Name: Productie van Apolipoprotein C-III Knockout Konijnen behulp Zinc Finger Nucleasen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-18T21:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Leer hoe u Apolipoprotein C-III knockout-konijnen produceert met behulp van Zinc Finger Nucleases voor cardiovasculair onderzoek. Deze methode maakt efficiënte genetische modificatie in grote diermodellen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd deels gefinancierd door subsidies van de National Institutes of Health (HL105114, HL088391, NS066652 en HL068878 te YEC), de American Heart Association (Nationale Scientist Development 0835237N om JZ). YEC wordt financieel ondersteund als begiftigd Frederick Huetwell hoogleraar Cardiovasculaire Geneeskunde aan de Universiteit van Michigan Medical Center (UMMC). Dit werk gebruikt Core Services ondersteund door Center for Advanced Models for Translational Sciences and Therapeutics (CAMTraST) bij UMMC.

Alle onderhoud dier, zorg en het gebruik procedures werden beoordeeld en door de Universitaire Commissie goedgekeurd op het gebruik en onderhoud van Dieren van de Universiteit van Michigan. 1. ZFN Ontwerp en Selectie <ol><li> Voorzie de genomische sequentie-informatie van het gen van belang (bijvoorbeeld konijn apoCIII) aan de fabrikant. Selecteer ZFN set (s) voor de experimenten op basis van de ZFN scores. </li></ol> 2. Konijn Embryo Collection <ol><li> Superovuleren seksueel volwassen (6-18) New Zealand White (NZW) vrouwelijke konijnen door subcutane (sc) injectie van FSH tweemaal / dag met een dosering van 3 mg voor de eerste twee injecties, 5 mg gedurende de volgende twee injecties en 6 mg voor de laatste twee injecties. </li><li> Dien een enkele intraveneuze (iv) injectie van 200 IE hCG op 72 uur na de eerste injectie FSH om ovulatie te induceren. Mate de gesuperovuleerde vrouwen met een mannelijk konijn onmiddellijk na de hCG-injectie. </li><li> EuthaniZE de gesuperovuleerde donor konijnen met natrium pentobarbital (150 mg / kg, iv) op 16-18 uur na inseminatie (psi). </li><li> Herstellen van de eileider ampullen door zorgvuldig verzamelen van de hele eileiders en eierstokken structuur. </li><li> Spoel elke eileider met 10 ml medium manipulatie HEPES gebufferde TCM 199 aangevuld met 10% foetaal runderserum, door het injecteren van het medium uit de baarmoeder uiteinde van de eileider. Verzamel de gespoelde medium bij de eierstok-eindopening van de eileider een petrischaal. </li><li> Observeer en identificeren teruggewonnen embryo&#39;s in het medium gespoeld, was de embryo driemaal de manipulatie medium bewaar ze manipuleren medium bij 38,5 ° C in lucht, en neem ze onder een stereomicroscoop voor het optreden van bevruchting. Bereid je voor micro-injectie op pronucleaire podium embryo 19-21 h psi </li></ol> 3. Bereiding van mRNA ZFN <ol><li> Zuiver het resulterende mRNA voordat hersuspensie in RNAse-vrij 0.1X TE (1 mM Tris-Cl pH8,0, 0,1 mM EDTA). Meet de concentratie en bewaar het mRNA bij -80 ° C tot gebruik. </li><li> Bereid de mRNAs coderend ZFN paar (4-10 ng / ul in 1 mMTris-Cl, 0,1 mM EDTA bij pH 7,5), 10 pi aliquot in flesjes. Bewaar ze bij -80 º C tot klaar voor gebruik. Voordat micro-injectie, ontdooien de RNA flacon (s), en houd het op ijs. </li></ol> 4. Embryo Microinjection <ol><li> Bereid de micro-injectie platform door het plaatsen van een 5 ul druppel manipulatie medium op een 1-well kamer dia waarop de media kamer verwijderd heeft. Bedek het medium druppel met minerale olie en leg ze op de verwarmde microscoop podium. </li><li> Plaats die pipet (120 micrometer diameter) in de houder arm van de micromanipulator en plaats het in de daling van manipulatie medium. </li><li> Fabriceren injectie micropipetten door verhitting en trekken borosilicaatglas capillaire buizen in een micropipet trekker apparaat. Plaats het mRNA te injecteren in de injectiepipet. </li><li>Schakel de persluchttoevoer die aangesloten is op een microinjector. </li><li> Plaats injectie pipet in de injectie houder, zet het op de micromanipulator en plaats deze in de daling van manipulatie medium. </li><li> Stel de microinjector met de volgende voorgestelde parameters: holdP = 2 psi, InjP = 20 psi, ClearP = 60 psi, Injtime = 1 seconde, wat resulteert in een injectievolume van 1-5 pl. </li><li> Open de punt van de injectie pipet door zachtjes tikken tegen het bedrijf pipet. </li><li> Transfer embryo (30-50) naar de micromanipulatie druppel op het platform. Gebruik het bedrijf pipet om een ​​embryo lijnt de injectienaald, embryo en het aandelenbezit pipet langs de x-as. </li><li> Onder 400X vergroting, vooraf de injectie pipet door het embryo. Wees voorzichtig om de kern te voorkomen. Zodra het plasmamembraan wordt doorboord, drukt voetpedaal te injecteren. Na injectie, trekken de naald, laat het embryo. Herhaal dit proces voor alle overige embryos. </li><li> Was geïnjecteerde embryo driemaal embryo kweekmedium, bestaande uit Earle&#39;s Balanced Salt Solution (EBSS), aangevuld met essentiële aminozuren (NEAA), essentiële aminozuren (EAA), 1 mM L-glutamine, 0,4 mM natriumpyruvaat en 10% FBS. </li><li> Incubeer embryo bij 38,5 ° C in 5% CO2 in lucht gedurende 1-2 uur voordat ze chirurgisch overgebracht naar de eileiders van een gesynchroniseerde ontvangende vrouwelijke NZW konijnen (zie stap 5.1). Als alternatief, de cultuur van de embryo&#39;s tot ze blastocyststadium bereiken voordat ze worden gebruikt voor in vitro validatie of assays. </li></ol> 5. Embryo Transfer <ol><li> Selecteer een vrouwelijke NZW konijn 5-12 maanden oud, in goede gezondheid, met een gewicht van ca.. 4,0-5,0 kg als ontvanger dier. Dien Gonadotropin Releasing Hormone (GnRH) injectie intramusculair (im, 50 mcg / ml, 0,3 ml / dier) aan de ontvanger op hetzelfde tijdstip met die van hCG injectie aan het donordier (en) (zie stap 2.2). </li&gt; <li> Na voltooiing van micro-injectie, bereiden de ontvanger konijn voor embryotransplantatie (normaal 16-24 uur na GnRH-injectie). Verdoven van het konijn met 10-40 mg / kg ketamine (im), en / of verdampte isofluraan (2-4%) bij inademing. Bescherm de ogen van het konijn uitdrogen door de toepassing van een steriele oogzalf. Observeer het dier totdat het volledig onbewust, dwz. reageert niet op pedaal reflexen, knijpen de voet pad wordt gebruikt om te controleren bij gebrek aan pedaal reflex die een indicatie van geschikte anesthesie. </li><li> Scheer de buik van het konijn, wassen met een antiseptische scrub, gevolgd door antiseptische oplossing, en veeg het geschoren gebied met een steriel gaasje sponzen. </li><li> Voer operatie onder steriele omstandigheden opnemen vitale functies van de ontvanger konijn ongeveer elke 15 minuten gedurende de operatie. </li><li> Overdracht 10-25 embryo een ontvanger dier, afhankelijk van het beschikbare aantal embryo. </li><li> Aan het einde van dechirurgische procedures, sluit de spierlaag met gecoate absorbeerbare hechtdraad. Hecht de huid met ofwel een subcuticulaire hechtdraad behulp absorbeerbare hechtdraad of met eenvoudige onderbroken huid hechtingen gebruik nonabsorable hechtdraad (bijv. monofilament nylon of iets dergelijks). </li><li> Houd het dier warm en bewaken totdat zijn borstligging wordt bereikt. </li><li> Monitor het dier dagelijks. Volg de instructies dierenarts voor de verzorging van het dier. Pijnstiller injecteren (sc 1,0 mg / kg) om pijn te verlichten en / of te verminderen koorts dagelijks na de operatie als door de dierenarts noodzakelijk bepaald. </li><li> Verwijder nonabsorable huid hechtingen op ongeveer 10-14 dagen na de operatie. </li></ol> 6. Detectie van ZFN Induced genverstoring <ol><li> Voor in vitro validatie uitvoeren genotypering op de in vitro gekweekte embryo&#39;s. Lyse individuele embryo&#39;s die ontwikkeld morula / blastocyst Stadium 5 pl NP40 oplossing (1% NP40 plus 1 ug / ml proteïnase K in Taq Buffer) Gedurende 0,5-1 uur bij 55 ° C en 10 min bij 95 ° C. </li><li> Voor genotypering van de nakomelingen, het verzamelen van oor huid monsters van pasgeboren kits, extract genomische DNA, en ze gebruiken als voor de PCR sequencing. Solliciteer Kwik-Stop om de bemonstering gebied na inzameling te stoppen met bloeden en ongemak te verminderen. </li><li> Gebruik de lysis van stap 6.2 of 6.3 als matrijs voor PCR met LA-Taq en PCR-primerpaar, die stroomopwaarts zijn gelegen (5&#39;-TGAGGCCGGGAAGGGAGCAGTCG-3 &#39;) en stroomafwaarts (5&#39;-GCCAGGCCCACCCACGGAACAGC-3&#39;) van de ZFN doelplaats . </li><li> Zuiver PCR producten en sequentie hen sequencing primer (5&#39;-TCTGCACGCTTGGGGCTGGAG-3 &#39;). </li><li> Identificeer mutant monsters door te zoeken naar dubbele bocht in de sequence diagram rond de targeting terrein. Label de degenen met dubbele bochten als &quot;positief&quot;. </li><li> Kloon de &quot;positieve&quot; PCR-producten in TA kloneervector, pick-up 10-20 klonen, volgorde van de inserts, en bevestig de mutaties rond de targeting website. </li></ol>

<ol><li>Ooi, E. M., Barrett, P. H., Chan, D. C., Watts, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+C-III%3A+understanding+an+emerging+cardiovascular+risk+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Science%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein C-III: understanding an emerging cardiovascular risk factor.</a> Clinical Science. 114, 611-624 (2008).</li>
<li>Pollin, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+null+mutation+in+human+APOC3+confers+a+favorable+plasma+lipid+profile+and+apparent+cardioprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A null mutation in human APOC3 confers a favorable plasma lipid profile and apparent cardioprotection.</a> Science. 322, 1702-1705 (2008).</li>
<li>Ginsberg, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+B+metabolism+in+subjects+with+deficiency+of+apolipoproteins+CIII+and+AI.+Evidence+that+apolipoprotein+CIII+inhibits+catabolism+of+triglyceride-rich+lipoproteins+by+lipoprotein+lipase+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein B metabolism in subjects with deficiency of apolipoproteins CIII and AI. Evidence that apolipoprotein CIII inhibits catabolism of triglyceride-rich lipoproteins by lipoprotein lipase in vivo.</a> The Journal of Clinical Investigation. 78, 1287-1295 (1986).</li>
<li>Cohn, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+apoC-III+production+is+a+characteristic+feature+of+patients+with+hypertriglyceridemia%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Increased apoC-III production is a characteristic feature of patients with hypertriglyceridemia.</a> Atherosclerosis. 177, 137-145 (2004).</li>
<li>Cohn, J. S., Patterson, B. W., Uffelman, K. D., Davignon, J., Steiner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+of+production+of+plasma+and+very-low-density+lipoprotein+%28VLDL%29+apolipoprotein+C-III+is+strongly+related+to+the+concentration+and+level+of+production+of+VLDL+triglyceride+in+male+subjects+with+different+body+weights+and+levels+of+insulin+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Rate of production of plasma and very-low-density lipoprotein (VLDL) apolipoprotein C-III is strongly related to the concentration and level of production of VLDL triglyceride in male subjects with different body weights and levels of insulin sensitivity.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 89, 3949-3955 (2004).</li>
<li>Maeda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+apolipoprotein+C-III+gene+in+mice+results+in+hypotriglyceridemia+and+protection+from+postprandial+hypertriglyceridemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the apolipoprotein C-III gene in mice results in hypotriglyceridemia and protection from postprandial hypertriglyceridemia.</a> The Journal of Biological Chemistry. 269, 23610-23616 (1994).</li>
<li>Jong, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+C-III+deficiency+accelerates+triglyceride+hydrolysis+by+lipoprotein+lipase+in+wild-type+and+apoE+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein C-III deficiency accelerates triglyceride hydrolysis by lipoprotein lipase in wild-type and apoE knockout mice.</a> Journal of Lipid Research. 42, 1578-1585 (2001).</li>
<li>James, J. F., Hewett, T. E., Robbins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+physiology+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Cardiac physiology in transgenic mice.</a> Circ. Res. 82, 407-415 (1998).</li>
<li>Duranthon, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+emerging+role+of+rabbit+as+human+disease+model+and+the+instrumental+role+of+novel+transgenic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">On the emerging role of rabbit as human disease model and the instrumental role of novel transgenic tools.</a> Transgenic Research. 21, 699-713 (2012).</li>
<li>Fan, J., Watanabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+rabbits+as+therapeutic+protein+bioreactors+and+human+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Transgenic rabbits as therapeutic protein bioreactors and human disease models.</a> Pharmacol. Ther. 99, 261-282 (2003).</li>
<li>Shiomi, M., Ito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Watanabe+heritable+hyperlipidemic+%28WHHL%29+rabbit%2C+its+characteristics+and+history+of+development%3A+a+tribute+to+the+late+Dr.+Yoshio+Watanabe%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">The Watanabe heritable hyperlipidemic (WHHL) rabbit, its characteristics and history of development: a tribute to the late Dr. Yoshio Watanabe.</a> Atherosclerosis. 207, 1-7 (2009).</li>
<li>Morehouse, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+CETP+activity+by+torcetrapib+reduces+susceptibility+to+diet-induced+atherosclerosis+in+New+Zealand+White+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Inhibition of CETP activity by torcetrapib reduces susceptibility to diet-induced atherosclerosis in New Zealand White rabbits.</a> Journal of Lipid Research. 48, 1263-1272 (2007).</li>
<li>Getz, G. S., Reardon, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Animal models of atherosclerosis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32, 1104-1115 (2012).</li>
<li>Carlson, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+TALEN-mediated+gene+knockout+in+livestock%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).</li>
<li>Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., Marraffini, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+editing+of+bacterial+genomes+using+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems.</a> Nature Biotechnology. 31, 233-239 (2013).</li>
<li>Petersen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+%27molecular+scissors%27+for+transgenic+farm+animal+production%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%2C+Fertility%2C+and+Development%22%5BJournal%5D)">Update on 'molecular scissors' for transgenic farm animal production.</a> Reproduction, Fertility, and Development. 25, 317-318 (2012).</li>
<li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+PPARgamma+mono-allelic+knockout+pigs+via+zinc-finger+nucleases+and+nuclear+transfer+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Generation of PPARgamma mono-allelic knockout pigs via zinc-finger nucleases and nuclear transfer cloning.</a> Cell Research. 21, 979-982 (1038).</li>
<li>Flisikowska, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+immunoglobulin+gene+disruption+and+targeted+replacement+in+rabbit+using+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Efficient immunoglobulin gene disruption and targeted replacement in rabbit using zinc finger nucleases.</a> PLoS ONE. 6, e21045(2011).</li>
<li>Foley, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+zebrafish+using+customized+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in zebrafish using customized zinc-finger nucleases.</a> Nature Protocols. 4, 1855-1867 (2009).</li>
<li>Carbery, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+modification+in+mice+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 186, 451-459 (2010).</li>
<li>Mashimo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+knockout+rats+with+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+%28X-SCID%29+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Generation of knockout rats with X-linked severe combined immunodeficiency (X-SCID) using zinc-finger nucleases.</a> PLoS ONE. 5, e8870(2010).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertriglyceridemia+and+delayed+clearance+of+fat+load+in+transgenic+rabbits+expressing+human+apolipoprotein+CIII%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Hypertriglyceridemia and delayed clearance of fat load in transgenic rabbits expressing human apolipoprotein CIII.</a> Transgenic Research. 20, 867-875 (2011).</li>
<li>Hauschild, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+a+biallelic+knockout+in+pigs+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of a biallelic knockout in pigs using zinc-finger nucleases.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 12013-12017 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In het onderhavige werk, werden vijf apoCIII KO konijnen gegenereerd met behulp van de ZFN technologie. Voorheen het enige rapport van de productie van GTT konijnen ook de ZFN technologie 18. De huidige werk bevestigde dat ZFN nuttig is om effectief te richten genen in konijnen. In deze studie, de transgene tarief (positieve kits / totaal geboren) is23.8% (5/21), die vergelijkbaar is met die van het vorige verslag ZFN bij konijnen (30,8%, 16/52) 18 en die gerapporteerd van het gebruik van ZFN bij andere diersoorten, waaronder zebravis 19, 20 muizen, ratten 21 en varkens 17. Dit percentage is zelfs hoger dan de percentages veel conventionele transgene konijnen productie studies, die normaal vallen in het traject van 5-20%. Bijvoorbeeld, in een poging om het product apoCIII transgene konijnen via conventionele DNA micro-injectie, Ding et al.. Verkregen 3 positieve oprichters van de 54 pups geboren (5,6%) 22. In overeenstemming met eerdere bevindingen, de mutaties op de targeting sites zijn variabel, zoals deleties of inserties bestaande verschillend aantal basen (variërend 1-21 in vijf konijnen KO). Op basis van de specifieke sequentie informatie van de grondlegger dieren wordt voorspeld dat tenminste vier (dwz. Die met Δ1, 1, 1, of Δ20 mutaties) functieverlies van apoCIII hebben. Animal R-16 met Δ21 niet functieverlies weergegeven, aangezien deze mutatie is voorspeld enige oorzaak verlies van zeven aminozuren, maar geen leesraam verschuiving. Uiteindelijk fenotype assays worden nagegaan of deze grondlegger dieren werkelijk verlies van apoCIII functies weer. Geen van de vijf KO konijnen opgewekt in de huidige studie bevatten biallelisch wijzigingen. Interessant is ook het geval in het vorige ZFN konijn verslag. Wanneer daarentegen ZFNs gericht α1 ,3-galactosyltransferase werden op varkenscellen, de frequentie gericht op een allel varieerde 7-46%, met ongeveer een derde van mutaties creëren eenstaps biallele knockouts 23. Consistent hiermee bij TALEN werd toegepast op varkens fibroblastcellen, de biallele wijzigingen werden gevonden bij ongeveer 15-40% van de totale positieve klonen 14. Het is mogelijk dat het niet biallele KO konijnen genereren in deze studie species (verschil konijnen versus varkens) voor deze capaciteit van nuclease genexpressie targeting vermeldt. Het is echter meer waarschijnlijk dat dit is gewoon omdat het aantal KO konijnen gegenereerd in dit project is relatief klein. Wij geloven dat ZFN kan genereren bialleic mutaties in konijnen, die moet worden beschouwd als een ander potentieel voordeel van ZFN gebaseerd GTT konijnenproductie. Verdere experimenten nodig om deze capaciteit van ZFN bij konijnen bevestigen. Kortom, de huidige werk toont aan dat ZFN gebaseerd gene targeting aanpak effectief is in het produceren van KO konijnen. In het bijzonder, we gegenereerd vijf apoCIII KO konijnen met een bevredigend transgene tarief van 23,8%. Deze dieren worden beschouwd als meer betekenisvolle informatie over de rol van lipide metabolisme bij mensen deze eiwitten dan de overeenkomstige muismodellen geven. Wij voorspellen ZFN gebaseerde gen targeting, evenals andere nuclease gebaseerde technologieën zoals TALEN en RGEN in nonmurine dieren aanzienlijk de ontwikkeling van nieuwe diermodellen voor diverse menselijke ziekten te bestuderen vergemakkelijken. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig1.jpg" width="500px" /> Figuur 1. Stroomschema van de productie van knock-out konijnen met behulp ZFN technologie. Productie van KO konijnen middels ZFN techniek begint met de selectie van het gen van belang. De sequentie-informatie wordt verstrekt, ZFN sets zijn ontworpen, en subjected om op basis van gist validatie. Bij de check point (CP) 1 (CP-1), alleen die sets voorbij interne validatie (50% of meer van de interne positieve controle) zal worden aan de gebruikers voor selectie aangeboden. Als er geen sets voorbij CP-1, kunnen aanvullende volgorde nodig zijn voor het ontwerpen van effectieve ZFN sets. Een embryo&#39;s in vitro validatie wordt gevolgd om ervoor te zorgen de geselecteerde ZFN set kan mutaties veroorzaken op geselecteerde sites (CP-2). ZFN set (s) zal alleen gebruikt worden als het passeert CP-2 (&gt; = 10% mutatie prijzen in embryo&#39;s in vitro). Mislukking op CP-2 zal een herontwerp van de ZFN sets nodig. Embryo donoren zullen worden voorbereid en pronucleaire stadium embryo wordt gemicroinjecteerd met de gevalideerde ZFN sets. Deze gemicroinjecteerd embryo&#39;s zullen worden overgedragen aan gesynchroniseerd embryo ontvangers. Na een maand draagtijd wordt pasgeborenen genotyperen (CP-3). Als geen van de pasgeborenen positief zijn, zal extra micro-injectie worden uitgevoerd. Het duurt 2-3 maanden na aanvang van het project tot CP-2, uitgaande van no falen tijdens het proces. Het duurt nog 2-3 maanden van CP-2 naar CP-3. Daarom is het mogelijk om een knock-out konijn in een 4-6 maanden tijd met behulp van de ZFN technologie genereren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . <img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig2.jpg" width="500px" /> Figuur 2. ZFN ontwerp. Drie ZFN sets (Set 1, 2, en 3) werden ontworpen gericht is op verschillende sequenties op Exon 1 of Exon 2 van konijn apoCIII (A). Alle drie sets werden onderworpen aan de gist MEL-1 reporter assay de ZFN activiteiten te bepalen. Volgens protocollen van de fabrikant worden ZFNs dat&gt; 50% van de activiteiten die van de interne positieve controle voor de vervaardiging tonen geacht bruikbaar voor in vitro en in vivo experimenten genoom bewerken.De ZFN activiteiten waren 224,2% voor Set 1, 196,9% voor Set 2 en 177,8% voor Set 3 (B), dus Set 1 werd geselecteerd in de huidige studie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . <img alt="Figuur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig3.jpg" width="500px" /> Figuur 3. Embryo&#39;s in vitro validatie van ZFN. De mRNA (5 ug / ml) Set 1 werd gemicroinjecteerd het cytoplasma van 35 pronucleaire fase konijn embryo (A). Gespoeld embryo zonder microinjectie behandeling (n = 31) werden gebruikt als controlegroep. Het BL ontwikkeling bedroeg 77,4% in de controlegroep. In de gemicroinjecteerd groep, de BL bedroeg 51,4%. Van 16 BLs onderworpen aan PCR sequencing, 8 (50%) werden geïdentificeerd als positief, wat aangeeft Set 1 is een effectieve ZFN set om mutaties op de targeting plaats (B, apoc3wt.seq, zwart-boxed) van apoCIII bij konijnen. De BLs bevattende mutaties BL # apoc-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, en 17 (B, rood onderstreept). De resterende BLs (# apoc-2, 6, 9, 10, 12, 14 en 16) hebben geen mutaties op de targeting website. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig3highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . <img alt="Figuur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig4.jpg" width="500px" /> Figuur 4. Productie van apoCIII KO konijnen. Honderd en vijfenveertig embryo gemicroinjecteerd met ZFN Set 1 mRNA&#39;s werden overgebracht naar 7 pseudo-zwangere konijnen ontvanger (A). Vers gespoeld embryo&#39;s (n = 75) zonder ZFN microinjectie werden doorgegeven aan ontvangers (n = 6) als controlegroep. De term tarief berekend als totale looptijd kits / totaal embryo experiment groep 140,5% (21/145), terwijl het tarief is 29,3% (22/75) in de controlegroep (A). Van de 21 kits geboren in de gemicroinjecteerd groep, vijf (R1, R9, R11, R12 en R16) werden geïdentificeerd als positief KO kits na PCR sequencing (B). De INDELs bij de targeting site zijn twee inserties (1 voor zowel R9 en R11) en drie deleties (Δ1, Δ 20 Δ 21 voor R1, R12 en R16, respectievelijk). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig4highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> .

Apolipoproteïne (Apo) C-III (apoCIII) is een kleine O-geglycosyleerde secretorische eiwit dat voornamelijk wordt gesynthetiseerd in de lever en de darmen. Het bevindt zich op het oppervlak van plasma chylomicronen (CM), zeer lage dichtheid lipoproteïne (VLDL) en lipoproteïnen met hoge dichtheid (HDL). ApoCIII is erkend als een risicofactor voor cardiovasculaire ziekte 1. Patiënten met een erfelijke deficiëntie van apoCIII hebben lage plasma triglyceride (TG) en een dalende subklinische coronaire atherosclerose 2,3. Verhoogde plasma apoCIII niveau, anderzijds vaak correleert met insulineresistentie, obesitas en hypertriglyceridemie (HTG) 4,5. Knockout (KO) is een krachtig middel om de functie van een gen te bestuderen. In overeenstemming met de waarnemingen in menselijke populaties mutant, knockout van de apoCIII gen in muizen leidde tot een verlaging van plasma TG en bescherming tegen postprandiale HTG 6. Dergelijke positieve rol van apoCIII verschenenonafhankelijk te zijn van Apolipoprotein E (ApoE), zoals muizen die een tekort van zowel ApoE en apoCIII ook worden beschermd tegen postprandiale hyperlipidemie 7. Hoewel deze apoCIII KO muizen waardevolle informatie heeft verstrekt over de mogelijke functies van apoCIII bij de mens, wordt opgemerkt dat het metabolisme van lipoproteïne van muizen verschilt van die van mensen in vele aspecten. Bijvoorbeeld, muis ontbreekt plasma cholesteryl ester transfer proteïne (CETP), een belangrijke enzym betrokken bij het ​​transport van VLDL, LDL en HDL 8. Daarom moet een geschikt diermodel ontwikkeld met als doel de fysiologische rol van apoCIII in vivo. Het konijn is een klassieke model diersoorten 9-11. Het heeft een korte dracht (30-31 dagen), grote worpgrootte (4-12/litter) en kan gemakkelijk worden ondergebracht in een indoor faciliteit. In vergelijking met muizen, konijnen fylogenetisch dichter bij de mens 10. Belangrijk is, zoals human, maar in tegenstelling tot muizen, konijnen zijn LDL-rijk zoogdieren en hebben aanzienlijke niveaus van CETP 10,12. Bovendien zijn ze gevoelig voor cholesterol-rijk dieet geïnduceerde atherosclerose de laesies gelijk aan die in menselijke atherosclerose 13. Daarom veronderstelden we dat apoCIII KO konijnen kan dienen als een beter model dan hun tegenhangers muis om de rol van ApoCIIIplay vetmetabolisme en atherosclerose bij mensen te onderzoeken. Productie van gen gerichte transgene (GTT) konijnen is een uitdaging. Dit is voornamelijk te wijten aan het ontbreken van kiembaan verzenden van embryonale stamcellen (ESC) en de extreem lage rendement van somatische celkernen (SCNT) bij konijnen. ESC is het belangrijkste instrument om GTT muizen te genereren, terwijl en SCNT is met succes toegepast op KO dieren te genereren in soorten ontbreekt germline verzenden van SER&#39;s, met inbegrip van varkens, schapen en runderen, maar niet konijnen. Onlangs Zinc Finger Nuclease (ZFN), Transchrijving Activator-Like Effector Nuclease (TALEN) 14, en RNA Guided Endonuclease (RGEN) 15 ontpopt als krachtig middel voor het genoom bewerken. Deze nucleasen, zogenaamde &quot;moleculaire scharen&quot;, zijn efficiënt in het genereren van dubbelstrengs breuken (DSB) in het genoom die kan leiden tot een functioneel KO van het doelgen of worden gebruikt om een ​​DNA sequentie te integreren op een specifieke locus in het genoom een aantal soorten 16. In 2011, een van de eerste aanpassing van de ZFN technologie genereerden wij peroxisoomproliferator-activated receptor gamma (PPARy) KO varkens cellen via deze aanpak en met succes gegenereerd PPARy KO varkens na het gebruik van deze cellen voor SCNT 17. In hetzelfde jaar, efficiënte immunoglobuline gendisruptie en gerichte vervanging bij konijnen ook met behulp ZFN werd gemeld 18. In deze studie werden vijf apoCIII KO konijnen gegenereerd zoals bevestigd door PCR sequencing, met ZFN Set 1 (zie figuur 1 </sTrong&gt;. voor stroomschema illustratie). Deze dieren zijn nieuwe middelen om de rollen van apoCIII studeren in lipide stofwisseling.

<table><tbody><tr><td>APOC3-ZFN</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CSTZFNY-1KT</td><td>Doelgen: APOC3, Lotnummer: 12201118MN</td></tr><tr><td>mMESSAGE kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1344M</td><td>mRNA-synthese</td></tr><tr><td>MEGAclear Kit&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>AM1908M</td><td>mRNA-zuivering</td></tr><tr><td>Follikelstimulerend hormoon</td><td>Bioniche Life Sciences</td><td>Folltropin-V</td><td>Behandelen van embryodonorkonijnen</td></tr><tr><td>Humaan choriongonadotrofine</td><td>Intervet</td><td>Chorulon</td><td>Behandelen van embryodonorkonijnen</td></tr><tr><td>Gonadotropin-releasing hormoon</td><td>Prospecbio</td><td>HOR-255</td><td>Behandelen van embryoreceptorkonijnen</td></tr><tr><td>Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30029.02</td><td>Embryocultuur, basismedium</td></tr><tr><td>MEM (niet-essentiële aminozuren)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7145</td><td>Embryocultuur, supplementen</td></tr><tr><td>BME AMINO ZUREN oplossing</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6766</td><td>Embryocultuur, supplementen</td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-149</td><td>Embryocultuur, supplementen</td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>Embryocultuur, supplementen</td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12003C</td><td>Embryocultuur, supplementen</td></tr><tr><td>HEPES gebufferd TCM 199&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12350039</td><td>Embryo manipulatiemedium</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Eppendorf</td><td>Galaxy 170</td><td>Embryocultuurapparatuur</td></tr><tr><td>Micromanipulator&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>TransferMan NK 2</td><td>Embryo manipulatieapparatuur</td></tr><tr><td>Micropipet puller</td><td>Sutter Instruments Inc.</td><td>P-1000</td><td>Embryo manipulatieapparatuur</td></tr><tr><td>Microinjector&nbsp;</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-D</td><td>Embryo manipulatieapparatuur</td></tr><tr><td>Borosilicaat glas capillaire buizen&nbsp;</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100F-6</td><td>Embryo manipulatievoorraad</td></tr><tr><td>Euthasol (pentobarbital natrium)</td><td>Virbac AH, Inc.</td><td>ANADA#200-071</td><td>Euthanisatie van embryodonorkonijnen</td></tr></tbody></table>

productie van apolipoprotein c-iii knockout konijnen behulp zinc finger nucleasen

Production of Apolipoprotein C-III Knockout Rabbits using Zinc Finger Nucleases

Apolipoproteïne (Apo) C-III (apoCIII) zich op het oppervlak van plasma chylomicronen (CM), zeer lage dichtheid lipoproteïne (VLDL) en lipoproteïnen met hoge dichtheid (HDL). Het is bekend dat hoge niveaus van plasma apoCIII constitutea risicofactor voor cardiovasculaire ziekten (CVD). Verhoogde plasma apoCIII niveau vaak correleert met insulineresistentie, obesitas en hypertriglyceridemie. Onschatbare kennis over de rol van ApoCIIIin lipide metabolisme en CVD is verkregen van transgene muismodellen zoals apoCIII knockout (KO) muizen, maar wordt opgemerkt dat het metabolisme van lipoproteïne bij muizen verschilt van die van mensen in vele aspecten. Het is niet bekend tot nu of verhoogde plasma apoCIII is direct atherogene. We werkten aan apoCIII KO konijnen ontwikkelen in de huidige studie op basis van de hypothese dat konijnen kan dienen als een reasonablemodelfor studie van de menselijke vetmetabolisme en atherosclerose. Zinkvinger nuclease (ZFN) sets targeting konijn ApoCIIIgene werden onderworpen aan in vitro validatie vóór embryo micro-injectie. Het mRNA werd geïnjecteerd om het cytoplasma van 35 konijn pronucleaire stadium embryo&#39;s, en evalueerden de mutatie tarieven bij de blastocyst staat. Zestien blastocysten die werden getest, een bevredigende 50% mutaties (8/16) en het richten plaats werd bereikt, die het gebruik van set 1 in vivo experimenten. Vervolgens hebben we gemicroinjecteerd 145 embryo&#39;s met Set 1 mRNA, en overgebracht deze embryo&#39;s tot 7 ontvanger konijnen. Na 30 dagen dracht, werden 21 kits geboren, waarvan er vijf werden bevestigd als apoCIII KO konijnen na PCR sequencing assays. De KO dier tarief (# KO kits / totaal geboren) was 23,8%. De totale productie-efficiëntie is 3,4% (5 kits/145 embryo&#39;s). De huidige werk aangetoond dat ZFN is een zeer efficiënte methode om KO konijnen. Deze apoCIII KO konijnen zijn nieuwe middelen om de rollen van apoCIII studeren in lipide stofwisseling.

In vitro validatie van ZFN paren Zestien ZFN paren werden aanvankelijk ontworpen. De gerichte verstoring opeenvolging van Set 1 is gelegen op Exon 2 van konijn apoCIII (Figuur 2A). Drie paren (Set 1, 2 en 3, figuur 2A) werden geselecteerd en onderworpen aan de gist MEL-1 reporter assay de ZFN activiteiten (figuur 2B) bepalen. Set 1 heeft een ZFN score van 224,2%, hoger dan die van Set 2 (196,9%) en Set 3 (177,8%) en veel hoger dan de selectie drempel (dwz 50% van de interne positieve controle). Daarom Set 1 werd geselecteerd voor in vitro validatie experimenten. Een bijzondere set moet resulteren in een positieve tarieven in de embryo&#39;s van 10% of hoger om de embryo&#39;s in vitro validatie, op basis van de interne validatie criteria passeren. De mRNA (5 ug / ml) Set 1 werd gemicroinjecteerd het cytoplasma van 35 pronucleaire fase konijn embryo (Figuur 3A &lt;/ Strong&gt;). Gespoeld embryo zonder microinjectie behandeling (n = 31) werden gebruikt als controlegroep. Achttien embryo&#39;s van micro-injectie groep ontwikkelde BL stadium D5, waarvan zestien werden gesequentieerd en acht (BL # apoc-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, 17, figuur 3B, rood onderstreept) weergegeven gemuteerd sequenties aan de targeting website (black-boxed, Figuur 2B, bovenste rij, apoC3wt.seq). Het BL snelheid van de micro-injectie groep (51,4%) is lager dan die van de controlegroep (77,4%), wat aangeeft enigszins verminderde ontwikkelingsstoornissen van microgeïnjecteerde embryo. De positieve mutatie snelheid van de micro-injectie embryo 50,0% (8/16), veel hoger dan het geselecteerde drempel (10%). Deze resultaten bleek dat Set 1 is een effectieve ZFN set om mutaties op de targeting plaats van konijn apoCIII. Daarom Set 1 werd gekozen voor in vivo productie van apoCIII KO konijnen. Productie van apoCIII KO konijnen Het mRNA of ZFN Set 1 werd gemicroinjecteerd naar het cytoplasma van konijn pronucleaire embryo&#39;s, en overgebracht 145 gemicroinjecteerd embryo tot 7 pseudo-zwangere ontvanger konijnen (Figuur 4A). Vers gespoeld embryo&#39;s (n = 75) zonder ZFN microinjectie werden doorgegeven aan ontvangers (n = 6) als controlegroep. Na 30 dagen van de dracht werden 21 kits geboren in de gemicroinjecteerd groep. PCR sequencing identificeerde vijf (apoC3-R1, R9, R11, R12 en R16) als positief KO kits (Figuur 4B). De term tarief berekend als totale looptijd kits / totaal embryo&#39;s is 14,5% (21/145), terwijl het tarief is 29,3% (22/75) in de controlegroep. De KO tarief berekend als totaal KO kits / totale looptijd is 23,8% (5/21). Een KO kit (apoC-R16) stierf vijf dagen postpartum (20,0%, 1/5). De indelsat de targeting site zijn twee toevoegingen en drie deleties, ze areΔ1, 1, 1, Δ20 en Δ21, voor Konijnen # R1, R9, R11, R12 en R16, respectievelijk (Figuur 4B). Bioinformatics analyse werd gebruikt om potentiële ZFN identificeren off-targets met 7 of minder mismatches instellen 1 sequentie, zoals eerder 17 beschreven. Slechts een voorspelde mogelijke off-target-site, gelegen op chromosoom 14, werd geïdentificeerd met 7 mismatch bps. PCR-test gedetecteerd geen off-target gebeurtenissen in een van de oprichter dieren.

Recente ontwikkeling in gentargeting instrumenten maakt de productie van knock-out (KO) konijnen mogelijk. In het onderhavige werk, genereerden we vijf Apolipoprotein (Apo) C-III KO konijnen met behulp van Zinc Finger Nucleasen (ZFN). Dit werk heeft aangetoond dat ZFN is een zeer efficiënte methode om KO konijnen.

Productie van Apolipoprotein C-III Knockout Konijnen behulp Zinc Finger Nucleasen

Apolipoprotein (Apo) C-III (ApoCIII) resides on the surface of plasma chylomicron (CM), very low density lipoprotein (VLDL) and high density lipoproteins ...

Het algemene doel van deze procedure is het ontwikkelen van nieuwe konijnmodellen voor de studie van menselijke cardiovasculaire ziekten. Dit wordt bereikt door eerst zinkvingernucleasen te ontwerpen en te synthetiseren die gericht zijn op het betreffende gen. De tweede stap van de procedure is het micro-injecteren van de ZFN-RNA's in het cytoplasma van embryo's in het pronucleaire stadium.De derde stap is het chirurgisch overbrengen van de embryo's naar een recipiënte konijn. De laatste stap is het genotyperen van de pasgeborenen om transgene dieren te identificeren. Over het algemeen is gene targeting via ZFN zeer effectief, wat hier wordt aangetoond door het creëren van een A OC three knockout konijn.Deze techniek is een mijlpaal in de genetische modificatie, aangezien het de eerste methode is die de productie van een no-code konijn mogelijk maakte. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van vele menselijke aandoeningen, zoals hart- en vaatziekten. Er wordt in toenemende mate ingezien dat grote diermodellen nodig zijn om de menselijke fysiologie en pathologie beter na te bootsen.We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we het artikel lazen over succesvolle gen-targeting met behulp van nuclease in konijnen in 2009. Over het algemeen is bekend dat men met deze methode moeite zal hebben, omdat het cytoplasmatische micro-injectie van het construct vereist. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in gen-targeting bij konijnen, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals varkens.Begin met seksueel volwassen Nieuw-Zeelandse witte konijnen die superovuleren door tweemaal daags een subcutane injectie FSH te geven gedurende een periode van drie dagen, waarbij de dosis dagelijks wordt verhoogd. Injecteer 72 uur na de laatste FSH-injectie intraveneus 200 IUs HCG om de ovulatie op te wekken; bereid de superovulerende vrouwtjes onmiddellijk daarna individueel voor. Op dit moment moet ook een ontvangerdier worden voorbereid.16 tot 18 uur na de inseminatie worden de superovulatie-donorkonijnen geëuthanaseerd met natriumpentobarbital. Win de UCT-hoorns terug door de volledige uterus zorgvuldig te verwijderen. Spoel elke UCT en de eierstokstructuren met 10 milliliters manipulatiemedium door het medium in te spuiten vanaf het uterusuiteinde van de UCT.Verzamel het doorgespoelde medium aan het eierstokuiteinde van de UCT in een Petrischaal. De teruggewonnen embryo's bevinden zich in het doorgespoelde medium. Was de embryo's vervolgens drie keer met manipulatiemedium.Incubeer de embryo's vervolgens in het manipulatiemedium bij 38,5 °C in normale lucht. Selecteer de embryo's met een stereomicroscoop 19 tot 21 uur na inseminatie.Verzamel ongeveer 30 embryo's in het pronucleusstadium voor elke injectieconditie; houd rekening met 30 tot 40 van dergelijke embryo's per superovulatie-behandelde vrouwelijke rat. Verkrijg vooraf ZFN-sets voor het gen van belang bij een fabrikant.Selectie van de varianten met de beste ZFN-scores. In dit voorbeeld is het gen van belang A OC drie. Om het ZFN-mRNA voor te bereiden, wordt het ZFN-messenger-RNA eerst in vitro getranscribeerd en worden de transcripten gepolyadenyleerd.Zuiver vervolgens het resulterende mRNA en resuspendeer dit in RNA spree 0.1 xte E. Meet daarna de RNA-concentratie met een spectrofotometer en bereid aliquots voor van de mRNA's die ZFN-paren coderen, met een concentratie van 4 tot 10 ng/µL in vials van 10 µL voor bewaring. Begin met het verwarmen van de microinjectietafel tot 38 °C.Om het micro-injectieplatform voor te bereiden, verwijdert u eerst de mediakamer van een slide met één kamer. Voeg vervolgens een druppel van 5 µL manipulatiemedium toe aan de slide en bedek deze met minerale olie. Plaats de voorbereide slide op de verwarmde microscooptafel.Bevestig vervolgens een holdingpipet met een diameter van 120 micron aan een micromanipulator en positioneer de pipet in de druppel medium op het platform. Ontdooi nu de te injecteren mRNA's op ijs. Laad deze in een injectiepipet, vervaardigd uit een borosilicaatglazen capillaire buis met behulp van een micropipet-puller.Zet vervolgens de persluchttoevoer aan die is aangesloten op de micro-injector. Bevestig daarna de injectiepipet in de houder en bevestig deze aan een tweede micromanipulator. Positioneer ook deze pipet in de druppel medium.Configureer nu de micro-injector voor een injectievolume van één tot vijf picoliters. Om de tip van de injectiepipet te openen, tikt u deze voorzichtig tegen de houdpipet.Breng met een glazen pipet 30 tot 50 embryo's over naar de micromanipulatie. Plaats deze op het platform. Bekijk ze vervolgens bij een 100 x vergroting.Gebruik de holdpipet om een embryo vast te leggen. Lijn de holdpipet en het embryo nu uit met de injectienaald onder 400 x vergroting. Voer de injectiepipet door het embryo.Zorg ervoor dat de nucleus wordt vermeden. Zodra het plasmamembraan is doorboord, wordt het voetpedaal ingedrukt om het mRNA te injecteren; trek na de injectie de naald terug en laat het embryo los. Herhaal dit proces voor alle resterende embryo's.Zodra ze allemaal zijn geïnjecteerd, worden de embryo's drie keer gewassen in embryo-kweekmedium gedurende 30 seconden per wasbeurt. Incubeer de embryo's vervolgens gedurende één tot twee uur bij 38,5 °C in lucht met 5% koolstofdioxide voordat de embryo's worden overgebracht naar de gesynchroniseerde ontvanger.Vrouwelijk konijn. Om de embryo's tot het blastocyststadium te kweken, moet de incubator beschikken over bevochtigde lucht. Selecteer een gezonde vrouwelijke NZW-konijn van vijf tot 12 maanden oud met een gewicht van vier tot vijf kilo.Bereid haar voor als ontvangerdier door eerst gonadotropine-releasing hormoon intramusculair toe te dienen. 16 tot 24 uur na de hormooninjectie wordt het konijn geanestheseerd met ketamine en/of verdampt isofluraan. Wanneer het konijn volledig bewusteloos is, vertoont het geen pedale reflexen meer.Wanneer de voetzool voor de operatie wordt ingedrukt, moeten de ogen worden beschermd met oogzalf en de buik worden geprepareerd. Registreer tijdens de operatie de vitale functies van het konijn. Maak om de 15 minuten een incisie van ongeveer 2,5 centimeter door de huid en vervolgens langs de spierlaag.Exterieuriseer elke eierstok samen met de daaraan vastzittende uterine hoorn, waarbij u een eierstok tussen duim en wijsvinger vasthoudt. Breng de embryo's over naar de eileider met behulp van een zorgvuldig ingebrachte steriele pipet. Gewoonlijk zijn 10 tot 25 van elke 30 geïnjecteerde embryo's levensvatbaar en kunnen deze allemaal naar één ontvanger worden overgebracht.Voltooi de operatie door de spierlaag te sluiten met een gecoate absorbeerbare hechtdraad. Hecht de huid met een absorbeerbare subcuticulaire hechting of met eenvoudige onderbroken niet-absorbeerbare huidhechtingen. Houd het dier vervolgens warm en monitor het totdat het volledig bij bewustzijn is.De ligging is bereikt. In eerste instantie werden 16 ZFN-paren ontworpen. De beoogde disruptievolgorde van de eerste set bevindt zich in exon twee van een OC drie sets.Set één, twee en drie werden geselecteerd en onderworpen aan de yeast MEL one reporter assay om de ZFN-activiteiten te bepalen; set één had een ZFN-score die 224,2% hoger was dan die van set twee en drie, en veel hoger dan de selectiedrempel, die 50% van de interne positieve controle bedraagt. Daarom werd set één geselecteerd voor in vitro validatie-experimenten; mRNA van set één werd gemicro-injecteerd in 35 konijnenembryo's.Het BL-percentage van de micro-injectiegroep leek lager in vergelijking met de embryo's die niet waren micro-geïnjecteerd, wat duidt op een enigszins aangetaste ontwikkelingscompetentie. 18 embryo's van de micro-injectiegroep ontwikkelden zich tot het BL-stadium op dag vijf, waarvan er 16 werden gesequenced. De frequentie van mutaties op de doellocatie was veel hoger dan de selectiedrempel, wat aantoont dat het eerste ZFN-paar effectief was. In totaal werden 145 embryo's gebruikt.Met de eerste set ZFN-mRNA gemicro-injecteerde embryo's werden overgebracht naar zeven pseudodrachtige recipientkonijnen. Versdoorgespoelde embryo's zonder ZFN-micro-injectie werden na 30 dagen dracht overgebracht naar recipienten als controlegroep. In de gemicro-injecteerde groep werden 21 kits geboren.PCR-sequencing identificeerde vijf positieve knock-outs. De indels op de targetlocatie bestonden uit twee inserties en drie deleties. Bio-informatica-analyse werd gebruikt om potentiële ZFN off-targets te identificeren met zeven of minder mismatches ten opzichte van de sequentie van set één; er werd slechts één mogelijke off-targetlocatie geïdentificeerd en PCR detecteerde geen gebeurtenissen op die locatie bij een van de founder-dieren.Kijk deze video. U dient een goed begrip te hebben van hoe knockout-konijnen worden geproduceerd via zinkvingernucleus-micro-injectie.Zodra de embryocollectie onder de knie is, kunnen de micro-injectie en overdracht in vier uur worden voltooid indien dit correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het injectiemateriaal RNA is, wat extra voorzichtigheid vereist. Na deze procedure zal fenotypering worden uitgevoerd om de biologische regels van de doelgenen te begrijpen.

production-apolipoprotein-c-iii-knockout-rabbits-using-zinc-finger

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

De CompoZr Custom Zink-vinger Nuclease (ZFN) Service maakt een nauwkeurige genoom bewerken in een organisme of cel lijn op elk locus bepaald door de gebruiker. In dit artikel beschrijft het proces voor het ontwerp, de fabricage, validatie en implementatie van de CompoZr Custom ZFN Service.

Genoom bewerken met CompoZr Custom Zinc Finger Nucleasen (ZFNs)

Designer nucleasen zoals zinkvinger nucleasen (ZFNs) en transcriptie activator-achtige effector nucleasen (Talens) kan worden gebruikt om het genoom van de muis implantatie embryo's wijzigt activeren zowel de homologe eind mee (NHEJ) en homologe recombinatie (HR) wegen. Deze voorschotten in staat de snelle generatie van muizen met precieze genetische modificaties.

Mouse Genome engineering behulp Designer Nucleasen

We beschrijven een methode om een mogelijk zebravismodel van polycystische nierziekte te genereren. We gebruikten Tg(wt1b:GFP) vissen om de nierstructuur te visualiseren. Knockdown van wnt5a gebeurde door middel van een morpholino-injectie. Pronefrische cystevorming na wnt5a knockdown werd waargenomen in deze GFP-transgene zebravis.

Een mogelijke zebravis model van PKD: Knockdown van Wnt5a Oorzaken Cysten in zebravis Nieren

Hier gepresenteerd is een protocol voor efficiënte SCHERPEr/Cas9 ribonucleoproteã-gemedieerde gen bewerken in zoogdiercellen met behulp van buis Electroporation.

SCHERPEr/Cas9 Ribonucleoproteã-gemedieerde nauwkeurige Gene bewerking door buis Electroporation

Hier presenteren we een aangepaste methode voor cryopreservatie van eencellige embryo's, evenals een protocol dat het gebruik van gevriesontdooide embryo's en elektroporatie koppelt voor de efficiënte generatie van genetisch gemodificeerde muizen.

Gebruik van gevriesde embryo's voor hoogrendementproductie van genetisch gemodificeerde muizen

Verschillende methoden zijn gebruikt voor het analyseren van plasma lipoproteïnen; ultracentrifugatie is echter nog steeds een van de meest populaire en betrouwbare methoden. Hier beschrijven we een methode met betrekking tot het isoleren van lipoproteïnen uit plasma met behulp van sequentiële dichtheid ultracentrifugatie en hoe de apolipoproteïnen te analyseren voor zowel diagnostische als onderzoeksdoeleinden.

Isolatie en analyse van plasma lipoproteïnen door ultracentrifugatie

Het huidige protocol beschrijft zygote micro-injectie van CRISPR-Cas9 en donor-DNA om efficiënt gencassette knock-in en floxed muizen te produceren.

Zygote micro-injectie voor het maken van gencassette knock-in en flox-allelen bij muizen

Hier beschrijven we een eenvoudige techniek die bedoeld is voor de efficiënte generatie van genetisch gemodificeerde muizen, CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Deze methode levert bewerkingsreagentia door elektroporatie in embryo's met een efficiëntie van bijna 100%. Dit protocol is effectief voor puntmutaties, kleine genomische inserties en deleties in zoogdierembryo's.

Efficiënte genoombewerking van muizen door CRISPR-elektroporatie van zygoten

In dit protocol beschrijven we de technische procedures om bruin vetweefsel (BAT)-specifieke knock-out muizen te genereren met behulp van een gecombineerd Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 en adeno-geassocieerd virus (AAV) single-guide RNA (sgRNA) systeem. De beschreven stappen omvatten het ontwerp van de sgRNA's, de bereiding van de AAV-sgRNA-deeltjes en de micro-injectie van AAV in de BBT-lobben.

Generatie van bruine vet-specifieke knock-out muizen met behulp van een gecombineerd Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 en Adeno-geassocieerd virus single-guide RNA-systeem

Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van maternale mutant dat een stabiele zpc:cas9 knock-in-lijn koppelt aan Tol2-gemedieerde afgifte van sgRNA-expressiecassettes.

Generatie van maternale mutanten met behulp van zpc:cas9 knock-in zebravissen

De efficiëntie van de Improved Genome Editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery (I-GONAD)-methode is vergelijkbaar met traditionele micro-injectie, waarbij zygoten moeten worden verzameld bij donorvrouwtjes en moeten worden overgedragen aan pseudo-zwangere vrouwtjes. Dit protocol demonstreert zijn effectiviteit door CRISPR/Cas9-geïnduceerde mutaties te introduceren in de ROSA26-locus op chromosoom 6.

Verbeterde genoombewerking via oviductale nucleïnezuren Op levering gebaseerde in vivo elektroporatietechniek voor het genereren van knock-out muizen

Leer hoe u Apolipoprotein C-III knockout-konijnen produceert met behulp van Zinc Finger Nucleases voor cardiovasculair onderzoek. Deze methode maakt efficiënte genetische modificatie in grote diermodellen mogelijk.

Productie van Apolipoprotein C-III Knockout Konijnen behulp Zinc Finger Nucleasen

Meer video's verkennen