Expressie van Functionele Recombinant Hemagglutinine en neuraminidase Eiwitten uit de roman H7N9 Influenza Virus Met de baculovirusexpressiesysteem
6 november 2013
Hier beschrijven we een manier om correct gevouwen en functionele oppervlak influenzavirus-antigenen afgeleid van de nieuwe Chinese H7N9 virus in insectencellen uiten. De techniek kan worden aangepast aan ectodomeinen van elke virale of cellulaire oppervlakte-eiwitten tot expressie.
Het algemene doel van deze procedure is om correct gevouwen gezuiverde griep, hemagglutinine en neuraminidase oppervlakte glycoproteïne te genereren voor immunologische assays en vaccinatie-experimenten. Dit wordt bereikt door eerst het recombinante BMid met griepgenen te klonen, gevolgd door de generatie van recombinante baula-virussen. De tweede stap is om deze recombinante baula-virussen te gebruiken om hemagglutinine- en neuraminidase-eiwitten in insectencellen tot expressie te brengen.
Vervolgens worden de recombinante eiwitten gezuiverd uit het celcultuursupernatant met behulp van affiniteitschromatografie. De laatste stap is om deze eiwitten te karakteriseren om een goede kwaliteit en biologische functionaliteit te garanderen. Uiteindelijk worden de recombinante eiwitten gebruikt om immuunresponsen op de oppervlakte glycoproteïnen van het griepvirus te onderzoeken.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden, zoals bacteriële expressie van HA bijvoorbeeld, is dat de gezuiverde antigenen correct gevouwen zijn en ook biologisch actief blijven, in tegenstelling tot het gebruik van hele viruspreparaten voor immunologische assays. Deze reagentia maken het mogelijk om immuunresponsen tegen de hemagglutinine en niet-neuraminidase-eiwitten te meten. Begin dit protocol alleen met de generatie van recombinant baula-virus zoals beschreven in de tekstprotocol werkend aseptisch in een laminaire flowhood plaat, SF negen insectencellen in zes putjes platen met een dichtheid van 200.000 cellen per vierkante centimeter.
En laat ze 20 minuten zitten in een incubator van 28 graden Celsius zonder CO2. Meng vervolgens twee microgram recombinante back mid met 100 microliters Trico Leia knie medium formulering HINK of TNM fh. Meng vervolgens zes microliters van het transfectie-agens met 100 microliters TNM FH insect medium.
Combineer de twee volumes mix voorzichtig en laat het transfectiemengsel 20 minuten zitten. Bij kamertemperatuur is één mock-transfectie als controle opgenomen, die het transfectiereagens bevat maar geen DNA. Verwijder de SNAT van de geplateerde SF negen cellen en vervang met twee milliliter serumvrij TNM FH medium dat 1% penicilline-streptomycine-oplossing bevat.
Voeg het volledige volume van het transfectiemengsel toe aan de cellen en schud de zes putjesplaat voorzichtig gedurende vijf seconden. Incubeer in een incubator van 28 graden Celsius zonder CO2 gedurende zes uur. Vervang de media met vers volledig TNM FH medium voordat de plaat gedurende zes dagen onder dezelfde omstandigheden wordt geïncubeerd.
Controleer de cellen af en toe onder een microscoop. Geïnfecteerde cellen zien er meestal groter uit. Runder hebben vergrote kernen en beginnen los te komen.
Oogst cellen zes dagen na transfectie door centrifugatie bij 2000 G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Het supernatant bevat het recombinante baula-virus en zal onmiddellijk worden gebruikt om werkstocks te genereren, of kan jarenlang worden bewaard bij vier graden Celsius. Controleer de eiwitexpressie via SDS-page en western blot en bereid de werkstocks voor zoals beschreven in het tekstprotocol.
SF negen cellen ondersteunen de groei van maculaire virus heel goed. Hun vermogen om grote hoeveelheden recombinant eiwit af te scheiden is echter beperkt. Daarom gebruiken we een andere insectencellijn.
High five cellen voor de expressie van gesecreteerde recombinante eiwitten. Deze cellen ondersteunen de groei van balo-virus niet tot hoge titers, maar ze hebben een zeer hoge secretoire capaciteit. Kweek high five cellen in SFX insectencelcultuurmedium in T 175 vierkante centimeter flesjes, passeer elke dag.
Splits ze in een verhouding van één op drie. Kweek vijf volgroeide flesjes voor een 200 milliliter expressiecultuur om de high five cellen te oogsten en infecteren. Los eerst high five cellen op door de flesjes te tikken.
Verzamel de celsuspensie en breng over in 50 milliliter centrifugeerbuizen. Draai de buizen 1200 G gedurende zeven minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant door afgieten en verenig de pellets door ze op te schorsen, op te schorsen in 15 milliliter P drie stock.
Laat de cellen 15 minuten zitten in de flowhood. Breng 200 milliliter hoog klon SFX-cultuurmedium over in een schone steriele 1000 milliliters shaker fles. Breng vervolgens de P drie celsuspensie over in de shaker fles, verzegel met steriele aluminiumfolie voordat gedurende 72 tot 96 uur geschud wordt bij 70 RPM en 28 graden Celsius.
Om recombinant eiwit te oogsten uit high five cel expressiesupernatanten bij 72 tot 96 uur na infectie. Breng cultuursupernatant over in 500 milliliter centrifugeerbakjes. Spin bij 5.500 G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius.
Was ondertussen de shaker fles drie keer met tweemaal gedistilleerd water. Pipetteer vervolgens drie milliliters nikkelharsslurry in een 50 milliliter buis met 45 milliliters PBS per 200 milliliters cultuur.
Schud goed voordat gedurende 10 minuten bij 3000 G en kamertemperatuur te centrifugeren. Giet de PBS af en bewaar het pellet. Meng het insectencelsupernatant met het nikkelharspellet en breng over in de al gewassen shaker flessen.
Incubeer gedurende twee tot vier uur bij vier graden Celsius terwijl geschud wordt. Monteer vervolgens een 10 milliliter polypropyleen kolom op een klem op een steunstatief. Verwijder beide doppen en plaats een beker onder de kolom om het doorstromende vocht op te vangen.
Na incubatie van de shaker fles, begin met het overbrengen van het supernatant slurrymengsel op de kolom. Het zal het nikkelhars vasthouden en alleen het supernatant zal doorstromen. Laat het gehele volume over de kolom lopen.
Was de hars vier keer met 15 milliliter wasbuffer. Laat de wasbuffer uit de kolom lopen en sluit de onderkant met de dop. Voeg twee milliliters elucian buffer toe en laat het vijf minuten zitten.
Open de kolom en verzamel de eit, houd het waar mogelijk op nat ijs. Herhaal dit nog drie keer. Een EIT die hoge concentraties eiwit bevat, vertoont typisch schuim bij het schudden om de buffer uit te
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor de expressie van correct gevouwen en functionele influenza-virussurface-antigenen van het H7N9-virus in insectencellen. Deze aanpak is aanpasbaar voor de expressie van diverse virale of cellulaire oppervlakte-eiwitten.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Virologie
- Immunologie
- Eiwitengineering
Achtergrond
- Oppervlakte-glycoproteïnen van het influenzavirus zijn cruciaal voor studies naar de immuunrespons.
- Correcte vouwing en functionaliteit van deze eiwitten zijn essentieel voor hun gebruik in assays.
- Het H7N9-virus biedt unieke uitdagingen en mogelijkheden voor onderzoek.
- Insectencelsystemen bieden een levensvatbaar platform voor eiwitexpressie.
Doel van het onderzoek
- Om gezuiverde influenza-hemagglutinine- en neuraminidase-eiwitten te genereren.
- Om immunologische assays en vaccinatie-experimenten te faciliteren.
- Om immuunresponsen op influenza-virus oppervlakte-glycoproteïnen te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Kloneren van recombinant BMid met influenzagenen.
- Generatie van recombinante baulavirussen.
- Expressie van hemagglutinine en neuraminidase in insectencellen.
- Zuivering van eiwitten met behulp van affiniteitschromatografie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle expressie en zuivering van influenza-oppervlakteglycoproteïnen.
- Karakterisering bevestigde de kwaliteit en functionaliteit van de eiwitten.
- De eiwitten werden effectief gebruikt om immuunresponsen te bestuderen.
- De methode kan worden aangepast voor andere virale of cellulaire eiwitten.
Conclusies
- De beschreven methode is effectief voor het produceren van functionele influenza-antigenen.
- Het biedt een basis voor verdere immunologische studies.
- Deze aanpak kan worden toegepast op diverse oppervlakte-eiwitten buiten influenza.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Recombinant influenza-hemagglutinine- en neuraminidase-eiwitten zijn cruciale reagentia voor immunologische assays, vaccinstandaardisatie en antivirale screening. Het baculovirus-expressiesysteem maakt de productie mogelijk van correct gevouwen, geglycosyleerde antigenen die hun biologische functie behouden, wat bijdraagt aan betrouwbare targetvalidatie en lead-identificatie bij influenza-therapeutica. Deze aanpak vermindert de afhankelijkheid van preparaten met het volledige virus en versnelt de preklinische risicoreductie van antilichaamkandidaten en kleine-molecuulremmers.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door correct gevouwen HA- en NA-antigenen te leveren voor antilichaambinding en epitope mapping-studies.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie via assays die hemagglutinatie-inhibitie en neuraminidase-enzymatische activiteit meten.
- Voorspellende waarde: Faciliteert portfolio-triage door reagentia te genereren om de kruisreactiviteit en neutralisatiebreedte van monoklonale antilichamen te beoordelen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Produceert gestandaardiseerde antigenen voor ELISA- en ELISPOT-assays om immuunresponsen tegen influenza-oppervlakteglycoproteïnen te kwantificeren.
- Operationele waarde: Maakt high-throughput screening van kleinline-inhibitors mogelijk met behulp van recombinant neuraminidase in enzymatische activiteitsassays.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt grootschalige eiwitproductie voor de levering van reagentia in workflows voor antilichaamontdekking en vaccinstandaardisatie.
Translationeel & preklinisch onderzoek
- Translationele continuïteit: Levert ziekterelateerde antigenen voor de preklinische evaluatie van vaccinkandidaten en therapeutische antilichamen in diermodellen.
- Mechanische risicoreductie: Bevestigt de correcte vouwing en glycosylering van HA, waardoor het aantal fout-negatieven in immunologische read-outs wordt verminderd.
- Afstemming van preklinische modellen: Maakt een consistente antigenvoorziening mogelijk over de discovery- en preklinische fasen voor het profileren van de immuunrespons.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie via lead-identificatie naar preklinische evaluatie, waarbij recombinante antigenen worden geleverd die immunologische profilering en studies naar het werkingsmechanisme ondersteunen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door functionele HA- en NA-eiwitten te leveren voor immuuninterferentie- en receptorbindingsassays.
- Screening: Maakt assays gereed door middel van gezuiverde, actieve neuraminidase voor antivirale sensitiviteitsscreening en hemagglutinine voor antilichaamcapture-assays.
- Analytics: Genereert kwantitatieve resultaten, zoals ELISA-absorbentie en hemagglutinatietiters, om immuunresponsen onder verschillende condities te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Zorgt voor preklinische continuïteit door het leveren van antigenen die worden gebruikt in diermodelstudies naar vaccinefficiëntie en antilichaambescherming.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor de expressie van influenza- en andere virale oppervlakte-eiwitten over meerdere projecten en seizoenen heen.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in antigeniciteitsbeoordelingen door correct gevouwen, posttranslationeel gemodificeerde influenzeglycoproteïnen te leveren.
- Operationele waarde: Waarborgt de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van antigenproductie met behulp van insectencelsystemen met gedefinieerde purificatieprotocollen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen bij de optimalisatie van antilichaam-leads door mechanistische ambiguïteit in bindings- en neutralisatiedata te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt een risico-gecorrigeerde voortgang van vaccin- en therapeutische kandidaten mogelijk via een gestandaardiseerde antigenvoorziening voor crossfunctionele teams.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in moleculaire klonering, de generatie van baculovirussen en insectencultuurtechnieken.
- Afhankelijk van toegang tot transfectiereagentia, nikkel-affiniteitschromatografiesystemen en centrifugatieapparatuur voor eiwitzuivering.
- Standaardisatie tussen teams is noodzakelijk voor een consistente eiwitopbrengst, zuiverheid en functionele activiteitstesten.
- Overwegingen voor aanpassing omvatten het optimaliseren van de multipliciteit van infectie en het oogstmoment voor verschillende influenzastammen of eiwitdoelen.
- Praktische beperkingen omvatten variabele expressieniveaus tussen stammen en de noodzaak van functionele validatie verder dan SDS-PAGE en Western blot.
