Name: A Novel Lichte Schade Paradigm voor gebruik in retinale Regeneration Studies in Adult zebravis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-24T15:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Leer een verbeterde lichtschademethode voor retinale degeneratie bij volwassen Danio rerio. Deze techniek combineert UV-licht met continue belichting om zowel staaf- als kegelcellen te beschadigen voor regeneratieonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Xixia Luo bedanken voor uitstekende vis veeteelt en technische ondersteuning. Dit werk werd gefinancierd door de National Institutes of Health subsidies R21EY019401 (RT) en P30EY04068 (RT), en start-up middelen aan RT, waaronder een onbeperkte subsidie ​​van onderzoek ter voorkoming van Blindheid aan de Wayne State University, Afdeling Oogheelkunde. JT werd ondersteund door een Thomas C. Rumble Fellowship verstrekt door de Wayne State University Graduate School.

Alle in dit protocol beschreven procedures werden goedgekeurd door de commissie gebruik van dieren aan de Wayne State University School of Medicine. 1. Dark Aanpassing <ol><li> Transfer ~ 10 volwassen albino of gepigmenteerde vissen uit de normale huisvestingssysteem in een donkere kast. Indien beschikbaar, gebruik dan een donkere behuizing die is ingebouwd in de zebravis behuizing module, die het mogelijk maakt voor de normale waterstroom door de tank. (Indien een dergelijk systeem niet beschikbaar is, plaatst u het aquarium in een volledig donkere ruimte, en zorg ervoor dat de vis beluchten met zuurstof). </li><li> Houd de vis in het donker gedurende 10 dagen. Bij het voeren van de dieren of het toevoegen van nieuwe vis aan de donkere doos, zorg ervoor om zo snel mogelijk te verplaatsen om te voorkomen dat het blootstellen van de vis aan een lange periode van licht. </li></ol> 2. UV Light Exposure <ol><li> Zorg ervoor dat de stroom naar de UV-bron is UIT. Verwijder het UV-licht gloeidraad van tl stereomicroscoop. <ol><li> Gebruik een omgekeerde15 cm diameter glazen petrischaal (of iets van een soortgelijke 2 cm hoogte) als een standaard voor de UV-filament. Tape de petrischaal naar het lab bank. </li><li> Tape het UV-licht gloeidraad naar de top van de omgekeerde petrischaal. Regelen zodat ~ 2 mm van het uiteinde van het filament hangt de petrischaal. </li></ol></li><li> Verkrijgen van een ml bekerglas 250. Bedek ½ van de bodem, zijkanten en achterkant van het bekerglas met aluminiumfolie en zorg ervoor dat de &quot;glanzende&quot; kant van de folie wordt geconfronteerd met de binnenkant van de beker. Als de beker is afgestudeerd, hebben betrekking op de geformuleerde helft van het bekerglas met folie, waardoor het heldere helft van de beker blootgesteld. </li><li> Vul het bekerglas van 250 ml met 100 ml water uit de vis faciliteit systeem. </li><li> Plaats het bekerglas van 250 ml in een 4 L beker. Vul de 4 L bekerglas met water totdat het waterpeil is zelfs met de 100 ml water lijn in het bekerglas van 250 ml. </li><li> Voeg maximaal 10 dark-behandelde dieren het bekerglas van 250 ml. Dek het bekerglas van 250 ml met een klein stukje aluminiumfolie. </li><li> Plaats het bekerglas gehele inrichting direct naast de UV filament. De filament dient de buitenzijde van de beker 4 L raken en tegenover de blootgestelde gedeelte van het bekerglas 250 ml. Zorg ervoor dat het bekerglas 250 ml is gecentreerd op de bodem van de 4 L beker. </li><li> Plaats een groot, ondoorzichtig scherm achter de 4L beker, waardoor de dieren worden blootgesteld, maar voorkomen dat laboratoriumpersoneel zien van het uiteinde van de UV filament. WAARSCHUWING: zorg ervoor dat deze barrière is op zijn plaats VOORDAT u de stroom naar de UV-bron. </li><li> Schakel de UV-krachtbron. Stel timer voor 30 minuten. Plaatsen wat nodig waarschuwingslabels om ervoor te zorgen dat nietsvermoedende laboratoriumpersoneel niet per ongeluk zichzelf bloot aan UV-straling. </li><li> Na 30 minuten, schakel de UV stroombron. Verwijder het bekerglas van 250 met de vis. OPMERKING: als er meerdere rondes van UV-blootstelling vereist zijn, laat de krachtbron afkoelen (~ 20 min) voordat men het protocol belichting. Zorg ervoor te vervangen thij 100 ml water met verse systeem water voor elke opname. Het water in de beker 4 L niet te worden vervangen. </li></ol> 3. Halogeen Lamp Light Exposure <ol><li> Breng de vis van 250 ml bekerglas in een 1,8 L helder acryl aquarium. Vul de tank op de overloop merk. </li><li> Opzetten van de halogeen lamp licht te behandelen gebied. Krijgen vier 250 W halogeen lampen nut van een plaatselijke bouwmarkt. Geconfronteerd met twee lampen in dezelfde richting, regelen 29 cm van elkaar op centrum. Leg de overige twee lampen in een soortgelijke manier. <ol><li> Plaats de tweede set lampen, zodat zij worden geconfronteerd met de eerste set lampen, waardoor ~ 73 cm tussen de twee sets van de lampen. Dit creëert een rechthoek-vormige lichtbehandeling oppervlakte van 29 x 73 cm. </li></ol></li><li> Verkrijgen van een kleine ventilator van een plaatselijke bouwmarkt. Plaats de ventilator op gelijke afstand tussen de twee sets van lampen, net buiten het licht te behandelen gebied. </li><li> Plaats twee 1,8 L tanks vol met water in het midden van delicht te behandelen gebied, op gelijke afstand tussen de twee sets van lampen. De afstand tussen de lampen en de buitenwand van de tank moet ~ 29 cm. Opmerking: zelfs als slechts de behandeling van 10 vissen in een 1,8 L tank, gebruik maken van deze regeling. Beide tanks nodig zijn watertemperatuur van elke tank binnen de juiste grenzen te houden. </li><li> Plaats een zuurstof beluchter in elke tank. </li><li> Bedek elke tank met helder acryl deksels, waardoor een ~ 2 cm afstand op het einde het dichtst bij de ventilator. Schik de ventilator, zodat het zal de lucht blazen in deze kloof. Plaats een thermometer in een van de tanks of beide. </li><li> Schakel de stroom naar de verlichting, ventilator, en beluchters. Onderhouden lichte behandeling voor maximaal 4 dagen. De vis mag niet worden gevoerd tijdens de lichtbehandeling, omdat dit van invloed op de waterkwaliteit en resulteren in meer stress bij de dieren. </li><li> Bewaken temperatuur en waterniveau op een dagelijkse basis. Handhaaf de temperatuur op 30-33 ° C. Pas indien nodig de ventilatorsnelheid en / of de afstand tussen de tanks en de lights. <ol><li> Boven uit elke tank met het systeem zo nodig water, meestal dagelijks. </li><li> Gebruik altijd gezond volwassen zebravissen (meestal 6-9 maanden oud) voor een overlevingspercentage van bijna 100% te handhaven. Echter, als een vis dood is gevonden in de tank, onmiddellijk te verwijderen en het water in de hele tank te vervangen. </li></ol></li></ol> 4. Tissue Collection <ol><li> 48 uur na het begin van de halogeen lichtbehandeling verwijder de vis uit het behandelde gebied. <ol><li> Bereid verse ethanol formaldehyde fixatief (1 deel 37% formaldehyde, 9 delen 100% ethanol). </li><li> Euthanize zebravis met een verdovende overdosis van 2-fenoxyethanol (0,4 mg / L). </li><li> Breng de gedood zebravis een papieren handdoek. Ophelderen het oog met behulp van gebogen pincet. </li><li> Plaats enucleated ogen in fixatief en winkel O / N bij 4 ° C. </li></ol></li><li> Cryoprotect de ogen. <ol><li> De ogen wassen in 5% sucrose 1x PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, daarna vervangenverse 5% sucrose 1x PBS gedurende 2 uur. Vervolgens wassen de ogen in 30% sucrose 1x PBS O / N bij 4 ° C. De ogen wassen in een 1:1 (gelijke delen) van weefsel invriesmedium en 30% sucrose 1x PBS O / N bij 4 ° C. </li></ol></li><li> Integreer de ogen in 100% weefsel bevriezen middelgrote en bewaar bij -80 ° C. Plaats de ogen zodat cryosectioning van het weefsel wordt uitgevoerd op de dorsale / ventrale as. </li><li> Cryosection het weefsel en plaats op glasplaatjes. Warme slides 2 uur bij 55 ° C. Store slides bij -80 ° C of onmiddellijk uitvoeren standaard immunohistochemie. </li><li> Presteren standaard immunohistochemie op coupes weefsel en afbeelding met fluorescentie microscopie 40,51. </li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier laten we zien dat het combineren van een korte blootstelling aan UV met een continue blootstelling aan fel licht resulteert in wijdverspreide photoreceptor verlies en een robuuste regeneratie respons. Vergeleken met de individuele LIRD methoden, deze gecombineerde werkwijze is ook de meest effectieve protocol zowel staafjes en kegeltjes beschadigen beide helften van de retina. Belangrijk is dat deze behandeling effectief in gepigmenteerde dieren en albinodieren. Hoewel wij leve...

Licht-geïnduceerde retinale degeneratie (LIRD) wordt gebruikt op zowel knaagdieren en zebravis schade staafjes en kegeltjes fotoreceptoren. Bij volwassen zebravissen, fotoreceptor degeneratie triggers Müller gliacellen opnieuw in te voeren de celcyclus en produceren voorbijgaande versterkende voorlopers. Deze voorlopers blijven prolifereren als ze migreren naar het beschadigde gebied, waar zij uiteindelijk tot nieuwe fotoreceptoren. Momenteel zijn er twee algemeen gebruikte LIRD paradigma&#39;s, die elk resulteert in verschillende graden van fotoreceptor verlies en overeenkomstige verschillen in de regeneratie reactie. Naarmate meer genetische en farmacologische hulpmiddelen zijn beschikbaar om de rol van individuele genen van belang tijdens de regeneratie testen, is er behoefte aan een robuuste LIRD paradigma ontwikkelen. Hier een LIRD protocol beschrijven we dat resulteert in wijdverspreide en consistente verlies van zowel de staafjes en kegeltjes fotoreceptoren waarin we het gebruik van twee eerder vastgestelde LIRD technieken gecombineerd. BovendienDit protocol kan worden uitgebreid voor gebruik in gepigmenteerde dieren, die de noodzaak om transgene lijnen van rente te handhaven op de albino achtergrond voor LIRD studies elimineert.

<table><tbody><tr><td>UV lichtbron</td><td>Leica</td><td>EL600</td><td></td></tr><tr><td>Glazen petrischaal (150 x 20 mm)</td><td>Sigma-Aldrich/Pyrex</td><td>CLS3160152BO</td><td></td></tr><tr><td>250 ml glazen beker</td><td>Sigma-Aldrich/Pyrex</td><td>CLS1000250</td><td></td></tr><tr><td>4 L glazen beker</td><td>Sigma-Aldrich/Pyrex</td><td>CLS10004L</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumfolie</td><td>Fisher</td><td>01-213-105</td><td></td></tr><tr><td>250 W halogeenlampen</td><td>Workforce</td><td>265-669</td><td></td></tr><tr><td>1.8 L heldere acryltanks</td><td>Aquaneering</td><td>ZT180T</td><td></td></tr><tr><td>1.8 L heldere acryl tankdeksels</td><td>Aquaneering</td><td>ZT180LCL</td><td></td></tr><tr><td>Ventilatie</td><td>Honeywell</td><td>HT-900</td><td></td></tr><tr><td>Beluchter</td><td>Tetra</td><td>77853-900</td><td></td></tr><tr><td>Thermometer</td><td>Cole-Parmer</td><td>YO-08008-58</td><td></td></tr><tr><td>Gebogen pincet (5/45)</td><td>World Precision Instruments</td><td>504155</td><td></td></tr></tbody></table>

a novel lichte schade paradigm voor gebruik in retinale regeneration studies in adult zebravis

A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish

Licht-geïnduceerde retinale degeneratie (LIRD) wordt gebruikt op zowel knaagdieren en zebravis schade staafjes en kegeltjes fotoreceptoren. Bij volwassen zebravissen, fotoreceptor degeneratie triggers Müller gliacellen opnieuw in te voeren de celcyclus en produceren voorbijgaande versterkende voorlopers. Deze voorlopers blijven prolifereren als ze migreren naar het beschadigde gebied, waar zij uiteindelijk tot nieuwe fotoreceptoren. Momenteel zijn er twee algemeen gebruikte LIRD paradigma&#39;s, die elk resulteert in verschillende graden van fotoreceptor verlies en overeenkomstige verschillen in de regeneratie reactie. Naarmate meer genetische en farmacologische hulpmiddelen zijn beschikbaar om de rol van individuele genen van belang tijdens de regeneratie testen, is er behoefte aan een robuuste LIRD paradigma ontwikkelen. Hier een LIRD protocol beschrijven we dat resulteert in wijdverspreide en consistente verlies van zowel de staafjes en kegeltjes fotoreceptoren waarin we het gebruik van twee eerder vastgestelde LIRD technieken gecombineerd. BovendienDit protocol kan worden uitgebreid voor gebruik in gepigmenteerde dieren, die de noodzaak om transgene lijnen van rente te handhaven op de albino achtergrond voor LIRD studies elimineert.

De hiervoor beschreven licht behandelprotocol werd vergeleken aan elke individuele wijze van LIRD. In donkere behandelde volwassen albino dieren (figuren 3-5), de individuele licht behandelingen resulteerden in een significant verlies van staaf (figuur 3) en de conus (figuur 4) fotoreceptoren. Zowel individuele behandelingen hoofdzakelijk beschadigd fotoreceptoren in de dorsale helft van het netvlies, waardoor de ventrale netvlies relatief beschermd tegen licht...

Meerdere lichte schade protocollen zijn beschreven schade fotoreceptoren en dientengevolge een netvlies regeneratie respons bij volwassen zebravissen induceren. Dit protocol beschrijft een verbeterde werkwijze die kan worden gebruikt in gepigmenteerde dieren en beschadigt de meeste staafjes en kegeltjes fotoreceptoren over de gehele retina.

A Novel Lichte Schade Paradigm voor gebruik in retinale Regeneration Studies in Adult zebravis

Light-induced retinal degeneration (LIRD) is commonly used in both rodents and zebrafish to damage rod and cone photoreceptors. In adult zebrafish, ...

Het algemene doel van deze procedure is om twee eerder beschreven protocollen voor lichtgeïnduceerde retinale degeneratie te combineren, om zo zowel de staafjes- als de kegeltje-fotoreceptoren in de gehele retina te beschadigen. Dit wordt bereikt door eerst donkergeadapteerde volwassen zebravissen gedurende 30 minuten bloot te stellen aan UV-licht. De tweede stap is om de UV-behandelde vissen onmiddellijk over te brengen naar tanks die omringd zijn door vier halogeenlampen van 250 watt en de vissen tot vier dagen lang aan continu licht bloot te stellen.De laatste stap is het euthanaseren van de vissen en het nucleeren van de ogen voor verdere analyse. Uiteindelijk wordt immunofluorescentiemicroscopie gebruikt om het consistente verlies van zowel staafjes- als kegeltjesfotoreceptoren in de gehele retina aan te tonen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals een behandeling met UV-licht of een halogeenlamp, is dat de combinatie van deze twee methoden resulteert in de ablatie van zowel staafjes- als kegeltjesfotoreceptoren in de gehele retina.Beschadiging van de fotoreceptoren induceert een wijdverspreide proliferatiereactie die uiteindel

a-novel-light-damage-paradigm-for-use-retinal-regeneration-studies

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een methode om een ​​doelwit eiwit expressie voorwaardelijk knockdown in de volwassen zebravissen netvlies wordt beschreven, wat inhoudt intravitreally injecteren van antisense morpholinos en electroporating ze in het netvlies. De daaruit resulterende eiwitten neergeslagen voor meerdere dagen, waardoor het testen van de eiwit rol in de regenereren of intact netvlies.

In vivo Elektroporatie van Morpholinos in de Adult zebravis Retina

This video demonstrates a procedure to induce retinal degeneration in adult zebrafish using laser injury. The laser targets photoreceptor cells in the retina, triggering cell death and a degenerative process. This damage activates Müller glia (MG) cells, leading to their dedifferentiation into stem cell progenitors that aid in retinal regeneration.

Modeling Retinal Degeneration and Regeneration in Zebrafish Using a Focal Laser Injury

We introduceren een efficiënte methode om retinale ganglioncellen (RGC's) bij volwassen zebravissen retrograad te labelen.

Retrograde Labeling van retinale ganglioncellen in Adult zebravis met fluorescente kleurstoffen

Omdat veel zebravismodellen van neurologische en niet-neurologische ziekten worden bestudeerd in de volwassen vissen dan het embryo / larven ontwikkelden we een kwantitatieve dwarslijn regeneratieve test die kan worden toegepast bij de zebravis ziektemodellen volwassene. De test betrokken resolutie bij de 1) neuromast en 2) individuele haar cel niveaus.

Een test voor laterale lijn Regeneration in Adult zebravis

Hierin tonen we kwantificering van retinale de- en regeneratie en de impact ervan op de visuele functie met behulp van N-methyl-N -nitrosourea in de volwassen zebravissen. Verlies van gezichtsscherpte en verminderde fotoreceptor nummers volgde proliferatie in de binnenste kernlaag. Compleet morfologische en functionele regeneratie trad 30 dagen na de eerste behandeling.

Methyl- (MNU) geïnduceerde retinale degeneratie en regeneratie in de zebravis: histologische en functionele kenmerken

Zebravis netvlies regeneratie is meestal onderzocht met behulp van vaste netvliezen. Echter, dynamische processen zoals interkinetic nucleaire migratie optreden tijdens de regeneratieve respons en vereisen voor live-cell imaging om de onderliggende mechanismen te onderzoeken. We beschrijven hier de cultuur en beeldvorming voorwaarden te controleren Interkinetic Nuclear Migratie (INM) in real-time met behulp van multiphoton microscopie.

Cultuur van volwassen transgene zebravis Retina Explantaten voor Live-cell imaging van Multiphoton Microscopy

De zebravis is een populaire diermodel te bestuderen van de mechanismen van Retina degeneratie/regeneratie in gewervelden. Dit protocol beschrijft een methode om gelokaliseerde letsel verstoren het buitenste netvlies met minimale schade aan het innerlijke netvlies veroorzaken. Vervolgens controleren we in vivo de retinale morfologie en de reactie hierop van Müller, glia hele netvlies regeneratie.

Müller Glia cel activatie in een Laser-geïnduceerde Retina degeneratie en regeneratie Model in de zebravis

Een mechanisch hersenletselmodel bij de volwassen zebravis wordt beschreven om de moleculaire mechanismen te onderzoeken die hun hoge regeneratieve capaciteit reguleren. De methode legt uit om een steekwondletsel te creëren in het optische tectum van meerdere soorten kleine vissen om de regeneratieve reacties te evalueren met behulp van fluorescerende immunostaining.

Steekwondletselmodel van het volwassen optische tectum met behulp van zebravissen en medaka voor de vergelijkende analyse van regeneratieve capaciteit

Het huidige protocol beschrijft een methode om weefselspecifieke en zeer reproduceerbare verwondingen bij zebravislarven te induceren met behulp van een laserlaesiesysteem in combinatie met een geautomatiseerd microfluïdisch platform voor het hanteren van larven.

Gecontroleerde semi-geautomatiseerde lasergeïnduceerde verwondingen voor het bestuderen van spinale regeneratie bij zebravislarven

Het artikel legt uit hoe de ogen chirurgisch kunnen worden verwijderd van levende zebravislarven als de eerste stap om te onderzoeken hoe retinale input de groei en ontwikkeling van het optische tectum beïnvloedt. Daarnaast biedt het artikel informatie over larvale anesthesie, fixatie en hersendissectie, gevolgd door immunohistochemie en confocale beeldvorming.

Oogverwijdering bij levende zebravislarven om innervatie-afhankelijke groei en ontwikkeling van het visuele systeem te onderzoeken

Dit protocol beschrijft de methodologie om het retinale pigmentepitheel (RPE) genetisch te aborteren met behulp van een transgeen zebravismodel. Het aanpassen van het protocol om signaleringsroutemodulatie met behulp van farmacologische verbindingen op te nemen, is uitgebreid gedetailleerd. Een MATLAB-platform voor het kwantificeren van RPE-regeneratie op basis van pigmentatie werd ontwikkeld en wordt gepresenteerd en besproken.

Nitroreductase/metronidazol-gemedieerde ablatie en een MATLAB-platform (RpEGEN) voor het bestuderen van regeneratie van het retinale pigmentepitheel van de zebravis

Leer een verbeterde lichtschademethode voor retinale degeneratie bij volwassen Danio rerio. Deze techniek combineert UV-licht met continue belichting om zowel staaf- als kegelcellen te beschadigen voor regeneratieonderzoek.

A Novel Lichte Schade Paradigm voor gebruik in retinale Regeneration Studies in Adult zebravis

Meer video's verkennen