurt met DPI gedurende drie minuten bij kamertemperatuur.Nadat u een fluorescerend montagemedium hebt gebruikt om de co-cultuurmonsters te monteren, beeldt u de monsters af met behulp van een fluorescerende microscoop met 25 x vergroting. Evalueer tenslotte de mate van tumorinvasie op basis van het volgende scoresysteem. Dat meet eerst de lengte van het contactgedeelte tussen de tumorplug en de snede en vervolgens het aandeel contact dat detecteerbaar is door de invasieve cellen.Zoals hier getoond, hebben alle geteste carcinoomcellijnen organotypische muizenherfsneden geïnfiltreerd, wat suggereert dat het invasieproces soortsonafhankelijk was. Deze film toont een time-lapse opname van directe glia-tumorcelinteracties. Stromacellen werden waargenomen die het tumorbevattende celplug binnendrongen en met de kankercellen interageerden.Time-lapse beeldvorming over een langere periode bevestigde de levensvatbaarheid van de herfsneden en maakte de visualisatie mogelijk van microgliacellen die de driedimensionale bol binnenkwamen, evenals kankercellen die de herfsneden binnendrongen. Bovendien, zoals we eerder hebben aangetoond, transporteren microglia kankercellen via een nog steeds raadselachtig mechanisme en assisteren bij de kankerinvasie met behulp van immunofluorescentielabeling. We hebben de colocaliserende interactie van tumor- en stromale cellen aangetoond, zowel in hersenweefsel als in tumorcelpluggen, wat een nauwkeurige interactie tussen deze cellen suggereert tijdens het invasieproces.Zoals hier te zien is, werden vergelijkbare resultaten verkregen toen muizenherfsneden werden co-gecultiveerd met menselijke of urinekankercellen, wat de brede toepassingen ondersteunt voor het bestuderen van cellen van verschillende soorten, genotypen en stammen. Deze techniek heeft de weg geëffend voor onderzoekers op het gebied van kankermetastase om de impact van de micro-omgeving tijdens tumorkolonisatie op afgelegen locaties te verkennen. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u GL-kankercelreacties kunt visualiseren tijdens de vorming van hersenmetastase in een direct fysiologisch contactsysteem.

coculture-system-with-an-organotypic-brain-slice-3d-spheroid

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

This video demonstrates the development of a 3D co-culture system. Mouse brain slices are placed on a membrane, and fluorescently labeled human brain tumor cells are allowed to grow on it. Once the system is ready, it is stained for imaging.

Establishing a Brain Tumor in an Organotypic Slice Co-culture Model

The video demonstrates the generation and maintenance of organotypic slice cultures from glioblastoma tissue. The isolated tissue is embedded in an agarose matrix, and thin sections are obtained using a vibratome. These sections are then placed on permeable membrane inserts within a microplate and cultured in a slice culture maintenance media for long-term maintenance.

Generating and Maintaining Slice Cultures from Human Glioblastoma Tissue

This video describes the preparation and cultivation of brain tumor organoids from single-cell suspension. Using a laminin-rich extracellular matrix as a scaffold and culture media for nutrients, cells are facilitated to multiply and self-organize within the organoid. Consequently, ex vivo organoids are generated, mimicking cellular diversity and the microenvironment of brain tumors.

Generating an Organoid Culture from a Brain Tumor Cell Suspension

Invasie van omliggende normale weefsels is een typerend kenmerk van kwaadaardige tumoren. We bieden hier een eenvoudige, semi-geautomatiseerde microplaattest van invasie in een natuurlijke 3D biomatrix die met een aantal modellen van gevorderde menselijke kankers is geëxemplifeerd.

Driedimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Veel typen menselijke hersentumoren zijn gelokaliseerd in specifieke gebieden in de hersenen en zijn moeilijk te laten groeien in cultuur. Dit protocol behandelt de rol van de tumormicro-omgeving en onderzoekt nieuwe medicamenteuze behandelingen door fluorescerende primaire hersentumorcellen te analyseren die groeien in een organotypische muizenhersensnede.

Een hersentumor / organotypische Slice Co-cultuur voor het bestuderen tumor micro en Gerichte Drug therapieën

Huidige ex vivo modellen van glioblastoom (GBM) zijn niet geoptimaliseerd voor fysiologisch relevant onderzoek naar menselijke tumorinval. Hier presenteren we een protocol voor het genereren en onderhouden van organotypische plakculturen uit vers menselijk GBM-weefsel. Een beschrijving van time-lapse microscopie en kwantitatieve cel migratie analyse technieken wordt verschaft.

Een humane glioblastoom organotypische snijcultuurmodel voor de studie van tumorcellenmigratie en patiëntspecifieke effecten van anti-invasieve medicijnen

Organotypic hippocampal segment culturen (OHSC) vormen een in vitro model dat de in vivo situatie heel goed simuleert. Hier beschrijven we een op vibratome gebaseerde verbeterd snijden protocol om te verkrijgen van hoge kwaliteit segmenten voor gebruik bij de beoordeling van het neuroprotectieve potentieel van nieuwe stoffen of het biologisch gedrag van de tumorcellen.

Organotypic Hippocampal Slice culturen als een Model voor de studie neuroprotectie en invasiviteit van tumorcellen

Hier beschrijven we een gebruiksvriendelijke invasietest voor glioblastoom. Deze test is geschikt voor glioblastoom stamcellen-achtige cellen. Een Fiji macro voor eenvoudige kwantificering van invasie, migratie en proliferatie wordt ook beschreven.

Een 3D Spheroid Model voor Glioblastoom

Uitgebreide in vitro modellen die de relevante menselijke ziekte getrouw samenvatten, ontbreken. De huidige studie presenteert driedimensionale (3D) tumor sferoïde creatie en cultuur, een betrouwbaar in vitro hulpmiddel om de tumor-stromale interactie in humaan hepatocellulair carcinoom te bestuderen.

Een driedimensionaal sferoïde model om de tumor-stromale interactie bij hepatocellulair carcinoom te onderzoeken

Kuikenembryo's worden gebruikt voor het bestuderen van menselijke glioblastoom (GBM) hersentumoren in ovo en in ex vivo hersenschijfcoculturen. GBM-celgedrag kan worden geregistreerd door time-lapse-microscopie in ex vivo co-culturen en beide preparaten kunnen op het experimentele eindpunt worden geanalyseerd door gedetailleerde 3D-confocale analyse.

Het kuikenembryobrein gebruiken als model voor in vivo en ex vivo analyses van menselijk glioblastoomcelgedrag

Er is een kritieke behoefte aan 3D-kankermodellen die heterocellulaire overspraak vastleggen om kankermetastasen te bestuderen. Onze studie presenteert de generatie van heteromulticellulair stromaal-epitheel in een steiger- en steigervrije omgeving die kan worden gebruikt om invasie en cellulaire ruimtelijke verdelingen te bestuderen.

Heteromulticellulaire stromale cellen in steigervrije 3D-culturen van epitheelkankercellen om invasie te stimuleren

Leer hoe u gliale interacties visualiseert tijdens cerebrale metastasevorming met behulp van organotypische hersenschijven en co-cultuur met carcinomacellen. Deze methode biedt een platform voor het bestuderen van tumorinvasie en celgedrag.

Coculture systeem met een Organotypische Brain Slice en 3D Sferoïde van carcinomacellen

Meer video's verkennen